斜带石斑鱼天然免疫受体TLR22基因及其真核表达载体与应用的制作方法

本发明属于生物基因工程技术领域，更具体地，涉及一种斜带石斑鱼天然免疫受体TLR22基因及其真核表达载体与应用。

背景技术：

模式识别受体（PRRs）能够识别多种微生物保守的分子结构（PAMPs）以及损伤的细胞释放的内源性的分子（DAMPs），用于激活先天性免疫应答。鱼类这一低等脊椎动物利用PRRs直接检测外源性微生物，使得先天性免疫系统为机体提供了直接、快速的抗感染应答反应。

Toll受体家族（TLRs）是一类特异监控微生物分子结构的PRRs成员，是参与机体先天性免疫过程中的重要受体，是典型的I 型跨膜受体。它具有胞外不保守的富含亮氨酸重复区域（LRRs），以及胞内保守的TIR 结构域。TLRs 通过LRR 区识别多种微生物保守的分子组分——病原相关分子模式（PAMPs），之后通过TIR 区募集接头蛋白MyD88 和TRIF，介导MyD88 依赖型信号通路和TRIF 依赖型信号通路，活化转录因子，最终释放促炎因子和I型干扰素等免疫基因，从而调动获得性免疫应答，加强机体防御。鱼类特有的TLR 基因（如TLR21，TLR22，TLR23）是在自然界漫长的进化过程中保留下来的重要基因，更加具有研究价值。TLR22基因是鱼类特有的TLR 家族的成员，已经证明具有TLR 家族典型的分子结构，既能够募集MyD88接头蛋白也能结合TRIF接头蛋白，激活下游通路参与鱼类的免疫防御。

斜带石斑鱼（orange-spotted grouper,Epinepheluscoioides）是鲈形目（Perciformes），鮨科（Serranidae），石斑鱼亚科（Epinephelinae），石斑鱼属（Epinephelus）鱼类。斜带石斑鱼主要分布在包括我国华南沿海、台湾和香港在内的东南亚地区，其肉质鲜美，细嫩，营养价值极为丰富，具有较高的经济价值。但随着石斑鱼养殖业的发展，种质资源的衰退以及鱼类疾病（如病毒病、细菌病、寄生虫病等）的防控成为其发展的最大障碍。

因此，通过TLR22基因序列、cDNA序列以及蛋白氨基酸序列在研究斜带石斑鱼的先天性免疫防御机制中具有重要意义。加深人们对机体抵抗病原微生物感染过程的认识，以便在合适的时机采取有效的免疫保护措施，减少鱼药的滥用，保障鱼类的健康养殖。

技术实现要素：

本发明的要解决的技术问题是弥补现有技术的空白，提供一种斜带石斑鱼天然免疫受体TLR22基因的核苷酸序列。

本发明要解决的另一技术问题是提供包含所述TLR22基因全长cDNA序列的真核表达载体。

本发明还一要解决的技术问题是提供所述TLR22基因或TLR22蛋白在调节炎症因子表达中的应用。

本发明还一要解决的技术问题是提供所述TLR22基因或TLR22蛋白在参与识别病毒RNA及调节免疫因子表达中的应用。

本发明还一要解决的技术问题是提供所述TLR22基因或TLR22蛋白在细胞免疫应答中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种斜带石斑鱼天然免疫受体TLR22基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1所示。

所述斜带石斑鱼天然免疫受体TLR22基因的全长cDNA序列如SEQ.ID.NO：2所示。

所述斜带石斑鱼天然免疫受体TLR22基因的cDNA序列全长3320bp，包括一个78bp的5’非编码区，一个359bp的3’非编码区，以及一个2880bp的开放阅读框。

