一种向细胞中导入核酸的方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，更具体地涉及一种向真核细胞中导入核酸的方法。

背景技术：

基于真核生物培养细胞的研究是现代生物学的基础。真核生物培养细胞不仅拥有完整的复制和基因表达机器，信号通路以及代谢途径，而且可以在很大程度上避免生物体的高度复杂性问题，因此在对真核生物进行研究之前通常要先将真核生物培养细胞作为研究的模型体系。

将核酸(dna、rna)导入真核生物(包括哺乳动物、植物、昆虫等)培养细胞是分子生物学一个关键技术，通过这种技术，人类能够在真核生物培养细胞中进行克隆化基因的表达并且很容易对表达量进行定量，可以分析蛋白质-蛋白质及蛋白质-核酸相互作用。通过将反义dna，sirna(小干扰rna)导入真核生物培养细胞也可以屏蔽(knock-out)或降低(knock-down)某些基因的表达。更广泛意义上，核酸导入可以对核酸复制、基因表达、信号转导和代谢等几乎所有的细胞内活动进行研究与调控。这类工作有着极其重大的意义，在诸如生产制备活性蛋白，研究表达蛋白的结构和生化特性，研究基因表达的调控机理等方面已经发挥了巨大的作用。可以认为，核酸导入真核生物培养细胞技术是整个分子生物学的核心技术之一。

目前研究者已经发展了多种核酸导入技术，最常见的有磷酸钙沉淀法或脂质体介导法，但是在实际应用中都有其缺陷处。在磷酸钙沉淀法中，磷酸钙-核酸复合物沉淀能够粘附到细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。该方法中沉淀颗粒的大小和质量对结果至关重要，受各种外部条件影响严重，重复性很差。脂质体介导法可以用中性脂质(lipid)利用脂质膜包裹核酸，借助脂质膜将核酸导入细胞膜内或使用带正电阳离子脂质体(cationicliposomes)，它可以和带负电的核酸形成核酸-阳离子脂质体复合物，吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入培养的细胞。该方法对细胞有较大毒性，对不同的细胞产 生的效果不稳定。其它的方法还有电转化法，显微注射法，基因枪法等，但这几种方法都需要昂贵的设备和相对复杂的技术，不能大范围推广。

因此，本领域迫切需要开发一种对细胞影响小，并可以快速、简单、高效地将核酸导入细胞内的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速、简单、高效地将核酸导入细胞内的方法

在本发明的第一方面，提供了一种体外的、将外源核酸导入细胞的方法，包括步骤：

(a)提供外源核酸和待转染的细胞；

(b)在酸性ph条件下，将所述细胞与所述外源核酸进行接触，从而将一部分所述外源核酸导入所述细胞。

在另一优选例中，所述的ph条件为ph2.5-6.0，较佳地2.8-5.5，更佳地2.9-4.5，最佳地3.0-4.0。

在另一优选例中，在步骤(b)中，用酸进行调节，从而得到所述的酸性ph条件。

在另一优选例中，所述的酸包括有机酸、无机酸、或其组合。

在另一优选例中，所述的酸选自下组：盐酸、磷酸、硫酸、或其组合。

在另一优选例中，所述细胞与所述外源核酸的接触时间为0.5分钟-24小时，较佳地为1分钟-6小时，更佳地5分钟-2小时，最佳地为0.25-1小时。

在另一优选例中，所述细胞与所述外源核酸的接触温度为4-50℃，较佳地15-45℃，更佳地25-40℃，最佳地35-39℃。

在另一优选例中，所述的外源核酸选自下组：dna、rna、和dna/rna杂合核酸。

在另一优选例中，所述的外源核酸选自下组：小rna分子、和质粒。

在另一优选例中，所述的小rna分子选自下组：sirna、mirna、和shrna。

在另一优选例中，所述的外源核酸包括单链核酸和双链核酸。

在另一优选例中，所述的外源核酸的长度为10-8000bp，较佳地15-5000bp，更佳地18-1000bp，最佳地20-100bp。

在另一优选例中，所述的外源核酸的浓度为0.1-1000pmol/ml，较佳地0.5-200pmol/ml，更佳地1-100pmol/ml，最佳地10-50pmol/ml。

在另一优选例中，所述的细胞包括原核细胞和真核细胞。

在另一优选例中，所述的细胞为哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述的细胞为体细胞、多能干细胞、和/或生殖细胞。

在另一优选例中，所述的方法为非治疗非诊断方法。

在本发明的第二方面，提供了一种体外的将外源核酸导入细胞的转染体系，包括：

(i)水性体系，所述的水性体系具有酸性ph；

(ii)外源核酸；和

(iii)待转染的细胞。

在本发明的第三方面，提供了一种体外的、将外源核酸导入细胞的方法，包括步骤：

(a)提供外源核酸和待转染的细胞；

(b1)将所述细胞在酸性ph条件下处理，从而获得经酸化处理的细胞；

(b2)将所述经酸化处理的细胞与所述外源核酸进行接触，从而将一部分所述外源核酸导入所述细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了不同ph处理的野生型293t细胞内osa-156a相对含量。

