从组织中分离胎盘间质细胞并培养成间充质干细胞的方法与流程

本发明涉及从胎盘中分离干细胞的方法，特别涉及从胎盘中分离间充质干细胞的方法，更特别的是涉及一种使用本发明所述独特配方的消化酶组合物从而从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法。使用本发明方法可以有效的提高从胎盘分离间充质干细胞的效率。
背景技术：
：间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(caplanai.mesenchymalstemcells.jorthopres.1991,9:641-650.pittengermf,mackayam,becksc,etal.multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中msc的含量极其稀少，每105～106个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。现有的从胎盘中分离干细胞从而建立胎盘干细胞库的方法尚有诸多缺点，例如纯度不足、和/或数量不高，进而显示出这些方法尚不能满足人们的期待。例如cn101270349a(中国专利申请号200810061267.6，公开日2008年9月24日)公开的题为“胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法”的发明；cn101693884a(中国专利申请号200910117522.9，公开日2010年4月14日)公开的题为“一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的发明；cn102146359a(中国专利申请号201110005964.1，公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的发明。另外，中国专利申请号201210044648x公开了一种从胎盘中分离间充质干细胞的方法。这些方法在提取物的纯度和/或回收率方面是有待进一步改善的。本领域仍然需要有新的从胎盘中分离干细胞的方法，特别是高效地从胎盘中分离间充质干细胞的方法。此外，本领域仍然需要的新的用于从胎盘中分离间充质干细胞方法中使用的消化酶组合物，以期提高从胎盘中分离间充质干细胞的方法效率。技术实现要素：本发明的目的是解决现有获取胎盘间充质干细胞方法的不足，提供一种实用、简单、高效的从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法并任选地建立胎盘干细胞库的方法。同时，本发明的另一目的在于为上述从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法提供一种消化酶组合物。本发明人发现采用特别的操作方法以及特别组方的消化酶组合物，所获得的细胞纯度高和/或细胞回收率高。本发明基于此发现而得以完成。因此，本发明第一方面提供了从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm3左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；[其中，所述的组织清洗液是包含1％双抗的0.9％生理盐水](2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的fbs以终止消化；[其中，所述的混合酶消化液中包含：15～30体积的hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的liberasemnp-s酶、0.2～2体积的dnai型酶(例如20～25体积的hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的liberasemnp-s酶、0.5～1体积的dnai型酶，例如22体积的hank’s平衡盐溶液、0.4体积的liberasemnp-s酶、0.7体积的dnai型酶)；所述liberasemnp-s酶例如是罗氏公司的liberasemnp-s酶，例如购自西宝生物，其货号：5578582001](3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加dmem-f12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的dmem-f12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；[此原代细胞的细胞悬液可以用sysmex血液分析仪进行细胞计数](4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；[其中，所述冻存液的配方为：65％的dmem-f12、15％的人血清白蛋白(hsa)、20％的dmso例如wak品牌的dmso](5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个t75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置co2培养箱(37℃，5％co2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm2时可进行接下来的传代；[其中，所述完全培养基是包含10％fbs的dmem-f12培养基](6)细胞传代：取p0代细胞用pbs清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm2，置co2培养箱(37℃，5％co2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从p0代至p1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行p1代至p2代、p2代至p3代、p3代至p4代、p4代至p5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中还包括：(7)针对步骤(6)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、hla-abc/dr配型。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中还包括：(8)将步骤(6)所得传代后的各代胎盘间充质干细胞于液氮中冻存。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中还包括：(9)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(8)的冻存细胞进行关联。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所得各代胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于90％。在一个实施方案中，所述胎盘间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于95％。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述hank's平衡盐溶液组成为：8.0g/l的nacl、0.4g/l的kcl、0.1g/l的mgso4·7h2o、0.1g/l的mgcl2·6h2o、0.06g/l的na2hpo4·2h2o、0.06g/l的kh2po4、1.0g/l的葡萄糖、0.14g/l的cacl2、0.35g/l的nahco3、0.2g/l的酚红、盐酸或氢氧化钠调节ph至7.4。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述混合酶消化液中除了包含hank's平衡盐溶液、liberasemnp-s酶、dnai型酶外，还添加有0.2～0.3g/l氯化锌。已经出人意料的发现，在使用添加此浓度范围氯化锌的混合酶消化液的情况下，所得原代细胞的cd73表达大于60％、cd45不表达，并且所得原代细胞中的间充质干细胞含量达60％-70％，显示极高的干细胞浓度；而当混合酶消化液中未添加此氯化锌时，原代细胞中的间充质干细胞含量小于38％，通常在31～38％范围内。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述细胞污染检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。在一个实施方案中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染：乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、eb病毒和梅毒、hbsag、hbsab、hbcab、hbeag、hbeab、hcvab、hiv-1/2ab、cmv-igm和ebv-iga、trust。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述hla-abc/dr配型是检测细胞hla-abc/dr表型。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中。根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括但不限于：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。此外，在本发明第一方面方法中，提供了一种胎盘间充质干细胞。因此本发明第二方面提供了一种胎盘间充质干细胞。根据本发明第二方面的胎盘间充质干细胞，其是根据本发明第一方面任一实施方案所述方法获得的。根据本发明第二方面的胎盘间充质干细胞，其各代的胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于90％。在一个实施方案中，所述胎盘间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于95％。进一步，本发明第三方面提供了一种在从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法中使用的混合酶消化液，该混合酶消化液中包含hank's平衡盐溶液、liberasemnp-s酶、dnai型酶。