所述斜带石斑鱼天然免疫受体TLR22基因的cDNA序列3’非编码区上有2个AATAA多腺苷酸化加尾信号。

所述斜带石斑鱼天然免疫受体TLR22基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO：3所示。

所述斜带石斑鱼天然免疫受体TLR22基因的全长cDNA序列中包含1对引物序列，引物序列如SEQ.ID.NO：4～5所示。

本发明还提供包含所述TLR22基因全长cDNA序列的真核表达载体。

本发明还提供了所述TLR22基因或所述的TLR22蛋白在调节炎症因子表达中的应用。

本发明还提供了所述TLR22基因或所述的TLR22蛋白在参与识别病毒RNA及调节免疫因子表达中的应用。

本发明还提供了所述TLR22基因或所述的TLR22蛋白在细胞免疫应答中的应用。

本发明的有益效果：

本发明首次提供了所述斜带石斑鱼天然免疫受体TLR22基因的核苷酸序列基于所述序列，还提供了所述TLR22基因的真核表达载体，并且提供了所述TLR22基因及TLR22基因编码的蛋白在研究调节炎症因子的表达、识别病毒RNA及调节免疫因子表达、细胞免疫应答中的应用，具有突出的实质性进步。

附图说明

图1 TLR22基因ORF区域的PCR凝胶电泳图。

图2验证真核表达载体pcDNA3.1-EcTLR22的凝胶电泳图。

图3斜带石斑鱼TLR22的激活抑制NF-KB通路活化。

图4斜带石斑鱼TLR22的激活抑制AP-1通路活化。

图5斜带石斑鱼TLR22的激活促进ERK活化。

图6过表达斜带石斑鱼TLR22对免疫因子IL-1β的影响。

图7过表达斜带石斑鱼TLR22对免疫因子IFNγ1的影响。

图8过表达斜带石斑鱼TLR22对免疫因子IFNγ2的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1斜带石斑鱼TLR22基因的克隆

（1）斜带石斑鱼脾脏总RNA的提取

取健康斜带石斑鱼，于冰上麻醉3分钟，分离脾脏组织，采用Trizol试剂提取其总RNA。

（2）cDNA第一链的合成

取1μg斜带石斑鱼头肾总 RNA 样品进行DNA酶处理以去除基因组 DNA 的污染，与RNA OligodT混合，进行反转录，所得产物置于 -20℃保存备用。

（3）斜带石斑鱼TLR22基因cDNA全序列的克隆

设计特异性引物ORF-F和ORF-R，如SEQ.ID.NO：4、SEQ.ID.NO：5所示，扩增得到的ORF片段，PCR扩增反应条件为：94 ℃，3min；94 ℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 3min30s ，40个循环；72℃，10min；4℃ ∞。PCR反应后的凝胶电泳图见附图1。

实施例2真核表达载体pcDNA3.1-EcTLR22的构建及其验证

构建斜带石斑鱼pcDNA3.1-EcTLR22真核表达载体，选择NheI和KpnI双酶切位点构建引物。上游引物为 EcTLR22-NheI F：5’-ACCCAAGCTGGCTAGCATGGGTCCCGGTTTGAAAG-3’；下游引物为 EcTLR22-myc-KpnI R：5’-GTGGATCCGAGCTCGGTACCCAGATCTTCTTCAGAAATAAGTTTTTGTTCCGGTTTGTCCGTCACAGTCAG-3’。以斜带石斑鱼头肾反转录的cDNA为模板，扩增中间片段，KOD体系反应条件：94 ℃ 3min；94 ℃ 15s，56 ℃ 30s，68 ℃6min，40个循环，PCR产物于4℃保存。PCR反应后的凝胶电泳结果见附图2。真核表达载体pcDNA3.1分别用NheI和KpnI双酶切及纯化后，与带有酶切位点的TLR22连接，经转化、阳性克隆筛选、测序，提质粒得到含有目的基因的真核表达载体。经测序验证序列正确性、无突变无移码，证明pcDNA3.1-EcTLR22 载体构建成功。

