葡萄糖氧化酶突变体的制作方法

文档序号：16645334发布日期：2019-01-16 08:11阅读：274来源：国知局

本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体涉及一种葡萄糖氧化酶突变体及其应用。

背景技术：

葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,e.c.1.1.3.4,god)在有氧条件下能专一性地催化β-d-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶是同型二聚体分子，含有2个黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)结合位点。每个单体含有2个完全不同的区域：一个与部分fad非共价但紧密结合，主要为声折叠；另一个与底物β-d-葡萄糖结合，由4个α-螺旋支撑1个反平行的β-折叠。

葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物和微生物体内。但动植物组织中葡萄糖氧化酶含量有限，而微生物由于具有来源广泛、生长周期短等优点被广泛用作生产葡萄糖氧化酶的来源。但通常天然菌株产葡萄糖氧化酶水平不高，难以直接用来生产葡萄糖氧化酶。一方面我们可以通过菌株诱变、优化菌株的发酵条件等传统方法，获得葡萄糖氧化酶高产菌株；另一方面，通过基因重组等方法获得葡萄糖氧化酶高产菌株，采用重组工程菌获得葡萄糖氧化酶。

葡萄糖氧化酶在工业生产中有诸多用途，在食品工业中，能够除氧保鲜，去葡萄糖，经过精制的葡萄糖氧化酶，可以用于医疗诊断,如比色血糖试纸和基于生物传感器的血糖检测仪。在饲料工业中，作为饲料添加剂，葡萄糖氧化酶可以解除肠道霉菌毒素中毒，减少饲料霉菌超标危害；同时，葡萄糖氧化酶催化动物肠道内的葡萄糖产生葡萄糖酸，葡萄糖酸可降低胃内食糜ph值，有效抑制有害菌繁殖，促进有益菌生长，还能激活胃蛋白酶活性，有利于蛋白质、维生素、矿物质等营养成分的消化吸收，从而提高饲料转化效率；添加了葡萄糖氧化酶的畜禽饲料可以通过清除动物因应激反应产生的自由基，保护肠道上皮细胞完整，阻挡病原体入侵。

然而，在饲料加工过程中的短暂高温过程会造成葡萄糖氧化酶的失活，影响葡萄糖氧化酶的应用效果，在葡萄糖氧化酶产量得到保证的前提下，葡萄糖氧化酶的耐温性能越来越受到关注，因此，通过基因工程手段开发耐温性强的葡萄糖氧化酶迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种葡萄糖氧化酶突变体，其耐热性得到显著提高，有利于其在饲料领域的广泛应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种葡萄糖氧化酶突变体，其具有(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一个：

(ⅰ)与葡萄糖氧化酶的氨基酸序列seqidno:1具有至少95％同源性的序列；

(ⅱ)具有所述(ⅰ)中所述的葡萄糖氧化酶的至少一个免疫表位，且所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

(ⅲ)由如seqidno:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如seqidno:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列；

在本发明的一些实施例中，所述取代为取代2个或2个以上氨基酸。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括氨基酸序列为seqidno:1的葡萄糖氧化酶的第65位和第416位氨基酸同时发生了取代。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括氨基酸序列为seqidno:1的葡萄糖氧化酶的第65位氨基酸由a变为r,第416位氨基酸由a变为k。

在本发明的另一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列为seqidno:3，其一种编码基因的核苷酸序列为seqidno：4。

在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第275位氨基酸发生了取代。

在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第275位氨基酸由h变为f。

在本发明的另一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列为seqidno:5，其一种编码基因的核苷酸序列为seqidno：6。

本发明还提供了携带上述葡萄糖氧化酶突变体的编码基因的重组表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。

在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母。

本发明还提供了上述葡萄糖氧化酶突变体在饲料中的应用。

本发明提供的葡萄糖氧化酶两点突变体god11(a65r和a416k)在70℃处理2.5min后残余酶活为57.18％，75℃处理2.5min后残余酶活为30.96％；而本发明提供的三点突变体god-k(a65r，h275f和a416k)在70℃处理2.5min后残余酶活为68.20％，75℃处理2.5min后残余酶活为42.76％，比葡萄糖氧化酶突变体god11分别提高了19.3％和38.1％，取得了意料不到的效果。上述结果表明本发明在葡萄糖氧化酶突变体god11基础上引入h275f突变导致该酶的耐热性得到大幅提升，更适合在工业生产中的应用，因而市场前景广阔。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecularcloning:alaboratorymanual,3nded.(sambrook,2001)和currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

