本发明涉及糖基化的草酸脱羧酶及其制备和应用。
背景技术：
：肾结石，其中80％为草酸钙结石，每年给全球数千万的人带来痛苦以及导致数百亿美元的经济损失，在美国，因为肾结石，每年有约500万人次进入急救室，是七大住院治疗疾病之一，每年经济损失50多亿美元，并且，每年以7-11％的速度增长，中国的情况与美国类似；另外，肾结石还是许多现代病(如糖尿病、肥胖症等)的并发症。草酸是双羧酸通过c-c键相联，在生理ph值条件下，其钠、钾盐溶于水，但其钙盐在水中的溶解度低于0.06mm。血液中草酸浓度为1-6μm，远低于草酸钙的饱和度，但是，由于肾通过对水份的重新吸收，肾中浓缩的原尿中的草酸盐浓度上升超过百倍，尿中钙离子浓度一般约是草酸盐浓度5倍，因而肾中的草酸钙浓度达到0.1-0.6mm，超过其饱和度，处于过饱和状态，而处于高度过饱和状态的草酸钙会析出成为固体，即生长结石；尽管生长结石受肾的生理状态、原尿及尿中其它成份的影响，但草酸钙过饱和程度是结石形成与生长的决定性因素。尿中草酸钙过饱和程度与人体血液中的草酸盐来源直接相关。人体血液中的草酸盐来源有两条途经：人体的生理代谢与从食品中吸收。除原发性高草酸尿症患者外，几乎所有的人代谢产生的草酸盐的量是一定的，但从食物中吸收的草酸盐的量却因人而异。结石病人吸收草酸盐的量比正常人高50％以上(r.holmes等,urol.res.,32:311-316,2004)，导致其肾盂及尿道中草酸钙浓度大大高于其饱和度。这类病人在尿检中会发现尿中排出草酸盐的量较正常人高，称高草酸尿症。复发性草酸钙结石患者多为高草酸尿症病人。几乎所有的食品中都含有草酸盐，很多食品中含量还很高，尤其是一些蔬菜与谷类食品。医生常常建议结石病人，通过选择食用低草酸盐食品来降低草酸盐食入量，但是低草酸盐食品品种少，且这样的食品中草酸含量受其生长土壤成份，水份及气候的影响，因而选择食用低草酸盐食品的方法常常不可靠，还会导致营养不良，是没有办法的选择。目前还没有一种真正的肾结石药物与好的治疗方法，只有一些及早发现的小结石(直径或最大尺寸<0.6cm)，可以通过大量饮水，配合运动进行排石治疗外，其它方法如：体外震波碎石，微创手术取石或碎石，及开放手术取石，不仅对身体与肾带来创伤，也存在着很高的复发率且手术费昂贵；对于复发病人反复使用这些方法，最终会导致肾功能衰竭，因而药物治疗与药物防止结石复发变得十分迫切。柠檬酸盐类药物是唯一经临床试验证实对20-90％的结石病人有抑制结石生长的预防型药物，但其主要针对尿酸钙结石，但病人需要长年每日口服6-10克柠檬酸盐，柠檬酸盐改变血液与尿液中盐类组成和酸碱平衡，然而由于服用量大，副作用强，许多人难以承受其副作用而不得不停止治疗。用酶或微生物降低食入胃中的草酸盐来降低其被胃肠吸收，进一步降低肾中的草酸盐浓度，已经得到了人们关注。酶或微生物除能消除生长草酸钙结石的材料，防止草酸钙结石的产生、生长与再发外，酶或微生物法还具有安全、无创伤等优点。其中微生物的方法有口服微生物如多种芽孢杆菌和双歧杆菌的混合物制品(cn00808182.4)与口服一种肠道中寄生的以草酸盐为能源物质的活细菌制剂(美国专利us6699469)。