实施例3激活TLR22后引起NF-KB信号通路变化

将HEK293T细胞转移至24孔细胞培养板中，密度为0.5-2×10⁵个细胞，体积为500μl，当细胞汇合度达90～95%时方可进行转染。将真核表达载体pcDNA3.1-EcTLR22与pcDNA3.1-NF-kB-luc共转染HEK293T细胞，TK Renillia vectors作为内参同时转染。孵育细胞于 37℃ 5% CO₂的培养箱中6h，之后换成DMEM完全培养基继续培养至24h。用5激动剂PGN(10 mg/mL)、CL-097 (1μg /mL)、poly AU (50 μg/mL)、HMW（5，25，50μg/mL）和LMW（5，25，50μg/mL）刺激细胞6 h后收获细胞，细胞用PBS洗涤2次，每孔加入50μL 1×Passive Lysis Buffer，室温温和震荡裂解细胞15min。取20μL细胞裂解液于96孔酶标板中，于Promega双荧光检测酶标仪中设定：加入50μL LAR II 溶液以检测萤火虫荧光素酶活性，加入50μL Stop &Glo溶液以淬灭萤火虫荧光素酶荧光、激活并检测海肾荧光素酶荧光。萤火虫荧光素酶荧光强度与海肾荧光素酶荧光强度比值表示各样品启动活性强度，进行数据分析。结果显示，在不同激动剂的刺激下，EcTLR22引起的NF-κB的活化情况不同。在CL-097和PGN的刺激下NF-κB被微弱活化；而poly AU的刺激使NF-κB的活化受到微弱抑制，但是与未刺激组相比都没有显著性差异。而在dsRNA类似物HMW和LMW刺激下（不论是低浓度还是高浓度），NF-κB的活化受到的显著性的抑制，并且HMW对于NF-κB的抑制更加显著，结果见附图3。表明长片段的dsRNA（HMW）是TLR22的配体，并且dsRNA刺激EcTLR22抑制NF-κB通路的活化。

实施例4激活TLR22后引起AP-1信号通路变化

转染前一天将HEK293T细胞转移至24孔细胞培养板中，密度为0.5～2×10 ⁵个细胞，体积为500μL，当细胞汇合度达 90～95%时方可进行转染。分别将每孔500ng pcDNA3.1-EcTLR22或pcDNA3.1、200ng AP-1-luc和100ng TK Renillia vectors共转染到HEK293T细胞。24h后选取不同浓度（5，25，50μg/mL）的 HMW 刺激过表达了EcTLR22 基因的HEK293T细胞。细胞用 PBS 洗涤 2 次，每孔加入 50μl 1×Passive Lysis Buffer，室温温和震荡裂解细胞15min。取20μL细胞裂解液于96孔酶标板中，于Promega双荧光检测酶标仪中设定：加入 50μL LAR II 溶液以检测萤火虫荧光素酶活性，加入 50μL Stop &Glo溶液以淬灭萤火虫荧光素酶荧光、激活并检测海肾荧光素酶荧光。萤火虫荧光素酶荧光强度与海肾荧光素酶荧光强度比值表示各样品启动活性强度，进行数据分析。结果显示不同浓度的HMW刺激，均能显著抑制AP-1的活性，结果如附图4所示。

实施例5激活TLR22后引起ERK信号通路变化

取适量新鲜斜带石斑鱼脾组织立即浸没于 RPMI 1640 完全培养液中，并置于冰上，在细胞房超净工作台内，将脾脏组织用无菌剪刀剪碎，并用无菌磨砂玻片的磨砂面进行研磨直至浆状，并剔除结缔组织。将研磨分散出的含有脾脏细胞的培养基过滤70μm的细胞筛网，去除杂质，滤液收集至50mL离心管中，于4℃ 500×g离心10 min，弃上清，加入4mL RPMI 1640组织培养液重悬细胞，于4℃ 500×g离心10min，弃上清。加入 4mL RPMI 1640 组织培养液重悬细胞，将细胞悬液缓缓加入2mL淋巴细胞分离液（LMS）液面之上，于4℃ 500×g，离心30min。此时离心管中由上至下细胞分为四层：第一层为血浆层；第二层为乳白色淋巴细胞层；第三层为分离液层；第四层为红细胞层。用巴氏管缓慢收集第二层淋巴细胞悬液至新的 15mL离心管，加入10mL RPMI 1640 组织培养液，混匀后于 4℃ 500×g离心5min，弃上清，重复一次。以适量的组织培养液重悬细胞，转移至细胞培养瓶后于 27℃，5% CO₂培养箱中培养备用。