图2显示了lipofectamine^tm2000与酸诱导转染famsirna荧光结果示意图。

图3显示了两种ph培养基转入hepg2细胞内pcmv-sport-β-gal质粒后转染 比例的相对值示意图。

图4显示了盐酸、磷酸、硫酸处理细胞的转化效率柱形图。

图5显示了不同ph值处理细胞的转化效率柱形图。

图6显示了不同核酸转染浓度的转化效率柱形图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了一种快速、简单、高效地将核酸导入细胞内的方法。实验表明，通过调整真核细胞培养环境为酸性，可以使核酸物质更高效的进入真核细胞中。本发明的方法操作便捷、高效，无需加入外源载体，并且对细胞的毒性小、转染率高、导入的核酸分子也更稳定。在此基础上，完成了本发明。

术语

小核糖核酸(小rna)

在本发明中，术语“小核糖核酸(小rna)”指长度大小为二十几个核苷酸的小片段rna；根据stevenbuckingham于2003年5月提出的被广泛认同的分类方法，小rna(smallrnas)是指非编码rna中除转录rna(包含核糖体rna和转移rna)外的部分，包括微小rna(micrornas)、小的干涉rna(shortinterferencernas,sirna)、小核仁rna(snorna)和小核rna(snrna)等。

其中，微小核糖核酸(microrna,mirna)是一类长约19-23个核苷酸的单链小核糖核酸分子，位于基因组非编码区，进化上高度保守，可以通过抑制靶基因的翻译过程对基因表达进行调节，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。现有研究还证实，植物性mirna还可以通过摄食进入动物体内，并参与调控活动。

小干扰核糖核酸(smallinterferingrna，sirna)是一类由20多个核苷酸组成的双链rna分子，可以通过特异性降解靶基因的信使核糖核酸(messengerrna，mrna)起到沉默基因表达的作用。这一过程被称为rna干扰(rnainterference，rnai)。rna干扰是基因转录后调控的一种方式。sirna可以对其靶基因进行特异性识别，并能招募被称为沉默复合体(rnainducedsilencingcomplex，risc)的蛋白质复合体。risc包含核糖核酸酶等，可以通 过靶向切割同源性mrna的方式，特异、高效地抑制基因的表达。由于使用rna干扰技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于生物医学实验研究及各种疾病的治疗领域。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的方法通过调整细胞培养环境为酸性，提高了核酸物质转染细胞的效率。

(b)本发明的方法毒性小、转染率高，导入的核酸分子稳定性高。

(c)本发明的方法操作便捷、高效，大大简化了实验室操作的时间和步骤。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

向野生型293t细胞中导入osa-mirna156a

在本实施例中，实验方法如下：

1)pdl包被

配制250ml0.01％的多聚赖氨酸：

容器及操作设备灭菌，多聚赖氨酸购自sigma公司。

用移液管将少量pbs加到多聚赖氨酸的小塑料瓶中，然后将溶解的多聚赖氨酸加到200ml左右pbs中。

最后加pbs达250ml，过滤除菌分装于小瓶中，存于4℃备用，长期应保存于-20℃。

2)铺板

使用12孔板，将配制好的0.01％的多聚赖氨酸加入每一孔中，每孔3-4滴，全部加完后将12孔板盖好，置入37℃，5％co2培养箱中孵育2-4h。

孵育结束后，取出12孔板，用吸管将多聚赖氨酸吸出。换吸管，加pbs，， 每孔内3-4滴，冲洗三次。重复上述步骤三次。

12孔板放于培养箱待用。

3)细胞培养

向2个12孔板中铺入293t细胞

培养条件：dmem培养液(10％fbs,1％双抗)，37℃，5％co2培养24h。

4)酸性培养液的配制

首先配制实验中使用的dmem培养液(2％fbs,1％双抗)，并测得其ph7.65，后用盐酸将该培养液调到ph值3.15备用。

5)核酸的转入

转入的核酸选用外源合成的水稻单链microrna，osa-mir156a(吉玛公司合成，序列ugacagaagagagugagcac(seqidno.:1))，水稻osa-mir156a与转入的人源293t细胞差异性大，可以有效避免动物细胞中自有microrna的干扰，降低实验结果中产生误差的可能性。