前一种类的微生物能够消耗草酸，但是，在肠道中由于有丰富的碳水化合物，这类菌就不优先消耗草酸，在临床试验被证明没有效果(d.goldfarb等，clin.j.am.soc.nephrol.,2:745-749,2007)；后一种菌尽管只消耗草酸，美国oxthera医药公司完成了两次临床试验，没有观察到其能降低尿草酸，很可能是口服的活菌没有能在肠道定植并有效存活。食物中的草酸盐在进入胃中后，在低ph值胃酸的作用下溶解并释放出来，即而开始被人体吸收，因此降低食品中草酸盐的吸收应该从胃开始。用口服草酸降解酶来降解胃中的草酸，应该更有效，这方面的工作主要有altus医药公司与oxthera公司。altus医药公司将草酸氧化酶(pct/us2006/023115)或草酸脱羧酶(美国专利申请us11/833082)(altus-237,altus公司)制成交联酶晶体后，再将这些晶体制成口服药剂用于降解胃中的草酸盐。altus医药公司专利技术由allena医药公司继承，主要集中在草酸脱羧酶交联酶晶体上。临床试验表明，allena医药公司在严重高尿草酸的病人试验中发现，口服高剂量的酶制剂也只能降低13％的尿草酸。oxthera公司制备了另一种制剂形式的制剂，将草酸脱羧酶与酸不溶聚合物混合，经喷雾干燥而制成微颗粒(oxazyme，oxthera公司)。临床试验表明，oxazyme(oxthera公司)没有降低尿草酸的效果。201610217032.6号中国发明专利申请中公布了一种重组表达生产的草酸脱羧酶，在ph值1.5-7.5条件下有降草酸活力，但是由于是原核系统表达，其表达的草酸降解酶无糖基化修饰，其在低ph值及高ph值下不稳定，对胃蛋白酶的抵抗力较本专利中糖基化的草酸脱羧酶弱，其比活力较本专利的糖基化的草酸脱羧酶也偏低。技术实现要素：针对现有技术中，草酸脱羧酶制剂在低ph值下无活性或不稳定，无法真正实现尿草酸降低的技术缺陷，本发明提供一种糖基化的草酸脱羧酶，可以有效降低尿草酸的含量。本发明的技术方案简述如下：本发明涉及一种糖基化草酸脱羧酶，所述糖基化草酸脱羧酶来源于食用担子菌类,在ph值1.5-7.5环境下均有酶活力，且在ph值1.5-2.0环境下活力大于最适活力的10％，比活力单位大于2u/mg。优选地，所述糖基化草酸脱羧酶在ph值2.0-5.5环境下有酶活力，且活力大于最适活力的30％，比活力大于6u/mg。进一步优选地，所述草酸脱羧酶的酶活力最适ph值环境为2.5-3.0。更进一步地，该草酸脱羧酶在最适ph值范围时，活力单位为20-200u/mg，km值为0.06mm。在一个具体实施例中，本发明所涉及的糖基化草酸脱羧酶来源于田头菇属的食用菌，具体来讲，可以选自茶树菇(agrocybeaegerita)、杨树菇(agrocybecylindracea)、田头菇(agrocybepraecox(pers.)fayod)、杨柳田头菇(agrocybesalicacola)或半圆田头菇(agrocybepediades(fr.)fayod)。在一个具体实施方式中，上述草酸脱羧酶经液体发酵技术诱导生产。在一个具体实施例中，所述糖基化草酸脱羧酶经液体发酵技术诱导生产是指，在菌种经培养2-5天后，加入酸调节ph值至2.0-4.0诱导产酶，继续培养7-10天。本发明还涉及含有上所述糖基化草酸脱羧酶的酶制剂。所述酶制剂为口服制剂。具体地，所述酶制剂为含有上述糖基化草酸脱羧酶的菌粉、饲料添加剂、饲料、食品添加剂、食品、保健品、特医食品或药品。