将EcTLR22-myc-pcDNA3.1或pcDNA3.1真核表达载体转染入斜带石斑鱼脾脏淋巴细胞中过表达，24小时后用50μg/mL HMW刺激6小时后收集细胞。加入RIPA 裂解液，轻轻混匀，冰浴裂解30min，4℃，12000g 离心 10min，收集上清，100℃加热变性 5min 后置于 -20℃保存。将蛋白样品用 10％聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离，然后经 2mA/cm²恒流将蛋白质转移至硝酸纤维素薄膜上。转膜完成后，将硝酸纤维素膜经5%脱脂牛奶/PBST(PBS 0.1%Tween20)室温封闭2h，加一抗稀释液4℃过夜，然后用1‰Tween PBST洗涤五次，每次5min。加入二抗稀释液，室温下避光孵育1h，1‰ Tween 的 PBST洗膜五次，每次5min。用ECL化学发光工作液显色，用化学发光成像分析系统拍照分析。对照组的淋巴细胞在 HMW 刺激下，ERK的磷酸化水平在刺激20min 升高，之后直到刺激 120min 趋于稳定；而在过表达了 EcTLR22 的淋巴细胞中，ERK 的磷酸化在刺激 40min 时表达量骤然升高，之后恢复到与对照组同一水平，结果如附图5所示。因此，在斜带石斑鱼中，EcTLR22 能够促进HMW引起的ERK通路的活化。

实施例6激活TLR22后引起免疫因子表达量变化

用斜带石斑鱼IL-1β、IFNγ1和IFNγ2抗体研究在dsRNA刺激下EcTLR22对IFNr的影响。用50ug/mL激动剂dsRNA（HMW）刺激过表达TLR22的斜带石斑鱼脾脏淋巴细胞后0min、20min、40min、60min、120min、180min时收细胞提总蛋白，用western检测p-ERK表达量。如附图6所示，在过表达了EcTLR22 的脾脏淋巴细胞中，HMW刺激60min和刺激120min，IL-1β表现出显著上调表达。如附图7所示，HMW 刺激20min 即检测到IFNγ1蛋白快速的上调表达，在刺激 40min 到 180min 时间段，可以观察到过表达细胞系与对照组有相似的变化趋势。如附图8所示，EcTLR22引起的IFNγ2的表达却在HMW刺激的早期（20min～40min）出现了小幅度的下调，但是在刺激后期（60min～180min）又迅速发生上调的表达变化。

序列表

<110> 中山大学

<120> 斜带石斑鱼天然免疫受体TLR22基因及其真核表达载体与应用

<140> 2017105577432

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2883

<212> DNA

<213> 斜带石斑鱼TLR22基因核苷酸序列(Epinepheluscoioides)