根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中包括：15～30体积的hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的liberasemnp-s酶、0.2～2体积的dnai型酶(例如20～25体积的hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的liberasemnp-s酶、0.5～1体积的dnai型酶，例如22体积的hank’s平衡盐溶液、0.4体积的liberasemnp-s酶、0.7体积的dnai型酶)。根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述hank's平衡盐溶液组成为：8.0g/l的nacl、0.4g/l的kcl、0.1g/l的mgso4·7h2o、0.1g/l的mgcl2·6h2o、0.06g/l的na2hpo4·2h2o、0.06g/l的kh2po4、1.0g/l的葡萄糖、0.14g/l的cacl2、0.35g/l的nahco3、0.2g/l的酚红、盐酸或氢氧化钠调节ph至7.4。根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中除了包含hank's平衡盐溶液、liberasemnp-s酶、dnai型酶外，还添加有如本文所述规定量的氯化锌。已经出人意料的发现，在使用添加此浓度范围氯化锌的混合酶消化液的情况下能够呈现如本发明所述优异技术效果。根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：(1)胎盘小叶的处理：将胎盘置于白瓷盘中，用组织清洗液冲洗以去除胎盘瘀血，剪取20g胎盘小叶组织于钢杯中，使用组织清洗液清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g较好的组织于100mm玻璃皿中；加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm3左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再反复此操作以用组织清洗液清洗两次从而除去血细胞；[其中，所述的组织清洗液是包含1％双抗的0.9％生理盐水](2)混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入37℃预热的15～30ml(例如20～25ml，例如23ml)混合酶消化液中充分混匀后，摇床37℃、100rpm振荡消化30min，消化结束后，向组织液中添加2ml的fbs以终止消化；[其中，所述的混合酶消化液中包含：15～30体积的hank’s平衡盐溶液、0.2～0.6体积的liberasemnp-s酶、0.2～2体积的dnai型酶(例如20～25体积的hank’s平衡盐溶液、0.3～0.5体积的liberasemnp-s酶、0.5～1体积的dnai型酶，例如22体积的hank’s平衡盐溶液、0.4体积的liberasemnp-s酶、0.7体积的dnai型酶)；所述liberasemnp-s酶例如是罗氏公司的liberasemnp-s酶，例如购自西宝生物，其货号：5578582001](3)收集原代细胞：向上一步骤所得组织液中添加50ml组织清洗液，混匀，300目过滤，收集细胞液；如此反复两次洗涤消化后的组织，两次的滤液合并至离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加dmem-f12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的dmem-f12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；[此原代细胞的细胞悬液可以用sysmex血液分析仪进行细胞计数](4)原代细胞冻存：使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml，重悬后缓缓加入冻存液10ml，边加边摇匀；将所得细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml，置预冷的程序降温盒中，使用程序降温仪器程序降温，再将细胞转入液氮存储罐中冻存；[其中，所述冻存液的配方为：65％的dmem-f12、15％的人血清白蛋白(hsa)、20％的dmso例如wak品牌的dmso](5)细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个t75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置co2培养箱(37℃，5％co2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm2时可进行接下来的传代；[其中，所述完全培养基是包含10％fbs的dmem-f12培养基](6)细胞传代：取p0代细胞用pbs清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm2，置co2培养箱(37℃，5％co2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从p0代至p1代的细胞传代；依次重复上述操作以分别进行p1代至p2代、p2代至p3代、p3代至p4代、p4代至p5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法中还包括：(7)针对步骤(6)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、hla-abc/dr配型。