本发明涉及一种从发酵液中提取己二酸的方法，属于生物工程领域。
背景技术：
己二酸(adipicacid，adipate)又称肥酸，是一种重要的有机二元酸，广泛应用于化工生产、有机合成工业、医药、润滑剂制造等方面。
目前己二酸的生产方式主要采用空气氧化法或硝酸氧化法，但是此种方法的产品收率低于60％，废水量排放量较大，原料和中间产物毒性很强，而且过程中产生大量的n2o等温室气体，环境污染严重且不可持续。因此，人们将目光聚焦到生物合成己二酸的道路上，且做了大量的基础工作。以葡萄糖为底物全生物合成己二酸具有工艺流程简单、总投入成本低、可循环利用等突出优点，因此备受研究人员青睐。但是这些方法均未涉及到发酵液中己二酸的提取，在发酵液中提取己二酸主要存在的问题是发酵液中杂酸多，难以分离一种有机酸，纯度无法保证。而且菌生长状况等因素，也会导致发酵液中的有机酸提取比较困难。
本发明从葡萄糖为底物全生物合成己二酸的发酵液中提取己二酸，回收率达60％以上，纯度达90％以上。方法简单绿色，提取出来的己二酸纯度高，无需二次处理，可直接使用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从发酵液中提取己二酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)固液分离：发酵液去除菌体和杂质后，收集发酵液清液；
(2)超滤：利用超滤膜系统，将发酵液清液中的大分子蛋白及高分子杂质去除，收集超滤透过液；
(3)浓缩：浓缩超滤透过液；
(4)离子交换：将浓缩后的发酵液加入到经碱洗、去离子水洗、酸洗、去离子水洗至中性的阳离子交换树脂中，搅拌均匀，使树脂充分吸附后，过滤收集滤液；
(5)溶剂萃取：将收集到的滤液使用酸调节ph至酸性，然后使用有机溶剂萃取，收集萃取液；
(6)蒸发：蒸发萃取液中的有机溶剂；
(7)结晶：将旋转蒸发剩余的液体于4-8℃低温结晶，结晶后，于20-40℃进行完全结晶，得到己二酸成品。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的发酵液中己二酸含量为10-30g/l。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的发酵液是以重组大肠杆菌mad2△atob发酵得到；所述重组大肠杆菌mad2△atob是以敲除了atob基因的大肠杆菌bl21(de3)为宿主，分模块过量表达来自褐色喜热裂孢菌的异源基因β-酮硫解酶基因，3-羟酰基-辅酶a脱氢酶基因，3-羟基己二酰脱氢酶基因，5-羧基-2-戊烯酰辅酶a还原酶基因，己二酰辅酶a合成酶基因片段tfu_2576、tfu_2577；其中，β-酮硫解酶基因、3-羟酰基-辅酶a脱氢酶基因以prsfduet-1为表达载体；3-羟基己二酰脱氢酶基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶a还原酶基因以ptrc99a为表达载体；己二酰辅酶a合成酶基因片段tfu_2576、tfu_2577以pcdfduet-1为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵液的制备是：重组大肠杆菌mad2△atob种子液以2％的接种量接种至装有3lsob培养基的5l发酵罐中，搅拌转速400rpm，通气量1vvm，2mnaoh维持ph为6.8～7.2，发酵温度37℃，培养至od600为0.6-0.8时加1mmiptg，降温至30℃诱导；待发酵培养基里面的葡萄糖消耗剩2g/l左右时补加甘油，以维持甘油浓度在4g/l的速度进行补料，直至甘油补加总量达到100g/l。
在本发明的一种实施方式中，所述sob培养基的成分为2g/100ml胰蛋白胨、0.5g/100ml酵母粉、0.05g/100mlnacl、2.5mmkcl、10mmmgcl2、0.8g/100ml葡萄糖、50μg/ml硫酸卡那霉素、50μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml链霉素。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中超滤膜系统采用的超滤膜元件为卷式膜，超滤膜的截留分子量为500-3000。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中的浓缩是将超滤透过液浓缩至超滤液的60-90％。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中的阳离子交换树脂为732阳离子交换树脂；阳离子交换树脂的预处理方式为：首先用去离子水将阳离子交换树脂清洗3次，后用naoh调节ph至10，搅动半小时后，用去离子水冲洗直至ph中性后加h2so4调节ph至1，然后再用去离子水冲洗至中性。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中的阳离子交换树脂的活性基团为h+。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的有机溶剂为乙醇、甲醇或乙酸乙酯。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的有机溶剂的体积为滤液的2-4倍，萃取次数为3次。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中的蒸发是将有机溶剂蒸发至萃取液的10-20％。