<400> 1

atgggtcccg gtttgaaaga ggaacaaaca aaaagaggat caaaatgttt taaactaaat 60

tttgtttttt tcttgctgaa tatcagcagt ttttttgttc cagtcacagg gtatgtactg 120

aggtcttgcc atatcagtta cagcactgcc atatgttcca agaggagact cactgctgtc 180

cctcaagata ttccctcaac agtgaaaggt ttggacttgt atggaaacaa aatttcaaaa 240

atccaagtat cagatttcaa aaagctgtca aatttgacag agttaaatct gaaatggaat 300

ataatctcag agatagatac aggctccttt accaatttga attccctcaa gatgttaaat 360

ctaaatgata acaaacttac tggacttgga gacaatgttt ttgatggttt gggcagccta 420

acacatctca gaatgaacag aaatcagatc aaaacagtgg catccacctc ttttaagtcc 480

ttgacgaact tgatggtttt ggacatctcc gtcaacaaac tgtaccgcat aacaaatgtt 540

catactatat tacagcacct gccaaatcta ctggagctgt cagtcgcaaa caacaactta 600

acctcttttc agtcgtggga actgacaaac agctcactaa aacttggcca acttgatttg 660

tctcaaaatc ccattggaga ctttaggatc actgcagatg tttttcctaa tctcacctgg 720

ttaaacactg ggggctcttc taagaggcat cacatgaaat gggacgttcg taacaagact 780

tttcttcgca gagtgtctac ttttgatatt agtgggcttc aaataccttc agaagacatg 840

aaaacaatac tagggacctt caactcctca ctgacgacag tgaagatgaa tgatatgaaa 900

cgcacatacc tgagagcctt aattaacatc tcctgcagca tcccaacagt gtcctcactt 960

caactcagaa gtaacaacct cttttttatg agctcaaatt tgttatcgtt gtgttttaag 1020

gtaacagagt tagatttagc agataactca atgaaaaata tcaaagacga tgccttcaaa 1080

catcttcaag gtataaaggt cttggctctg aatcacaaca ggctttcatc tgttccagct 1140

gccataagga atctaccagc tcttgaagag ctagatctca gcaaaaataa tatcaccaca 1200

cttggttgtc aagatttcgc caatctgaca aagctcagac agctcagcct tcatcagaat 1260

tcaatctcag ctctacaggg gtgtgttttc aaggatttaa tacacctgga agttttaaag 1320

ctacagaata acagcatttc taaactgaat gatgctttca taaaatactt gccaaatctg 1380

agacaactgc atctgaattc aaataaactc acagcaatta aacatgggga atttaggggc 1440

ttgcggtccc tccagaactt gtcattacat gacaatcaga taacagtact tgaaaaagag 1500

tgttttactg gactgaggaa tcttatggct atccagctgc aaatgaatca tattaaaaga 1560

cataaagatt acaaagatag tttcagagat ctgataaatt taaaacgatt ggatttgagt 1620

cacaatagca ttaaatatat tgagagctca gctttgcctg atccaccatt ttctcatctg 1680

tccaatttgg agagactggc ttttactgga aatcaccgca gagtgaagtc ccagctgcct 1740

tgcaacttcc tgcaaggctt gactaatctt ttagatttca ctggcaggaa tcttcagctt 1800

ttatccttgc acaaagacac atttaatcac acgccaaaac tacaaaaact tgatataagc 1860

tcaaatgaac ttatggatct ttcttcagaa ttgttttacc caattagaaa tctcaaaagc 1920

ctctatatat ctagaataaa ccttgggtct ctagacttct ttaaagatgc caacctaact 1980

aagctggagt tcctgcaggc aagaaggaat cagttttcag ttttcagtga ggaagtactg 2040

gagtccatgc cagctctggc ttacttggat cttcaaggca atagtttcac ctgtgactgt 2100

gataacgcct ggttcctcaa gtggacagaa aacaaccagc aaacacaagt ttctgatgcc 2160

tacaactttg tgtgcaacta tcctccacac cttaaaggta tgaaactgtt gaagctcgat 2220

gtccggtcct gcacagtgga cactgaattc atctgcttta tctccaccac atgtacgatc 2280

ctcgtgttta tggtggcatc cttcacctac catttcctga ggtggtactt ggcctatgcc 2340

tactacatct tcttggcttt tctctttgac acaaagcata aaaacaagca agctccaaat 2400

cagtatgacg ccttcatctc ctacaacacc cacgatgagc catgggtcat cagacagctg 2460

ttgccaaaac tggaagggga gcaaggctgg agattgtgtt tgcaccatcg agatttcgag 2520

ccaggtaaac ccatcataga caacattaca gatgccatct atggaagcag gaagaccatc 2580

tgtgtgatca gtcacagata ccttgagagt gagtggtgct ccagagagat ccaggtggcc 2640

agcttccgcc tgtttgatga gcagaaggac gtgctcatcc tggtgtttct ggaggacatt 2700

cccaccactc aactgtctcc ttactaccgc atgaggaagc ttctgaagag gcagacctat 2760

ttgagctggc ctcgagcctc agagcaccct gaactattct gggagaaact ccgccaagct 2820

atgaagacca gagaggatct tggggaggat gaattgaacc tgactgtgac ggacaaaccg 2880

tga 2883

<210> 2

<211> 3321

<212> DNA

<213> 斜带石斑鱼TLR22基因全长cDNA序列(Epinepheluscoioides)