本发明还涉及上述糖基化草酸脱羧酶和草酸脱羧酶制剂在预防和/或治疗高草酸尿症中的应用。本发明还涉及上述糖基化草酸脱羧酶和草酸脱羧酶制剂在预防和/或治疗含草酸钙尿路结石中的应用。本发明实施例所提供草酸脱羧酶在胃肠环境中稳定并且具有很高的活力，在胃肠环境中，对低浓度草酸有非常高的降解效率，且可直接口服，安全无任何毒副作用。本发明实施例提供的糖基化的草酸脱羧酶及相关酶制剂在ph值1.5-7.5环境中稳定并且具有较高的活力，且在最适ph值(ph值2.5-3.0)时,其km值为0.06mm；显著优于现有的枯草芽孢杆菌来源的草酸脱羧酶，稳定性优于大肠杆菌重组表达的草酸脱羧酶。本发明提供的这种糖基化的草酸脱羧酶及其相关酶制剂来自于田头菇属的食用菌，有人类长期服用历史，被证明是无任何毒副作用，安全，可长期服用。附图说明图1：糖基化与无糖基化草酸脱羧酶分子量鉴定(sds-page)，其中，m为蛋白分子量marker；1为无糖基化草酸降解酶；2为糖基化草酸降解酶。图2：糖基化草酸脱羧酶在不同ph值范围的相对活力。图3:糖基化草酸脱羧酶的maldi-tof-ms肽图质谱。图4：糖基化与无糖基化草酸脱羧酶比活力比较。图5:糖基化与无糖基化草酸脱羧酶ph稳定性比较。图6：测试不同来源的草酸脱羧酶降解食物中草酸的能力实验结果图。图7：不同剂量的茶树菇草酸脱羧酶降解食物中草酸的能力实验结果图。具体实施方式现有技术中，对草酸脱羧酶的应用均未取得有实用价值的临床效果，似乎显示，利用草酸脱羧酶降低尿草酸含量的这条技术路线是不可行的。本发明人经过大量实验，惊奇地发现，现有技术中，草酸脱酸酶相应产品药效不理想的主要原因在于，所选用的草酸脱羧酶，是来源于同一种枯草芽孢细菌(bacillussubstilis)的草酸脱羧酶，该酶有两大缺点(酸不耐受性和高的km值)，使之不能在人胃中成活与有效降解低浓度草酸。本发明人意外发现，只要找到能够适应胃肠的酸性环境的草酸脱酸酶，就可以实现有效控制尿草酸含量的效果。本发明人筛选了数千种食用材料及不同部位，涉及植物、微生物、食用菌等，发现田头菇属的草酸脱羧酶具有低ph值活性，可以在胃的酸性环境中降解草酸，但是由于天然田头菇属真菌中的草酸脱羧酶含量非常低，不具有产业化可能性，所以给人们获知其可以在胃的酸性环境中降解草酸造成了障碍。本申请的发明人在提高草酸脱羧酶产量，实现产业化方面做了非常多的尝试，201610217032.6号发明专利申请公开了一种用原核表达系统表达生产草酸脱羧酶的方法，其表达量得到了大幅提升。然而本发明人通过大量试验，找到一种液体培养与诱导方式，能让田头菇属真菌自然表达草酸脱羧酶，并且惊奇的发现，自然表达的草酸脱羧酶与原核系统克隆表达的草酸脱羧酶序列相同，但是更有优势，经过分析发现，是诱导表达的草酸脱羧酶带有糖基化，使其对胃低ph值的抵抗力，对胃蛋白酶的耐受，酶活力提升均有显著优势。也就是说，糖基化的草酸脱羧酶较无糖基化的草酸脱羧酶在治疗高草酸尿症方面更具有优势。本专利申请中所涉及茶树菇草酸脱羧酶的基因和蛋白质序列均与201610217032.6号发明专利申请中所测定茶树菇的基因和蛋白质序列相同，在此引入，本申请不再重复记载。