其中a、r、k、f、h分别是氨基酸ala，arg，lys，phe，his的缩写。

本发明具体实施例所使用的实验材料和试剂如下：

菌株与载体：大肠杆菌dh5α、毕赤酵母gs115、载体ppic9k、amp、g418购自invitrogen公司。

酶与试剂盒：pcr酶及连接酶购买自takara公司，限制性内切酶购自fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自omega公司，genemorphii随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。

培养基配方：

大肠杆菌培养基(lb培养基)：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％nacl，ph7.0)；

lb-amp培养基：lb培养基加100μg/ml氨苄青霉素；

酵母培养基(ypd培养基)：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

酵母筛选培养基(md培养基)：2％葡萄糖，2％琼脂糖，1.34％ynb，4×10^-5生物素；

bmgy培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34％ynb，4×10^-5生物素，1％甘油；

bmmy培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34％ynb，4×10^-5生物素，0.5％甲醇。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1葡萄糖氧化酶突变体god11基因的合成及重组质粒的获得

为了提高葡萄糖氧化酶(氨基酸序列为seqidno:1，其编码核苷酸序列为seqidno:2)的耐热性，申请人对第65位和第416位氨基酸位点进行突变，第65位氨基酸由a变为r，第416位氨基酸由a变为k。

将包含上述2个突变位点的葡萄糖氧化酶突变体命名为god11，其序列由上海捷瑞生物工程有限公司依照毕赤酵母的密码偏爱性优化合成，其氨基酸序列为seqidno:3，其编码核苷酸序列为seqidno:4，并且在合成序列5’和3’两端分别加上ecori和noti两个酶切位点。

将上述合成的god11基因序列进行ecori和noti双酶切后与经同样酶切后的ppic-9k载体16℃过夜连接并转化大肠杆菌dh5a，涂布于lb+amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落pcr(反应体系：模板挑取的单克隆，rtaqdna聚合酶0.5ul，10×buffer2.0μl，dntps(2.5mm)2.0μl，5’aox引物(10m)：0.5μl，3’aox引物：0.5μl，ddh2o14.5μl，反应程序：95℃预变性5min，30cycles：94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，72℃10min)验证阳性克隆子，经测序验证后最后获得了正确的重组表达质粒，将其命名为ppic9k-god11。

实施例2耐热突变体的筛选

为了进一步提高葡萄糖氧化酶突变体god11的耐热性，申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计pcr引物god-f1、god-r1如下：

god-f1：ggcgaattcggtattgaggcatctttgttgac(下划线为限制性内切酶ecori识别位点)

god-r1：atagcggccgcttattgcatagaagcgtaatc(下划线为限制性内切酶noti识别位点)

以god11基因为模板，以上述引物用genemorphii随机突变pcr试剂盒(stratagene)进行pcr扩增，胶回收pcr产物，ecori、noti进行酶切处理后与经同样酶切后的pet21a载体连接，转化至大肠杆菌bl21(de3)中，涂布于lb+amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mmiptg的lb+amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有葡萄糖氧化酶的大肠杆菌细胞裂解液。

分别取出10μl裂解液至两块新的96孔板，其中一块于70℃处理5min后，两块96孔板都加入40μl底物，于30℃反应30min后，dns法测定生成的还原糖，计算高温处理的酶液相比于未处理酶液的相对酶活。实验结果表明，有些突变对葡萄糖氧化酶god11的耐热性没有影响，有些突变甚至使其耐热性或酶活变得更差了；另外还有些突变，虽然能提高葡萄糖氧化酶god11对温度的耐受性，但突变后其酶学性质发生了显著的变化，这些均不符合要求。最终，申请人筛选到既能显著提高葡萄糖氧化酶god11的耐热性，又不会影响其酶活及原有酶学性质的突变位点：h275f。

将含h275f位点突变的葡萄糖氧化酶突变体基因命名为god-k，其编码的葡萄糖氧化酶god-k氨基酸序列和核苷酸序列如seqidno：5和seqidno：6所示。

采用实施例1中所述方法进一步获得携带有上述葡萄糖氧化酶突变体基因god-k的重组表达质粒，命名为ppic9k-god-k。

实施例3毕赤酵母工程菌株的构建

将表达质粒ppic9k-god-11和ppic9k-god-k分别用sali进行线性化，表达质粒线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母gs115，在md培养基上分别筛选得到毕赤酵母重组菌株gs115/ppic9k-god-11和gs115/ppic9k-god-k，然后分别在含不同浓度遗传霉素的ypd培养基上筛选多拷贝的转化子。

