一种调控酪酸菌发酵效率的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种调控酪酸菌发酵效率的方法。

背景技术：

酪酸菌(丁酸梭菌，clostridiumbutyricum)作为人用或动物新型益生菌具有调整肠道菌群平衡、增强免疫，预防肿瘤发生等重要功能。酪酸菌的营养需求对其生长影响显著，常用的补料氮源是蛋白胨、酵母膏、豆粕、豆粉水解液、鱼粉等，如：对比文献1(采用分批补料发酵法制备酪酸菌活菌制剂的方法，发明专利cn201110287802.1，2011)公开了酪酸菌发酵过程补入10-20％的葡萄糖(碳源)和5-10％的豆粉水解液(氮源)的方法；对比文献2(一种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法，发明专利cn201210135950.6，2012)公开了一种连续发酵生产酪酸菌的方法，其中补入的氮源是6-8％的豆粉水解液等。

对比文献出于酪酸菌对营养需求的考虑以及有机氮源成分对酪酸菌生长代谢影响的复杂性、不确定性和未知性，采用了葡萄糖和有机氮源(豆粉水解液)来笼统的满足酪酸菌的营养需求。但是，这些有机氮源成分复杂、用量较大，使得生产成本较高，而且这些有机氮源代谢中的何种成分能促进酪酸菌的生长和代谢未知，加之每批次豆粉水解液等有机氮源中有效成分的含量不固定，不利于酪酸菌发酵效率的精确调控。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种调控酪酸菌发酵效率的方法，解决了有机氮源成分复杂、用量较大，使得发酵过程调控成本较高，而且有机氮源中有效成分的含量不固定，不利于酪酸菌发酵效率精确调控的问题。

本发明提供的一种调控酪酸菌发酵效率的方法，包括制备培养基阶段、制备酪酸菌种子液阶段和发酵培养阶段，其特征在于，发酵培养阶段中，在酪酸菌发酵2h之内流加无菌、无氧的浓度为10g/l的甲酸钠溶液，直至发酵液中甲酸钠的终浓度为0.0625-0.18g/l。

优选的，所述发酵培养阶段中，在酪酸菌发酵2h之内流加无菌、无氧的浓度为10g/l的甲酸钠溶液，直至发酵液中甲酸钠的终浓度为0.125g/l。

优选的，发酵培养阶段中，采用的发酵罐为100l的发酵罐，装料体积为60l，10g/l的甲酸钠溶液的流加速度为188-540ml/h。

优选的，所述酪酸菌为丁酸梭状芽孢杆菌hbut-01，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为cctccno：m2016628，保藏日期为2016年11月9日。

与现有技术相比本发明具有如下优点和显著的进步：

(1)将甲酸钠分子作为酪酸菌生长代谢的调控因子来使用，机理清楚、成分简单、原料易购、使用浓度很低(优选浓度只有0.125g/l)，几乎不额外增加生产成本，实际操作可控性高，适用于大规模的酪酸菌发酵生产；

(2)甲酸钠分子的添加促进了酪酸菌的发酵生长，放罐时酪酸菌活细胞数提高了15.6-30.5％，产生了极好的技术效果，较现有技术具有明显的提升。

(3)不同于好养微生物的能量供给系统，酪酸菌发酵生长是典型的厌氧过程，需要增大碳代谢流向乙酰coa的效率才能使细胞生长所需能量的供给较为充分。以甲酸钠分子作为调控因子，能提高细胞同化co2生成乙酰基团的效率，准确调控酪酸菌细胞代谢，促进细胞跨膜na/h⁺梯度的稳定性，使细胞能量供给效率稳定，细胞活性得以维持。

生物材料保藏信息说明

1、丁酸梭状芽孢杆菌hbut-01，已于2016年11月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2016628，中国武汉武汉大学，邮编430072，分类命名为丁酸梭状芽孢杆菌clostridiumbutyricum。

附图说明

图1是丁酸梭状芽孢杆菌hbut-01的新鲜斜面菌种显微镜(1000x)观察照片；

图2是丁酸梭状芽孢杆菌hbut-01的发酵培养中期菌种显微镜(1000x)观察照片。

具体实施方式

下面对发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

下述酪酸菌(clostridiumbutyricum)为丁酸梭状芽孢杆菌hbut-01。

丁酸梭状芽孢杆菌hbut-01的培养基：胰蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，葡萄糖10g/l，酵母浸粉3g/l，培养条件为：ph7.2，温度37℃。