由于胃中酸度很高，分布不均，并且一直变动，ph值一般在1.5与5.5之间，其酸度大小取决于食入其中的食物的量，食品种类，食品与胃酸的混合，及在胃中的停留时间。一般空胃时，其ph值低，食入肉类含量多的食品时，其ph值高，在进食后ph值较高，然后由于胃酸的分泌，ph值逐渐降低，这就要求任何酶类产品及药物必须在ph值1.5-5.5间稳定且具有极高活力。另外，饮食中的草酸大量以钙盐、镁盐形态存在，溶解度不高，导致饮食中的可溶草酸浓度不高，一般在0.05-0.5mm，这就需要草酸脱羧酶对草酸根的亲和力高，即km值要小。枯草芽孢杆菌(bacillussubstilis)的草酸脱羧酶在ph值低于3.0，很不稳定，几秒钟就会变性，永久失去活力，而胃中的ph值经常低于3.0。另外，由于胃酸不断分泌，整个胃中的ph值是不均一的，即使胃中平均ph值在3.0以上，局部仍然有低于ph值3.0的，这是导致该酶效果差的主要原因。另外，该酶与草酸盐的亲和力很差，即使在其理想ph值条件下，km值也有4mm。此外，预防高草酸尿症是一个长期的过程，患者需要长期甚至是终身服用，现有技术中的枯草芽孢杆菌没有被人类长期食用的历史习惯，长期服用枯草芽孢杆菌来源的草酸脱羧酶存在潜在的风险。为了筛选到一种在胃肠环境中稳定并且具有很高的活力，对低浓度草酸有非常高的降解作用的草酸降解酶，且被人类长期食用被证明是无毒无害的含草酸降解酶的材料，本发明人筛选了数千种食用材料及不同部位，涉及植物、微生物、食用菌等，发现食用担子菌类的草酸脱羧酶的酶活及ph值范围与人的胃肠环境相适应，优选的田头菇属的食用菌的酶活在ph值1.5-7.5下均稳定且有较高的活力。通过大量的实验，终于找到了在液体条件下培养担子菌生产足够的草酸脱羧酶，用于测试分析及实际应用。用担子菌生产的的草酸脱羧酶，与大肠杆菌表达的草酸脱羧酶相比是有糖基化的，糖基化的草酸脱羧酶在低ph值下的稳定性显著高于无糖基化的草酸脱羧酶，酶的比活力显著提高，对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性更好。实施例1：本实施例以茶树菇为例阐述糖基化草酸脱羧酶的发酵生产过程，本发明人以杨树菇、田头菇、杨柳田头菇和半圆田头菇进行的实验结论与茶树菇基本相同，除了部分对比结果之外，本申请不再重复记载。以茶树菇为菌种，采用摇瓶培养生产草酸脱羧酶，培养基配方为：酵母粉，4g/l；大豆蛋白胨，3g/l；kh2po4，2g/l；mgso4·7h2o，0.2g/l；cacl2，1g/l；葡萄糖，20g/l；玉米淀粉，10g/l；维生素b110mg/l；ph值5.0-6.0；摇瓶装液量为20-30％，121℃灭菌30分钟(维生素b1为过滤除菌，接种前加入培养基中)。将在pda平板上培养的茶树菇菌丝体，接种至灭菌后的液体培养基中，培养条件为：23-28℃、100rpm-350rpm培养2-5天，加入磷酸调节ph值至2.8-3.2诱导产酶，继续培养7-10天。抽滤收集培养的新鲜菌丝体，经ph值3.0的缓冲液洗涤后，置于干净的陶瓷研钵中，加入液氮研磨成粉状，加入ph值3.0的缓冲液，继续研磨成糊状，15000g离心10分钟，分别取上清液及沉淀部分置于新的容器中，菌丝体沉淀部分经冻干后为含草酸脱羧酶的菌粉，上清液经冻干后为含草酸脱羧酶的酶粉。取上清液用于实施例2的草酸脱羧酶的纯化与鉴定。