根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法中还包括：(8)将步骤(6)所得传代后的各代胎盘间充质干细胞于液氮中冻存。根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法中还包括：(9)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(8)的冻存细胞进行关联。根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述细胞污染检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。在一个实施方案中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染：乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、eb病毒和梅毒、hbsag、hbsab、hbcab、hbeag、hbeab、hcvab、hiv-1/2ab、cmv-igm和ebv-iga、trust。根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述hla-abc/dr配型是检测细胞hla-abc/dr表型。根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中。根据本发明第三方面任一实施方案的混合酶消化液，其中所述从胎盘组织中分离间质细胞并培养成间充质干细胞的方法中所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括但不限于：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。在本发明中，术语“胎盘间充质干细胞”是指来源于胎盘的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“胎盘间充质干细胞”可以与“胎盘干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。在本发明中，术语“pbs缓冲液”或者“pbs”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的pbs的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如ph值或ph范围，并且这些pbs缓冲液通常是可以通过商业途径获得的预配液(或预配粉)，例如用于本发明领域的pbs通常是ph7.4(±0.1)的商品化缓冲液，例如hyclone品牌的pbs缓冲液；本领域经典的应用时的pbs缓冲液组成中包括137mm氯化钠、2.7nm氯化钾和10mm磷酸根，在本发明中如未另外特别说明，所用pbs使用时的组成均为该组成。在本发明中，术语“胎盘”是指新生儿胎盘，特别是指产后4小时之内的胎盘。本发明的发明人曾利用灌流法从胎盘中分离培养间充质干细胞，获得了纯度很高的间充质干细胞。但是经过灌流后仍然会有大量干细胞滞留在胎盘组织中，不能有效地被分离出来。因此可以认为，采用灌流法不能最大限度的得到间充质干细胞。本发明公开了一种从胎盘中大量分离间充质干细胞的方法，并利用这种方法保存胎盘间充质干细胞并建立胎盘干细胞库。本发明的发明人在总结以往分离培养间充质干细胞的基础上，利用多种组织消化酶混合消化胎盘小叶组织块，结合贴壁培养法，成功自胎盘中分离得到大量间充质干细胞。本发明方法得到的间充质干细胞纯度高、数量多，具有与骨髓间充质干细胞相同的生物学特性，能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞等分化。由于胎盘中干细胞较成体干细胞幼稚，含量丰富，在临床上具有广泛的应用前景，我们运用常规的细胞冻存方法将间充质干细胞像脐血一样冻存起来，建立胎盘干细胞库，为以后干细胞的深入研究和临床治疗奠定基础。由于脐血中含有丰富的造血干细胞，人们建立脐血库把脐血造血干细胞这一重要的生物资源储存起来，为多种血液系统疾病和免疫系统疾病提供一种治疗手段。同样胎盘间充质干细胞作为一种更加重要的干细胞资源，我们运用常规的细胞冻存方法将其冷冻在-196摄氏度的深低温液氮中长期保存，建立胎盘干细胞库，为日后的干细胞治疗保存种子。特别需要说明的是，通过本发明方法，可以在p0代获得间充质干细胞纯度极高的原代细胞，这些原代细胞的cd73表达大于60％、cd45不表达，并且这些原代细胞中间充质干细胞含量达60％-70％。本发明的方法的技术效果是显而易见的。例如，本发明选取足月的胎盘样本，剪取胎盘小叶特定位置组织15g，用一种混合酶体系将之消化，得到细胞后进行提纯，即可得到一群较纯的间质细胞(cd73表达大于60％，cd45不表达)，每克组织获取细胞数可达2.5×107，且得率稳定，大大降低了样本特异性。将该批原代间质细胞冻存后复苏培养，使用经典的完全培养基配方进行培养，4天左右即可镜检到较多纺锤型贴壁细胞，10天细胞融合率达到70-80％，即可传到p1代。