丁酸梭状芽孢杆菌hbut-01的显微镜(1000x)观察照片如图1和图2所示，图1是丁酸梭状芽孢杆菌hbut-01的新鲜斜面菌种显微镜(1000x)观察照片，呈杆状分布，图2是丁酸梭状芽孢杆菌hbut-01的发酵培养中期菌种显微镜(1000x)观察照片呈梭杆状分布，其16srrna基因序列如下：

acgacatgacatcgtcagtattgactgcagacgaagcttgatatcgaattcgcgtgtcgcccttgagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgagcgatgaagctccttcgggagtggattagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctcatagaggggaatagcctttcgaaaggaagattaataccgcataagattgtagtaccgcatggtacagcaattaaaggagtaatccgctatgagatggacccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggggaaaccctgatgcagccacgccgcgtgagtgatgacggtcttcggattgtaaagctctgtctttagggacgataatgacggtacctaaggaggaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttactgggcgtaaagggagcgtaggtggatatttaagtgggatgtgaaatacccgggcttaacctgggtgctgcattccaaactggatatctagagtgcaggagaggaaaggagaattcctagtgtagcggtgaaatgcgtagagattaggaagaataccagtggcgaaggcgcctttctggactgtaactgacactgaggctcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatactaggtgtaggggttgtcatgacctctgtgccgccgctaacgcattaagtattccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctagacttgacatctcctgaattactctgtaatggaggaagccacttcggtggcaggaagacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattgttagttgctaccatttagttgagcactctagcgagactgcctgggttaaccgggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtctagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaatgagatgcaacctcgcgagagtgagcaaaactataaaaccgatctcagttcggattgtaggctgaaactcgcctacatgaagctggagttgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagttggcaatacccaaagttcgtgagctaaccgcaaggaggcagcgacctaaggtagggtcagcgattggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaaagggcgacacgcgaattcgatatcaagcttcaggtctgcagcgagcctcagacactggccgtcgt

将测得的序列于ncbi中http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi进行同源性搜索比对，并使用blastn2.2.31系统在genbank中进行同源性搜索，发现序列相似度最高的为clostridiumbutyricumdsm10702菌株，序列相似度为100％，表明该菌株为丁酸梭状芽孢杆菌。

本发明提供的一种调控酪酸菌发酵效率的方法，具体包括以下步骤：

步骤1，制备培养基

制备液体培养基，每升种子液培养基按以下配方制备：葡萄糖40g/l，蛋白胨50g/l，酵母粉15g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，七水硫酸镁0.75g/l，轻质碳酸钙1g/l，一水硫酸锰0.02g/l，余量为水，ph＝7.3，常规方式除氧、灭菌；

制备厌氧管斜面，每升厌氧管斜面培养基按照以下配方制备：1l种子液培养基中添加20g琼脂。

步骤2，制备酪酸菌种子液

按无菌、无氧操作要求，从酪酸菌种冻干管接出细胞至新制备的厌氧管斜面。37℃培养12h后，按无菌、无氧操作要求，加入10ml无菌、无氧水，得到厌氧管种子液；

准备若干120ml的厌氧瓶，每个厌氧瓶内装入60ml种子液培养基，将厌氧管种子液接入厌氧瓶中，其中，厌氧管种子液与厌氧瓶内种子液培养基的体积比例为1:100，37℃、100r/min摇床培养12h，得到若干厌氧瓶种子液。按无菌、无氧操作要求，将所有的厌氧瓶种子液进行合瓶操作，得到酪酸菌种子液。

步骤3，发酵培养

步骤3.1，接种

装有60l培养基的发酵罐(100l)灭菌、氮气置换除氧后(氮气置换除氧按常规操作即可)，将酪酸菌种子液火焰保护接入发酵罐内，其中，酪酸菌种子液与发酵罐内种子液培养基的体积比例为1:100；

步骤3.2，培养

按如下条件进行发酵培养：发酵温度为37℃；发酵罐搅拌转速为100r/min；在酪酸菌发酵2h之内，采用通氮气进行厌氧保护，氮气流量控制为0.1vvm；罐压控制为0.03-0.04mpa；酪酸菌发酵2h后停止通氮气；酪酸菌发酵培养12-14h后放罐。