本发明的优点在于：使用此方法提取发酵液中的己二酸纯度高，产率高，节约时间及原料，降低生产成本。采用本发明的方法，己二酸最终收率高达71.7％，纯度可达95.86％。
本发明将膜分离技术应用到己二酸提取中，有效去除发酵液中的大分子蛋白及糖类物质，有利用乙酸乙酯的萃取，有效避免了加入乙酸乙酯后形成乳浊液，无法分层，使得提取产物不纯的问题。具有自动化程度高、能耗低、污染小等优势。
本发明采用阳离子树脂进行离子交换，可最大程度去除在发酵液中引入的盐分，有效避免了在提取过程中反复调节ph。
本发明在离子交换前采用膜过滤及浓缩，减轻了树脂的污染，并延长树脂使用寿命；另一方面也有效提升了树脂的吸附量和处理效率。
具体实施方式
实施例1：重组大肠杆菌mad2△atob的获得
tfu_0875、tfu_2399、tfu_0068、tfu_1648、tfu_2576、tfu_2577的序列已于申请日前在ncbi中公布。
ecori和hindiii双酶切质粒prsfduet-1，切胶回收目的基因片段(3798bp)，用同样的酶酶切质粒puc57-tfu_0875，切胶回收得到目的基因片段tfu_0875，然后将两个目的片段用t4dna连接酶连接，化转jm109，菌落pcr挑取阳性转化子，并提取质粒酶切验证，验证正确后的质粒命名为prsf-tfu_0875。bglii和kpni酶切质粒prsf-tfu_0875，切胶回收4936bp的目的基因片段，用同样的酶酶切质粒puc57-tfu_2399，切胶回收目的基因片段，然后将两个目的片段用t4dna连接酶连接，化转jm109，菌落pcr挑取阳性转化子，并提取质粒酶切验证，验证正确后的质粒命名为pad-1。
其他质粒使用同样的方法进行构建，最终片段tfu_0068、tfu_1648通过ncoⅰ、hindⅲ连接到质粒ptrc99a上形成pad-4质粒；tfu_2576、tfu_2577通过ncoⅰ、hindⅲ连接到质粒pcdfduet-1上形成pad-6质粒。
将pad-1、pad-4、pad-6转入已敲除atob基因的大肠杆菌bl21(de3)中，制备得到重组大肠杆菌mad2△atob。参见专利cn106834200a。
实施例2：上罐发酵及结果分析
3l培养基：sob培养基，成分为2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％nacl+2.5mmkcl+10mmmgcl2+8g/l葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨苄青霉素+50μg/ml链霉素，补料加100g/l甘油。
种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的lb液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250rpm/min摇瓶过夜。次日取500μl菌液转接于60mllb液体培养基中，37℃、250rpm培养至od600达到0.6-0.8时，接种于5l发酵罐中。
发酵条件：2％接种量，37℃培养至od600为0.6-0.8左右时加1mmiptg30℃诱导，搅拌转速400rpm，通气量1vvm，2mnaoh维持ph为6.8～7.2。待发酵培养基里面的葡萄糖消耗剩2g/l左右时补加甘油，以维持甘油浓度在4g/l的速度进行补料，直至甘油补加总量达到100g/l。
结果分析：发酵过程中每4h取一次样，10000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22μm滤膜处理发酵液，用于进行hplc(高效液相色谱法，美国伯bio-rad伯乐aminexhpx-87h有机酸柱)检测，hplc检测中流动相为5mmh2so4，柱温为30℃，紫外检测器210nm。上罐发酵己二酸产量为25.57g/l。
实施例3：发酵液中有机溶剂提取己二酸
按照以下方法提取实施例2的发酵液中的己二酸：
(1)上罐发酵液首先通过离心机离心去除菌体及杂质，收集发酵液清液；
(2)将发酵液清液通过截留分子量为2500的卷式膜过滤以除去大的蛋白及高分子杂质，收集超滤透过液；
(3)将超滤透过液80℃下旋蒸浓缩，将超滤透过液浓缩至超滤液的80％，收集浓缩液；
(4)将浓缩液使用732阳离子交换树脂进行吸附，将发酵液中的na+进行吸附，置换成h+，首先用去离子水将732阳离子交换树脂清洗3次，后用naoh调节ph至10，搅动半小时后，交去离子水冲洗直至ph中性后加h2so4调节ph至1后用去离子水冲洗至中性。然后将浓缩液加入到阳离子树脂中，搅拌均匀，使树脂充分吸附后，通过漏斗过滤收集滤液；
(5)收集完的滤液使用h2so4调节ph至3左右，后用滤液3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，收集萃取液；