将筛选得到的突变体的转化子分别命名为毕赤酵母god-11(pichiapastorisgod-11)和毕赤酵母god-k(pichiapastorisgod-k)，分别转接于bmgy培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入bmmy培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5％的甲醇，诱导表达4d；离心去除菌体，分别得到含葡萄糖氧化酶突变体god11和god-k的发酵上清液；将其进行sds-page电泳检测分析。结果显示，发酵上清液中葡萄糖氧化酶突变体god11和god-k的分子量大小约为64kda，与理论分子量大小相同。

(1)葡萄糖氧化酶酶活单位的定义

在ph6.0，30℃条件下，每分钟能把1μmol的β-d-葡萄糖氧化为d-葡萄糖酸和过氧化氢所需要的酶量，定义为1个酶活力单位(iu)。

(2)酶活测定方法

将粗酶液直接用缓冲液稀释至约10u/ml。取4支150*15的试管，加入2ml缓冲液、0.3ml葡萄糖、0.4ml苯酚、0.1ml4-氨基安替吡啉、0.1ml辣根过氧化物酶，30℃预热5min。向其中一管加入0.1ml蒸馏水，作为空白调零。水浴锅放在分光光度计旁以方便操作，向样品管中加入0.1ml样品溶液，此时开始计时，涡旋混匀后立即在500nm波长处用1cm比色杯比色。读取0.5min时吸光度值为a0，再反应1min后，读取吸光度值a1，得出δa500＝a1-a0。

酶活计算公式：

试样中酶活力x1(u/ml或u/g)按照如下公式计算：

x1＝δa500×f×b×1000/(887×t×a×d)＝33.82×δa500×f

式中：

f---------------------酶液稀释倍数

b--------------------反应液体积(3ml)

1000----------------消光系数单位转换系数

887-----------------消光系数(l·mol-1·cm-1)

t---------------------反应时间(min)，即读数a1与a0之间的时间差值1min。

a--------------------加入样品体积(0.1ml)

d--------------------比色皿的厚度(cm)

(3)酶活测定结果

按照上述方法进行发酵上清液的酶活测定，结果显示：重组表达葡萄糖氧化酶突变体的毕赤酵母god-11和毕赤酵母god-k发酵上清液的酶活分别达到101u/ml和90u/ml。

实施例4发酵验证

在10升发酵罐上分别进行毕赤酵母god-11和毕赤酵母god-k的发酵，发酵使用的培养基配方为：硫酸钙1.1g/l、磷酸二氢钾5.5g/l、磷酸二氢铵55g/l、硫酸钾20.3g/l、硫酸镁16.4g/l、氢氧化钾1.65g/l、消泡剂0.05％。

发酵工艺：ph值5.0、温度30℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5(v/v)、溶氧控制在20％以上。

整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7％比例接入种子，30℃培养24-26h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在150-180h之间。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。

采用实施例3所述葡萄糖氧化酶酶活测定方法对粗酶液进行酶活检测，结果显示，重组表达葡萄糖氧化酶突变体的毕赤酵母god-11和毕赤酵母god-k的发酵粗酶液的酶活分别达到3211u/ml，2990u/ml。

实施例5葡萄糖氧化酶突变体酶学性质

1、最适作用ph

采用ph值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在30℃条件下对实施例4所述发酵粗酶液进行葡萄糖氧化酶活力测定，以最高酶活为100％，计算相对酶活，结果显示葡萄糖氧化酶突变体god11和god-k的最适作用ph值都为6.0，且在不同ph条件下的相对酶活水平差别不大。

2、最适反应温度

分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，ph5.0条件下，对实施例4中所述粗酶液进行葡萄糖氧化酶酶活测定，以最高酶活为100％，计算相对酶活，结果显示葡萄糖氧化酶突变体god11和god-k的最适作用温度均为35℃。

3、热稳定性分析

将上述粗酶液用ph6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释后，在70℃处理2.5min及75℃处理2.5min后分别测定酶活，以未处理样品的酶活为100％，计算残余酶活。

结果显示：本发明提供的葡萄糖氧化酶两点突变体god11(a65r和a416k)在70℃处理2.5min后残余酶活为57.18％，75℃处理2.5min后残余酶活为30.96％；而本发明提供的三点突变体god-k(a65r，h275f和a416k)在70℃处理2.5min后残余酶活为68.20％，75℃处理2.5min后残余酶活为42.76％，比葡萄糖氧化酶突变体god11分别提高了19.3％和38.1％，耐热性得到显著提升，取得了意料不到的效果。

上述结果表明本发明在葡萄糖氧化酶突变体god11基础上引入h275f突变导致该酶的耐热性得到大幅提升，更适合在工业生产中的应用，因而市场前景广阔。

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<110>青岛蔚蓝生物集团有限公司

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