<400> 2

caggtggact atacgttgag gaagttcaat tccattttgg ttggacatct cttgttcttt 60

tgtaacaaag attttaaaat gggtcccggt ttgaaagagg aacaaacaaa aagaggatca 120

aaatgtttta aactaaattt tgtttttttc ttgctgaata tcagcagttt ttttgttcca 180

gtcacagggt atgtactgag gtcttgccat atcagttaca gcactgccat atgttccaag 240

aggagactca ctgctgtccc tcaagatatt ccctcaacag tgaaaggttt ggacttgtat 300

ggaaacaaaa tttcaaaaat ccaagtatca gatttcaaaa agctgtcaaa tttgacagag 360

ttaaatctga aatggaatat aatctcagag atagatacag gctcctttac caatttgaat 420

tccctcaaga tgttaaatct aaatgataac aaacttactg gacttggaga caatgttttt 480

gatggtttgg gcagcctaac acatctcaga atgaacagaa atcagatcaa aacagtggca 540

tccacctctt ttaagtcctt gacgaacttg atggttttgg acatctccgt caacaaactg 600

taccgcataa caaatgttca tactatatta cagcacctgc caaatctact ggagctgtca 660

gtcgcaaaca acaacttaac ctcttttcag tcgtgggaac tgacaaacag ctcactaaaa 720

cttggccaac ttgatttgtc tcaaaatccc attggagact ttaggatcac tgcagatgtt 780

tttcctaatc tcacctggtt aaacactggg ggctcttcta agaggcatca catgaaatgg 840

gacgttcgta acaagacttt tcttcgcaga gtgtctactt ttgatattag tgggcttcaa 900

ataccttcag aagacatgaa aacaatacta gggaccttca actcctcact gacgacagtg 960

aagatgaatg atatgaaacg cacatacctg agagccttaa ttaacatctc ctgcagcatc 1020

ccaacagtgt cctcacttca actcagaagt aacaacctct tttttatgag ctcaaatttg 1080

ttatcgttgt gttttaaggt aacagagtta gatttagcag ataactcaat gaaaaatatc 1140

aaagacgatg ccttcaaaca tcttcaaggt ataaaggtct tggctctgaa tcacaacagg 1200

ctttcatctg ttccagctgc cataaggaat ctaccagctc ttgaagagct agatctcagc 1260

aaaaataata tcaccacact tggttgtcaa gatttcgcca atctgacaaa gctcagacag 1320

ctcagccttc atcagaattc aatctcagct ctacaggggt gtgttttcaa ggatttaata 1380

cacctggaag ttttaaagct acagaataac agcatttcta aactgaatga tgctttcata 1440

aaatacttgc caaatctgag acaactgcat ctgaattcaa ataaactcac agcaattaaa 1500

catggggaat ttaggggctt gcggtccctc cagaacttgt cattacatga caatcagata 1560

acagtacttg aaaaagagtg ttttactgga ctgaggaatc ttatggctat ccagctgcaa 1620

atgaatcata ttaaaagaca taaagattac aaagatagtt tcagagatct gataaattta 1680

aaacgattgg atttgagtca caatagcatt aaatatattg agagctcagc tttgcctgat 1740

ccaccatttt ctcatctgtc caatttggag agactggctt ttactggaaa tcaccgcaga 1800

gtgaagtccc agctgccttg caacttcctg caaggcttga ctaatctttt agatttcact 1860

ggcaggaatc ttcagctttt atccttgcac aaagacacat ttaatcacac gccaaaacta 1920

caaaaacttg atataagctc aaatgaactt atggatcttt cttcagaatt gttttaccca 1980

attagaaatc tcaaaagcct ctatatatct agaataaacc ttgggtctct agacttcttt 2040

aaagatgcca acctaactaa gctggagttc ctgcaggcaa gaaggaatca gttttcagtt 2100