连续传代至p5代后，进行流式表型鉴定，细胞周期检测和诱导分化等实验，结果表明p1-p5代细胞均为间充质干细胞，阳性表达(cd73，cd90，cd105)大于98％，阴性表达(cd34，cd45，cd19，cd11b，hla-dr)小于2％；p5代细胞g2期细胞小于1％，增殖能力强，未进入分裂期；在特异性诱导培养基刺激下，有向成骨细胞，成脂细胞，成软骨细胞分化的能力。本发明操作简单，方便实用，能得到大量的间充质干细胞，分化性能好，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞等细胞分化的能力。与现有方法的比较：目前msc主要采用手术法抽取供者骨髓或灌流法分离胎盘，贴壁培养获得。该法分得细胞数量少，而且供者在取髓中和取髓后均有感染的可能。本发明成功自胎盘中分离获得大量纯度较高的间充质干细胞，并运用此法建立胎盘干细胞库来储备这种极具应用前景的干细胞。该法简便易行，且由于胎盘与脐血一样，细胞成份较幼稚，来源广泛，方便易得，因此本发明的方法在干细胞的临床应用上将具有广泛的前景。附图说明图1：本发明所得原代细胞的流式表型鉴定结果图。图2：样本在p0传代过程中的显微图。图3：样本在p5传代过程中的显微图。图4：样本在p5代流式表型鉴定结果。图5：样本p5代细胞的dna含量-细胞数关系图。图6：p5代细胞的诱导分化测试，显示其具有向成骨、成脂、成软骨细胞分化的能力。具体实施方式通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。实施例1、胎盘全细胞处理：1、混合合酶消化液的预配制：分别移取22ml含钙镁离子的hbss(hank's平衡盐溶液)、0.4ml罗氏liberasemnp-s酶(例如购自西宝生物，货号：5578582001)、0.7ml的dnai型酶于50ml离心管中，再添加氯化锌(添加浓度为0.2g/l、0.25g/l、或0.3g/l)，混均，37℃预热20min以上。所述hank's平衡盐溶液组成为：8.0g/l的nacl、0.4g/l的kcl、0.1g/l的mgso4·7h2o、0.1g/l的mgcl2·6h2o、0.06g/l的na2hpo4·2h2o、0.06g/l的kh2po4、1.0g/l的葡萄糖、0.14g/l的cacl2、0.35g/l的nahco3、0.2g/l的酚红、盐酸或氢氧化钠调节ph至7.4。2、胎盘小叶的准备：从采集袋中取出胎盘于白瓷盘中，组织清洗液冲洗后，去除胎盘瘀血，剪取少量胎盘小叶组织(20g左右)于钢杯中。使用组织清洗液(0.9％生理盐水+双抗(双抗为青链霉素，含量1％))清洗两遍，并浸泡5min后，称取15g±1g较好的组织于100mm玻璃皿中。3、血细胞的去除：加10ml组织清洗液，剪碎小叶至0.2cm3左右大小，加100ml组织清洗液搅匀后300目滤网过滤，再用组织清洗液清洗两次(每次将小叶组织移到钢杯中加100ml组织清洗液搅匀后，300目过滤)。4、混合酶消化及终止：将清洗后的小叶组织加入已预热的23ml混合酶消化液中充分混匀后，摇床37度100rpm振荡消化30min。消化结束后，组织液+2mlfbs终止。5、原代细胞的收集：加50ml组织清洗液稀释混匀组织液，300目过滤，收集细胞液，两次洗涤消化后的组织(每次使用50ml组织清洗液)，滤液合并至1只250ml离心管中，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，加适量组织清洗液重悬并补充至200ml，1500rpm离心8min(加速度9，减速度7)；移去上清，细胞沉淀加dmem-f12重悬至30ml，100um滤网过滤后，再用10ml的dmem-f12冲洗滤网，得40ml细胞悬液，作为原代细胞；取1ml悬液，用于sysmex血液分析仪进行细胞计数，经测定，该原代细胞纯度较高，间充质干细胞含量约为60％-70％。6、原代细胞冻存：现配冻存液，冻存液的配方为：65％的dmem-f12、15％的人血清白蛋白(hsa)、20％的dmso例如wak品牌的dmso，现用现配；使细胞悬液1800rpm，离心10min(加速度9，减速度7)，留取细胞沉淀及下液5ml(另上清10ml留样)，重悬后缓缓加入已配制的冻存液，边加边摇匀；将细胞悬液分装至9只2ml冻存管中，每管1.5ml(程序降温盒预冷)。剩余细胞悬液+留样上清用于无菌检测；使用程序降温仪器程序降温，细胞转入液氮存储罐中，对所得原代细胞进行冻存。通过上述实施例1的胎盘全细胞处理过程，选取足月的胎盘样本，剪取胎盘小叶特定位置组织15g，用所述的混合酶消化液体系将之消化，得到细胞后进行提纯，即可得到一群较纯的原代间质细胞(cd73表达大于60％，cd45不表达)，这些原代细胞中的间充质干细胞含量达60％-70％，每克胎盘小叶组织获取的原代细胞数可达(2.4～2.8)×107个，且得率稳定，大大降低了样本特异性。然而，当所述混合酶消化液中未添加此氯化锌时，原代细胞中的间充质干细胞含量小于38％，通常在31～38％范围内，并且每克胎盘小叶组织获取的原代细胞数小于5×105个；另外，本发明人在参照其它现有技术进行原代细胞制备时发现每克胎盘小叶组织获取的原代细胞数小于2×106个，是本发明方法的1/10以下。本发明上述对胎盘进行全细胞处理能够高效的获得原代的间质细胞，为其后续传代培养成具有极高医学价值的间充质干细胞奠定良好的基础。