分别向ph7.65和ph3.15的培养液中加入osa-mir156a，终浓度为40pmol/ml。

从培养箱取出铺有293t细胞的12孔板，撤去原有培液，在2个12孔板中分别加入上述加有外源mirna的两种ph值的培养液，37℃孵育0.5h。

上述孵育期间，配制rnase消化液：向dmem培养液(2％fbs，1％双抗)中加入rnasea(购自thermo)，体积比例为2μl/ml，即>100u/ml。

上述孵育时间结束后，撤去加有外源mirna的两种ph值的培养液，pbs洗一遍，加入已配好的rnase消化液，37℃孵育1h，撤去后pbs洗三遍。

用triregent(购自sigma)裂解细胞，提取总rna，方法如下：

室温裂解5min；加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡，室温静置5min；16000g、4℃离心15min；将上清液小心吸出，加入2倍体积的异丙醇，混匀，-20℃静置1h或过夜；16000g，4℃，离心15min；弃去上清，加入1ml75％的乙醇(depc水配制)清洗沉淀，16000g，4℃，离心15min；倒掉上清，待沉淀干燥后，加 入适量的depc水溶解沉淀；计算od260/od280以鉴定总rna浓度和纯度。

6)结果的检测

利用qrt-pcr技术定量检测细胞中的mirna含量：

实时荧光定量pcr技术，是在pcr的反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累从而实时监测整个pcr进程。鉴于mirna21bp的长度，针对每一mirna均设计一个含相同茎环结构(stem-loopstructure)的基因特异性反向引物，逆转得到特异性的cdna，最后再进行pcr反应。

将上述提取好的rna和其它反应所需试剂配成逆转录反应体系，按照如下条件进行反应，逆转录反应条件：

步骤1：16℃30min

步骤2：42℃30min

步骤3：85℃5min

步骤4：4℃forever

按照如上反应获得相应的cdna后，再将其和其它反应所需试剂配成pcr反应体系，按照如下条件进行反应，获取荧光信号值，实时荧光定量pcr反应条件：

步骤1：95℃5min

步骤2：95℃15s

步骤3：60℃1min

步骤2-步骤3：50个循环

数据的处理使用相对比较法，也被认为是δδct法。ct设为反应达到域值时的循环数，而δct＝ct样品-ct内参。酸处理的外源microrna相对于对照野生型植株的表达量可以用方程2^-δct表示。

结果如下：

图1显示了两种ph培养基转入细胞内osa-mir156a的相对值，其中ph7.65对照组的相对值为1，结果显示ph3.15组外源microrna转化后细胞中外源microrna含量显著高于ph7.65对照组。

实施例2

通过lipofectamine^tm2000与酸诱导转染famsirna

在本实施例中，实验方法如下：

1)lipofectamine^tm2000转染

lipofectamine^tm2000购自invitrogen，famsirna购自吉玛公司，famsirna带有荧光基团，转染后可通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪进行检测。操作步骤按照说明书进行，大致步骤如下，

转染前一天接种细胞至12孔板，每孔加入含10％小牛血清的dmem培养基(不含双抗)400μl，转染时细胞密度应达到90％。

转染前4-6小时更换无血清的培养基(opti-memι)，培养4-6小时后，用lipofectamine^tm2000将sirna转染至细胞，具体步骤入下：

把100pmol的sirna稀释到45μl的opti-memι中，轻轻混匀。

轻轻混匀lipofectamine^tm2000，然后取1μl稀释到49μl的opti-memι中，轻轻混匀，室温温育5分钟。

把稀释的sirna与lipofectamine^tm2000轻轻混匀，室温孵育20分钟，形成复合物。

每孔加入100μl的复合物，前后左右平移培养板使复合物与细胞混匀。

转染后4～6小时(可适当延长此时间)换成含血清的培养液。

2)酸诱导转染famsirna

酸诱导转染famsirna的方法与实施例1所述方法相同。

3)转染效率的检测

fam是一种绿色荧光基团，有蓝光激发，激发波长480nm，发射波长520nm。

lipofectamine^tm2000转染6小时后可以检测，检测前的细胞处理过程需要避光。检测时，可先使光路对准没有转染fmasirna的孔，调好焦距打开激发光。观察时间不宜过长，以避免荧光被猝灭。

成功转染的细胞可见fam绿色荧光，分散在细胞质中。

结果如下：

图2是lipofectamine^tm2000与酸诱导转染famsirna荧光结果示意图，可见二者转染效率相当，说明酸处理组同样具备高效转染sirna的能力。

实施例3

向hepg2细胞中导入pcmv-sport-β-gal质粒

pdl包被、铺板等程序与实施例1所述方法相同，导入的pcmv-sport-β-gal质粒购自lifetechnologies。

实验方法如下：

1)细胞培养

向2个12孔板中铺入hepg2细胞

培养条件：dmem培养液(10％fbs,1％双抗)，37℃，5％co2培养24h。

2)酸性培养液的配制

首先配制实验中使用的dmem培养液(2％fbs,1％双抗)，并测得其ph7.65，后用盐酸将该培养液调到ph值3.15备用。

3)核酸的转入

转入的核酸选用pcmv-sport-β-gal质粒，pcmv-sport-β-gal是一种用于检测转染效率的载体，此载体携带的大肠杆菌β葡萄糖醛酸酶基因位于驱动哺乳动物细胞高水平转录的cmv(巨细胞病毒)启动子后面，β葡萄糖醛酸酶序列下游的sv40多聚腺苷化信号指导真核细胞mrna的正确加工。