实施例2：草酸脱羧酶的纯化与鉴定将实施例1方法得到的含草酸脱羧酶的上清液，经qsepharose色谱柱纯化得到纯化后的草酸脱羧酶。具体操作过程如下：将含草酸脱羧酶的上清液，用0.5mnaoh调ph值至6.0，再经15000g高速离心去除沉淀杂质，上清液经50kda超滤膜浓缩；qsepharose色谱柱用25mmnah2po4缓冲液(ph值6.0)平衡5个柱体积(cv)，将浓缩后的草酸脱羧酶液上样到平衡好的qsepharose柱，然后用2cv的平衡缓冲液(25mmnah2po4，ph值6.0)洗去未挂柱的杂蛋白，然后经洗脱缓冲液(洗脱缓冲液a：25mmnah2po4，ph值6.0；洗脱缓冲液b：25mmnah2po4，1mnacl，ph值6.0)梯度洗脱5cv，收集草酸脱羧酶的样品组分。纯化后的糖基化草酸脱羧酶经变性聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳鉴定，分子量为60-80kda。大肠杆菌表达的草酸脱羧酶经变性聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳鉴定，分子量为45-50kda。两种草酸脱羧酶的分子量鉴定结果如图1所示。实施例3草酸脱羧酶活力及酶学性质测定本发明中采用hplc(highperformanceliquidchromatography，高效液相色谱法)方法测定草酸脱羧酶活力。具体操作过程如下：将1.0ml5mm(毫摩尔浓度)草酸盐溶液(其中含25mm柠檬酸盐缓冲液，ph值为3.0)，在37℃预热10分钟后，加入0.01-0.1ml(根据酶浓度确定加入体积)含草酸脱羧酶的溶液或菌粉悬浮液开始反应。反应30分钟后，加入50μl2.5m(摩尔浓度)硫酸使酶失活。迅速离心并取上清液，用hplc测定残留草酸盐浓度。一个酶活力单位(u)定义为在此条件下，每分钟降解1个微摩尔草酸盐所需的酶量。将实施例2中纯化制得的糖基化草酸脱羧酶在ph值3.0下测定酶活力，结果如表1所示。以茶树菇和杨树菇的草酸脱羧酶为例，测试草酸脱羧酶在ph值1.5-7.5下的不同ph值下的相对酶活力，结果(图2)显示其均有活性，且在胃环境(ph值1.5-5.5)下，活力较高。以茶树菇草酸脱羧酶为例，用双倒数法测定草酸脱羧酶的km值，结果显示，km值非常小，以致其测定时波动较大，不同批次，ph在2.5-6.0，测定的km值在0.03-1.0mm之间，且在ph值2.5-3.0时,其km值均值为0.06mm，见表2。表1.不同草酸脱羧酶比活力菌种比活力(u/mg)茶树菇130杨树菇100田头菇20杨柳田头菇200半圆田头菇153表2不同ph值下草酸脱羧酶的km值测定ph值范围km值(mm)2.5-3.00.06±0.033.0-3.50.12±0.043.5-4.00.20±0.034.0-4.50.25±0.084.5-5.00.36±0.135.0-6.00.7±0.30实施例4.糖基化草酸脱羧酶的肽图分析将上述实施例2中纯化的茶树菇的糖基化草酸脱羧酶经tpck处理的胰蛋白酶酶解消化后，做maldi-tof-ms分析，结果如图3所示。表3为相应的质谱分子量表。表3.