例如，在本实施例中，胎盘组织处理后细胞得率非常稳定，一些试验的典型数据见表1。表1：从胎盘组织获取原代细胞的细胞收率处理日期样本注册号组织量(g)细胞数(×108)细胞得率(108/g)2016.7.229004116082279153.80.252016.7.25900411608230115.93.90.252016.7.26900411608231114.93.80.262016.7.27900411608231914.93.80.262016.8.259004116082539153.750.25另外，上述胎盘处理后所得原代细胞流式表型鉴定结果显示cd73表达高达60％以上，cd45不表达，表明原代细胞是一群比较纯的间质细胞，不含血细胞。流式表型鉴定结果如图1所示。实施例2、原代细胞复苏和传代培养1、细胞复苏：取2管冻存的细胞，37℃快速解冻，将细胞移至15ml离心管，加8ml完全培养基点滴复苏；如未另外说明，本文所用的完全培养基是包含10％fbs的dmem-f12培养基；接着1200rpm离心5min(加速度9，减速度7)后，去上清，加5ml完全培养基重悬；每管细胞接种于1个t75培养瓶中，补充完全培养基至30ml，置co2培养箱(37℃，5％co2，饱和湿度)中培养；每隔3-4天用完全培养基进行一次全换液，复苏12天后根据克隆形成情况进行计数，至细胞密度不低于3000个细胞/cm2时可进行接下来的传代；2、细胞传代：取复苏后的p0代细胞用pbs清洗，加2ml胰酶消化2-5min，直至细胞大部分脱落，加5ml完全培养基终止消化，使细胞转移至离心管中，1400rpm离心5min(加速度9，减速度7)，弃上清，加5ml完全培养基重悬后计数接种至培养瓶，细胞密度为8000～12000个细胞/cm2，置co2培养箱(37℃，5％co2，饱和湿度)中培养至细胞密度达90％以上(通常培养5天左右)，完成从p0代至p1代的细胞传代；依次重复上述p0代至p1代的传代操作，以分别进行p1代至p2代、p2代至p3代、p3代至p4代、p4代至p5代的细胞传代，得到各代间充质干细胞。在本实施例中原代接种密度约为5×105cells/cm2，接种4天镜检视野内有很多贴壁细胞，呈纺锤型。接种后10天即可传至p1代。细胞生长速度快，量多，形态呈梭形，饱满。从p0代至p1代的传代过程中，一些试验的细胞计数示意性结果如下表2所示。其中ps162279样本在传代过程中的显微图如图2所示。表2：p0代至p1代的传代过程中的细胞计数结果样本注册号p0-p1p0计数ps162311d108*105(adam)ps162319d101.4*106(adam)ps162279d91.5*106(adam)另外，在p1-p5接种传代过程中，通常培养4～5天即收获并传代至下一代。示例性的，ps162279样本在p5传代过程中的显微图如图3所示。在本试验中，进行了p1-p5代的流式表型鉴定，结果显示，cd73、cd90、cd105阳性表达均>98％，同时鉴定了cd34、cd45、cd19、hla-dr，结果如表3所示，这些结果证明胎盘中分离培养出的细胞为间充质干细胞，且纯度高。表3：p1-p5代细胞的流式表型鉴定结果示例性的，ps162279样本p5代流式表型鉴定结果如图4所示。另外，针对一些样本的p5代细胞测定它们的生长周期，结果显示g2期细胞<1％，s期细胞>10％，证明这些细胞增殖能力强，未进入分裂期，具体结果见表4。表4：p5代细胞生长周期测定结果样本注册号go/g1期s期g2/m期ps162311-p584.60％14.80％0.64％ps162319-p582.30％16.80％0.93％ps162279-p587.00％11.90％0.80％另外，针对ps162311-p5细胞，绘制其dna含量-细胞数关系图，典型的结果显示于图5实施例3、胎盘msc的生物学特性鉴定参照已经授权的专利cn102676451a之[0062]至[0089]的方法进行胎盘间充质干细胞的生物学特性鉴定，结果显示，应用本发明方法分离得到的msc，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化的能力，证实本发明方法获得的msc具有干细胞特性。例如，示例性的，对p5代细胞进行诱导分化测试，结果显示这些细胞具有向成骨、成脂、成软骨细胞分化的能力。典型的成脂分化、成骨分化、和成软骨分化的显微图见图6。实施例4、胎盘干细胞库的建立1、细胞活性的检测利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。2、细胞污染的检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。利用病原学方法，检测细胞是否受到乙肝两对半、丙肝、艾滋、巨细胞病毒、eb病毒和梅毒、hbsag、hbsab、hbcab、hbeag、hbeab、hcvab、hiv-1/2ab、cmv-igm和ebv-iga、trust感染。3、遗传病的检测利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。4、hla-abc/dr配型检测细胞hla-abc/dr表型，并记录在案。5、细胞来源的调查记录胎儿及其父母的详细资料，并记录在案。6、胎盘干细胞数据库的建立在保存正常的胎盘干细胞后，建立胎盘干细胞的数据库，其中包括前六项资料，并建立与冻存细胞的关联。当前第1页12