分别向ph7.65和ph3的培养液中加入pcmv-sport-β-gal质粒，终浓度为40pmol/ml。

从培养箱取出铺有hepg2细胞的12孔板，撤去原有培液，在2个12孔板中分别加入上述加有pcmv-sport-β-gal质粒的两种ph值的培养液，37℃孵育0.5h。

上述孵育时间结束后，撤去加有pcmv-sport-β-gal质粒的两种ph值的培养液，pbs洗一遍，加入已配好的dnase消化液，37℃孵育1h，撤去后pbs洗三遍。

4)结果的检测

使用单层细胞组化染色鉴定β-葡萄糖醛酸酶，测定β-葡萄糖醛酸酶方法如下：

试剂：

磷酸盐缓冲液

1mg/mlx-gal

细胞固定剂：2％(v/v)甲醛、0.2％(v/v)戊二醛、1×磷酸盐缓冲液

组化染色：5mmol/l铁氰化钾、5mmol/l亚铁氰化钾、2mmol/lmgcl2、1×磷酸盐缓冲液

染色液避光4℃保存，细胞染色前迅速加入x-gal。

方法

1.室温下用2-3ml磷酸盐缓冲液洗涤转染细胞两次。

2.加入5ml细胞固定液。

3.用磷酸盐缓冲液洗涤细胞一次。

4.加入3-5ml组化染色液。

5.37℃孵育细胞14-24h。

6.用磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞若干次。

7.用少量磷酸盐缓冲液覆盖细胞，光学显微镜下检查。

表达了β-葡萄糖醛酸酶载体的细胞成亮蓝色，根据染色与未被染色的细胞相对数目算出转染比例。

结果如下：

图3显示了两种ph培养基转入hepg2细胞内pcmv-sport-β-gal质粒后转染比例的相对值，其中ph7.65对照组的相对值为100％，结果显示ph3组外源质粒转化后细胞中外源质粒含量相对高于ph7.65对照组，酸处理的方法可对hepg2细胞产生作用。

实施例4

不同酸对转化效率的影响

实验方法与实施例1所述方法相同，导入核酸为pcmv-sport-β-gal质粒，以鉴定转化效率，在试验过程中分别使用盐酸、磷酸和硫酸调节培养基ph值到3.15，其它参数不变，转染结束后根据实施例3的方法鉴定β-葡萄糖醛酸酶活性以确定各组转化效率，根据染色与未被染色的细胞相对数目算出转染比例。

结果如图4所示，图4显示了盐酸、磷酸、硫酸转化效率的柱形图，可知三种酸均可以完成转化并有较高的转化效率，三种酸的转化率无显著差别，说明酸性条件是本发明方法的关键，酸中的阴离子对转化率无显著影响。三组实验中，盐酸的转化效率最高，磷酸次之，硫酸再次。

实施例5

不同ph对转化效率的影响

实验方法与实施例1所述方法相同，导入核酸为pcmv-sport-β-gal质粒，以鉴定转化效率，在试验过程中分别调节培养基ph值到3、3.15、3.3、3.45，其它参数不变，转染结束后根据实施例3的方法鉴定β-葡萄糖醛酸酶活性以确定各组转化效率，根据染色与未被染色的细胞相对数目算出转染比例。

结果如图5所示，图5显示了ph值分别为3、3.15、3.3、3.45的转化效率柱形图，可知在四种不同的ph值下均可以完成转化并有较高的转化效率，其中ph值为3.15时转化效率相对最高。结果表明，本发明方法对酸性ph条件没有严格要求，在一个较宽的酸性ph条件下，均具有较高的转化率。

实施例6

不同转染浓度对转化效率的影响

实验方法与实施例1所述方法相同，导入核酸为pcmv-sport-β-gal质粒，以鉴定转化效率，在试验过程中分别调节转染质粒的终浓度到35、40、45pmol/ml，其它参数不变，转染结束后根据实施例3的方法鉴定β-葡萄糖醛 酸酶活性以确定各组转化效率，根据染色与未被染色的细胞相对数目算出转染比例。

结果如图6所示，图6显示了转染质粒的终浓度为35、40、45pmol/ml时的转化效率柱形图，可知在三种不同核酸浓度下均可完成转化并有较高的转化效率，其中核酸浓度为40pmol/ml时转化效率最高。结果表明，本发明方法对核酸浓度也没有严格要求，在较低的核酸浓度下即可达到较高的转化率。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。