ttcagtgagg aagtactgga gtccatgcca gctctggctt acttggatct tcaaggcaat 2160

agtttcacct gtgactgtga taacgcctgg ttcctcaagt ggacagaaaa caaccagcaa 2220

acacaagttt ctgatgccta caactttgtg tgcaactatc ctccacacct taaaggtatg 2280

aaactgttga agctcgatgt ccggtcctgc acagtggaca ctgaattcat ctgctttatc 2340

tccaccacat gtacgatcct cgtgtttatg gtggcatcct tcacctacca tttcctgagg 2400

tggtacttgg cctatgccta ctacatcttc ttggcttttc tctttgacac aaagcataaa 2460

aacaagcaag ctccaaatca gtatgacgcc ttcatctcct acaacaccca cgatgagcca 2520

tgggtcatca gacagctgtt gccaaaactg gaaggggagc aaggctggag attgtgtttg 2580

caccatcgag atttcgagcc aggtaaaccc atcatagaca acattacaga tgccatctat 2640

ggaagcagga agaccatctg tgtgatcagt cacagatacc ttgagagtga gtggtgctcc 2700

agagagatcc aggtggccag cttccgcctg tttgatgagc agaaggacgt gctcatcctg 2760

gtgtttctgg aggacattcc caccactcaa ctgtctcctt actaccgcat gaggaagctt 2820

ctgaagaggc agacctattt gagctggcct cgagcctcag agcaccctga actattctgg 2880

gagaaactcc gccaagctat gaagaccaga gaggatcttg gggaggatga attgaacctg 2940

actgtgacgg acaaaccgtg atggaaaagg aaatacaacc ttctgtgaaa ggttcagtcc 3000

cattgtggtc aactggtttg agctttctca agcaacaacc tccagggctg aaaaatgaag 3060

ccaacatgga agtgtcaaaa actgcagttc cttgagtgac cacttggggc tagctacaga 3120

ggtgacttaa tctttatcta ccctcatgtt taattataca atatgatatg ataccatacg 3180

atatgatacg atacaatacg atatacttta ttgtcccata gggaagggac tcatatgcgc 3240

tgcatacaat aaaaatgcag tacagtaagt acagtaaaca taacaacaaa taacacatac 3300

cccctcccca gtgaattgcc c 3321

<210> 3

<211> 960

<212> PRT

<213> 斜带石斑鱼TLR22氨基酸序列(Epinepheluscoioides)

<400> 3

Met Gly Pro Gly Leu Lys Glu Glu Gln Thr Lys Arg Gly Ser Lys Cys

1 5 10 15

Phe Lys Leu Asn Phe Val Phe Phe Leu Leu Asn Ile Ser Ser Phe Phe

20 25 30

Val Pro Val Thr Gly Tyr Val Leu Arg Ser Cys His Ile Ser Tyr Ser

35 40 45

Thr Ala Ile Cys Ser Lys Arg Arg Leu Thr Ala Val Pro Gln Asp Ile

50 55 60

Pro Ser Thr Val Lys Gly Leu Asp Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Ser Lys

65 70 75 80

Ile Gln Val Ser Asp Phe Lys Lys Leu Ser Asn Leu Thr Glu Leu Asn

85 90 95

Leu Lys Trp Asn Ile Ile Ser Glu Ile Asp Thr Gly Ser Phe Thr Asn

100 105 110

Leu Asn Ser Leu Lys Met Leu Asn Leu Asn Asp Asn Lys Leu Thr Gly

115 120 125

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<212> DNA

<213> 斜带石斑鱼TLR22基因上游引物序列(Epinepheluscoioides)

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<213> 斜带石斑鱼TLR22基因上游引物序列(Epinepheluscoioides)

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