此外，在酪酸菌发酵时2h之内流加无菌、无氧的浓度为10g/l的甲酸钠溶液，直至发酵液中甲酸钠的终浓度为0.0625-0.18g/l。

优选的，本发明的一种调控酪酸菌发酵效率的方法，包括以下实施例

实施例1

一种调控酪酸菌发酵效率的方法，具体包括以下步骤：

步骤1，培养基的制备

制备液体培养基，每升种子液培养基按以下配方制备：葡萄糖40g/l，蛋白胨50g/l，酵母粉15g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，七水硫酸镁0.75g/l，轻质碳酸钙1g/l，一水硫酸锰0.02g/l，余量为水，ph＝7.3，常规方式除氧、灭菌；

制备厌氧管斜面，每升厌氧管斜面培养基按照以下配方制备：1l种子液培养基中添加20g琼脂。

步骤2，制备酪酸菌种子液

按无菌、无氧操作要求，从酪酸菌种冻干管接出细胞至新制备的厌氧管斜面。37℃培养12h后，按无菌、无氧操作要求，加入10ml无菌、无氧水，得到厌氧管种子液；

准备若干120ml的厌氧瓶，每个厌氧瓶内装入60ml种子液培养基，将厌氧管种子液接入厌氧瓶中，其中，厌氧管种子液与厌氧瓶内种子液培养基的体积比例为1:100，37℃、100r/min摇床培养12h，得到若干厌氧瓶种子液。按无菌、无氧操作要求，将所有的厌氧瓶种子液进行合瓶操作，得到酪酸菌种子液。

步骤3，发酵培养

步骤3.1，接种

装有培养基的发酵罐(100l)灭菌、氮气置换除氧后(氮气置换除氧按常规操作即可)，将酪酸菌种子液火焰保护接入发酵罐内，其中，酪酸菌种子液与发酵罐内种子液培养基的体积比例为1:100；

步骤3.2，培养

按如下条件进行发酵培养：发酵温度为37℃；发酵罐搅拌转速为100r/min；罐压控制为0.03-0.04mpa；在酪酸菌发酵2h之内，采用氮气厌氧保护，酪酸菌发酵后停止通氮气，酪酸菌发酵培养12-14h后放罐，其中，氮气流量控制为0.1vvm；

此外，在酪酸菌发酵2h之内流加无菌、无氧的浓度为10g/l的甲酸钠溶液，流加速度为188ml/h，直至发酵液中甲酸钠的终浓度为0.0625g/l。

按上述方式厌氧发酵14h，细胞数(以hungate滚管计数法进行菌落cfu计数)为7.32×10⁸cfu/ml。

实施例2

一种调控酪酸菌发酵效率的方法，具体包括以下步骤：

步骤1，培养基的制备

同实施例1

步骤2，制备酪酸菌种子液

同实施例1

步骤3，发酵培养

除添加甲酸钠溶液的步骤之外，发酵培养其余条件同实施例1。

其中，甲酸钠溶液的添加条件如下：

在酪酸菌发酵时2h之内流加无菌、无氧的浓度为10g/l的甲酸钠溶液，流加速度为375ml/h，直至发酵液中甲酸钠的终浓度为0.125g/l。

按上述方式厌氧发酵14h，细胞数(以hungate滚管计数法进行菌落cfu计数)为8.26×10⁸cfu/ml。

实施例3

一种调控酪酸菌发酵效率的方法，具体包括以下步骤：

步骤1，培养基的制备

同实施例1

步骤2，制备酪酸菌种子液

同实施例1

步骤3，发酵培养

除添加甲酸钠溶液的步骤之外，发酵培养其余条件同实施例1。

其中，甲酸钠溶液的添加条件如下：

在酪酸菌发酵时2h之内流加无菌、无氧的浓度为10g/l的甲酸钠溶液，流加速度为540ml/h，直至发酵液中甲酸钠的终浓度为0.18g/l。

按上述方式厌氧发酵14h，细胞数(以hungate滚管计数法进行菌落cfu计数)为8.12×10⁸cfu/ml。

为了验证本发明的效果，我们进行了对照组发酵培养试验，具体步骤如下：

步骤1，培养基的制备

同实施例1

步骤2，制备酪酸菌种子液

同实施例1

步骤3，发酵培养

除不添加甲酸钠溶液之外，发酵培养其余条件同实施例1。

按上述方式厌氧发酵14h，细胞数(以hungate滚管计数法进行菌落cfu计数)为6.33×10⁸cfu/ml。

与对照组相比，实施例1-3的细胞数分别提高了15.6％、30.5％和28％，说明添加甲酸钠溶液后可以促进酪酸菌的发酵生长，有效增加酪酸菌的细胞数量积累。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。