(6)然后60℃旋蒸萃取液，旋蒸至萃取液的10％；
(7)将旋蒸后的液体放于4℃冰箱进行低温结晶，结晶后，放于30℃烘箱中进行完全结晶，结晶后使用液相进行提取率的计算。
结果分析：每步提纯的液体用于进行hplc(高效液相色谱法，美国伯bio-rad伯乐aminexhpx-87h有机酸柱)检测，hplc检测中流动相为5mmh2so4，柱温为30℃，紫外检测器210nm，检测每步损失。最终收率高达71.7％，纯度可达95.86％。
实施例4：发酵液中有机溶剂提取己二酸
按照以下方法提取实施例2的发酵液中的己二酸：
(1)上罐发酵液首先通过离心机离心去除菌体及杂质，收集发酵液清液；
(2)将发酵液清液通过截留分子量为500的卷式膜过滤以除去大的蛋白及高分子杂质，收集超滤透过液；
(3)将超滤透过液80℃下旋蒸浓缩，将超滤透过液浓缩至超滤液的90％，收集浓缩液；
(4)将浓缩液使用732阳离子交换树脂进行吸附，将发酵液中的na+进行吸附，置换成h+，首先用去离子水将732阳离子交换树脂清洗3次，后用naoh调节ph至10，搅动半小时后，交去离子水冲洗直至ph中性后加h2so4调节ph至1后用去离子水冲洗至中性。然后将浓缩液加入到阳离子树脂中，搅拌均匀，使树脂充分吸附后，通过漏斗过滤收集滤液；
(5)收集完的滤液使用h2so4调节ph至3左右，后用滤液3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，收集萃取液；
(6)然后60℃旋蒸萃取液，旋蒸至萃取液的20％；
(7)将旋蒸后的液体放于8℃冰箱进行低温结晶，结晶后，放于40℃烘箱中进行完全结晶，结晶后使用液相进行提取率的计算。
结果分析：每步提纯的液体用于进行hplc(高效液相色谱法，美国伯bio-rad伯乐aminexhpx-87h有机酸柱)检测，hplc检测中流动相为5mmh2so4，柱温为30℃，紫外检测器210nm，检测每步损失。最终收率达62.2％，纯度可达96.1％。
实施例5：发酵液中有机溶剂提取己二酸
按照以下方法提取实施例2的发酵液中的己二酸：
(1)上罐发酵液首先通过离心机离心去除菌体及杂质，收集发酵液清液；
(2)将发酵液清液通过截留分子量为3000的卷式膜过滤以除去大的蛋白及高分子杂质，收集超滤透过液；
(3)将超滤透过液80℃下旋蒸浓缩，将超滤透过液浓缩至超滤液的85％，收集浓缩液；
(4)将浓缩液使用732阳离子交换树脂进行吸附，将发酵液中的na+进行吸附，置换成h+，首先用去离子水将732阳离子交换树脂清洗3次，后用naoh调节ph至10，搅动半小时后，交去离子水冲洗直至ph中性后加h2so4调节ph至1后用去离子水冲洗至中性。然后将浓缩液加入到阳离子树脂中，搅拌均匀，使树脂充分吸附后，通过漏斗过滤收集滤液；
(5)收集完的滤液使用h2so4调节ph至3左右，后用滤液3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，收集萃取液；
(6)然后60℃旋蒸萃取液，旋蒸至萃取液的15％；
(7)将旋蒸后的液体放于4℃冰箱进行低温结晶，结晶后，放于20℃烘箱中进行完全结晶，结晶后使用液相进行提取率的计算。
结果分析：每步提纯的液体用于进行hplc(高效液相色谱法，美国伯bio-rad伯乐aminexhpx-87h有机酸柱)检测，hplc检测中流动相为5mmh2so4，柱温为30℃，紫外检测器210nm，检测每步损失。最终收率高达72.5％，纯度可达91.3％。
实施例6：发酵液中有机溶剂提取己二酸
省略步骤(2)的超滤步骤，其他步骤与实施例3一致，结果发现加入乙酸乙酯萃取时形成乳浊液，无法分层或者分层不明显，需要离心进一步分离，若离心还不行，则下步将无法进行，提取不能完成。这步省略不仅加倍了工作量，耗时，浪费乙酸乙酯。
实施例7：发酵液中有机溶剂提取己二酸
省略步骤(3)的浓缩步骤，其他步骤与实施例3一致，结果发现所有试剂的用量增加，工作处理量增加，由于每步处理量多，因此损失也会增加。
结果分析：每步提纯的液体用于进行hplc(高效液相色谱法，美国伯bio-rad伯乐aminexhpx-87h有机酸柱)检测，hplc检测中流动相为5mmh2so4，柱温为30℃，紫外检测器210nm，检测每步损失。最终收率高达45.3％，纯度可达87.6％。
实施例8：发酵液中半制备液相提取己二酸
(1)上罐发酵液首先通过离心机离心去除菌体及杂质，仅留下发酵液。
(2)卷式膜过滤以除去大的蛋白及高分子杂质。
(3)将过滤后的发酵液通过waters1525半制备液相进行收集。
结果分析：发酵液进行hplc(高效液相色谱法，watersxbrigec18)检测，hplc检测中流动相为a:meoh(80％)、b:h2o(20％)，梯度洗脱运行时间为25min，柱温为40℃，紫外检测器210nm，检测每步损失。最终收率高达83％，纯度可达100％。但是此方法耗时，需要使用较多的甲醇，成本较高。而且半制备液相需要人为操作，一般手动，耗费人力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。