糖基化草酸脱羧酶肽图质谱分子量表实施例5：糖基化草酸脱羧酶与无糖基化草酸脱羧酶的对比本实施例以茶树菇的草酸脱羧酶为例，进行有糖基化草酸脱羧酶与无糖基化草酸脱羧酶酶学性质的比较。将茶树菇草酸脱羧酶基因依照201610217032.6号发明专利申请的操作方法进行重组生产，并纯化得到无糖基化的草酸脱羧酶，与实施例2中纯化得到的茶树菇的糖基化草酸脱羧酶做酶学性质及稳定性的比较。(1)比活力比较：将大肠杆菌表达的无糖基化的草酸脱羧酶与茶树菇表达的有糖基化的草酸脱羧酶经考马斯亮兰法测定蛋白浓度，并定量到相同的蛋白浓度(0.5mg/ml)，经实施例3方法测定两种草酸脱羧酶在不同ph值缓冲液中的相对比活力。相对比活力是指以糖基化草酸脱羧酶在最适ph值下的比活力定义为100％，其他不同ph值条件下及无糖基化的草酸脱羧酶在不同ph值下的测定的比活力与之比值。结果如图4所示，糖基化的草酸脱羧酶活力显著高于无糖基化的草酸脱羧酶活力(>30％)。(2)稳定性比较：将大肠杆菌重组表达的无糖基化修饰的草酸脱羧酶，和茶树菇表达的糖基化的草酸脱羧酶样品，调整到相同的酶活力浓度，分别加入到ph值1.5，ph值2.0，ph值2.5，ph值3.0，ph值3.5，ph值4.0，ph值4.5，ph值5.0，ph值5.5，ph值6.0，ph值6.5，ph值7.0，ph值7.5，ph值8.0的缓冲液中，37℃孵育30分钟，分别取25μl的样品，加入37℃预热的1.0ml5mm草酸盐溶液反应液(其中含25mm柠檬酸盐缓冲液，ph值为3.0)中，37℃反应30分钟，加入50μl2.5m硫酸使酶失活。迅速离心并取上清液，采用hplc方法测定样品中草酸脱羧酶活力，以未处理的原始样品活力定义为100％，计算样品经不同ph值缓冲液处理后残留的草酸脱羧酶活力，结果如图5所示。结果表明，糖基化的草酸脱羧酶对ph值的稳定性显著优于无糖基化修饰的草酸脱羧酶，尤其显著影响草酸脱羧酶在强酸性(ph值<2.5)或者偏中性或弱碱性(ph值>5.5)下的稳定性。(3)耐蛋白酶活性的比较：将糖基化的草酸脱羧酶与无糖基化的草酸脱羧酶样品分别配制成10u/ml的溶液，然后分别取1ml样品与20ml的含10mg/ml胃蛋白酶的50mm盐酸缓冲液(ph值2.5)混合，37℃下搅拌孵育5分钟，10分钟，20分钟，40分钟，60分钟，在以上时间点取样分析残留的草酸脱羧酶活力，其结果如表4所示。表4.糖基化与无糖基化草酸脱羧酶的胃蛋白酶耐受比较实施例6：草酸脱羧酶对食物中草酸的去除几乎所有的以植物为原材料的食品，饮料，中药制剂以及饲料均含有草酸盐，其中绿叶蔬菜，巧克力，可可，花生及花生制品，黄豆及豆制品，茶叶及含茶饮料，咖啡，各种麦类谷物等中含量很高，草酸脱羧酶可制成食品添加剂或药品与食品一起食入，在胃中降解饮食品中的草酸盐以降低草酸盐被胃肠道吸收。下面具体说明本发明实施例中制备的含草酸脱羧酶的酶粉和食用菌粉的应用。(1)除去茶中的草酸盐茶水中每升含有1-40毫克的草酸盐，其含量取决于茶的种类，产地，浓度与制备方法。取绿茶20克，放入90-95℃热水中泡5分钟后滤去茶叶，待水温降低至50℃以下，调ph值至3.0-4.0，然后加入20活力单位的茶树菇草酸脱羧酶，搅拌反应2h，在不同时间绿茶中草酸盐浓度的检测结果如表5所示。结果表明，加入本发明制得的茶树菇草酸脱羧酶，2h后茶水中的草酸盐几乎被全部除去。此例适合于制造无草酸瓶装茶水，冰茶或茶冲剂等，也适合于除去许多中药制剂中的草酸盐。(2)除去豆制品中的草酸盐干黄豆的草酸盐含量相当高，这也使各种豆制品含有大量的草酸盐，黄豆制品是亚洲人的日常食品，也是蛋白质重要来源，因此，除去豆制品中的草酸盐对食源性高草酸尿症的人群十分有意义。将豆浆的ph值调至3.0-4.0，然后加入本发明实施例制得的草酸脱羧酶，搅拌至草酸盐降低到一定含量，在不同时间豆浆中草酸盐浓度的检测结果如表5所示。降解草酸盐所需的时间与豆浆中的草酸盐含量和加入的酶量有关，如果豆浆每升中含0.1克草酸盐，每10升豆浆加1200单位草酸脱羧酶，需要搅拌处理约2小时。表50分钟10分钟30分钟60分钟120分钟绿茶100％65％27％5％3％红茶100％59％32％6％2％豆浆100％89％67％34％8％实施例7：草酸脱羧酶降尿草酸的动物试验6只比格犬，雄性，体重7-8kg，购买自湖北安陆瑞科森实验动物有限公司，饲养于标准独立犬笼中，适应3-5天后，饲喂配制的无草酸食物(无ox犬粮)，收集24h尿液，测定尿草酸总量，待尿草酸稳定后连续测定5天，取平均值记为低草酸排泄量，然后喂食市售普通食物(普通犬粮)，收集尿液，连续5天测定尿草酸排泄量，取均值记为正常草酸排泄量，然后在喂食市售普通食物的同时，依次喂食1000u不同来源(枯草芽孢杆菌(专利号：201080029636.9)及糖基化草酸脱羧酶(本专利)和无糖基化草酸脱羧酶(专利号：201610217032.6))的草酸脱羧酶(oxdc)样品，每种样品测试期均为5天，收集尿液，测定尿草酸排泄量，取测试期5天尿草酸总量均值记为尿草酸排泄量，测试不同来源的草酸脱羧酶降解食物中草酸的能力，结果如图6所示，1000u枯草芽孢杆菌草酸脱羧酶组使24小时尿草酸排泄量由对照组的256μmol下降至242μmol，无糖基化草酸脱羧酶组下降至185μmol，而糖基化草酸脱羧酶组则使尿草酸下降至171μmol，与无草酸犬粮的24小时尿草酸排泄量(179μmol)基本一致。结果表明，草酸脱羧酶均可以不同程度的降解饮食中的草酸，减少草酸吸收，从而降低尿液中的草酸排泄量。含糖基化草酸脱羧酶的酶粉相较于枯草芽孢杆菌来源的草酸脱羧酶，降草酸效果更好，几乎与无草酸食物饮食的效果一致，可以用来治疗食源性高草酸尿症。6只比格犬，雄性，体重7-8kg，购买自湖北安陆瑞科森实验动物有限公司，饲养于标准独立犬笼中，适应3-5天后，饲喂配制的无草酸食物，收集24h尿液，测定尿草酸总量，待尿草酸稳定后连续测定5天，取平均值记为低草酸排泄量，然后喂食市售普通食物(普通犬粮)，收集尿液，连续5天测定尿草酸排泄量，取均值记为正常草酸排泄量，然后在喂食市售普通食物的同时，分别依次喂食500u，1000u，2000u，3000u的含糖基化草酸脱羧酶的酶粉，每种样品测试期均为5天，收集尿液，测定尿草酸排泄量，测试不同剂量的糖基化草酸脱羧酶降解食物中草酸的能力，结果如图7所示。结果表明，随着喂食糖基化草酸脱羧酶剂量的增加，降解草酸能力逐步加强，当喂食剂量达到2000u以上时，尿草酸的排泄量由对照组的256μmol下降至154μmol，较无草酸食物(179μmol)还要低，表明体内代谢的部分草酸也可以被草酸降解酶降解。因此，糖基化草酸降解酶可以应用于治疗原发性高草酸尿症。当前第1页12