用于检测10项呼吸道感染病原体的试剂盒及其使用方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于检测10种呼吸道感染病原体的试剂盒及其使用方法。

背景技术：

呼吸道感染是世界范围内最常见的疾病之一，发病率在各国居民发病率总体结构中占主要地位，每年流行高峰期约有10％的居民患有呼吸道感染。呼吸道感染会导致鼻炎、流涕、鼻塞、咳嗽、轻度咽炎、全身发热等症状，严重的会导致呼吸困难甚至死亡。急性呼吸道感染已经成为国内外儿童重要感染性疾病之一，其发病率已居儿童各类疾病的首位。引起儿童呼吸道感染的病原体主要有病毒、细菌、支原体和衣原体等，快速和准确的诊断以及适当的治疗，是减少儿童住院和不必要的抗菌药物使用的重要前提。因此，呼吸道病原体的快速检测，对临床早期诊断有着非常重要的意义。

微流控芯片(microfluidics)或称芯片实验室(lab-on-a-chip)是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备，生物与化学反应，分离、检测等基本操作单元或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。这种技术原则上适用于从核酸、蛋白质直到有机、无机小分子的各种不同类型分子的反应、分离和检测。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点,它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析,并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程。

目前市场上针对呼吸道感染病原体的检测方法主要有荧光pcr法、免疫法和细菌培养法。荧光pcr法是在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr进程进行实时监测，定性或定量检测目的基因；免疫法是通过抗原抗体发生特异性结合来检测目的蛋白；细菌培养法是把病原体细菌在特定培养基上进行培养，再对产生的细菌菌落进行观察检测。

普通荧光pcr检测试剂虽然具有较好的灵敏度和特异性，但是多是针对单项或几项病原体，想要检测多种病原体就要采用多套不同的检测试剂盒搭配，操作不便且成本较高；而免疫法检测试剂虽然可以同时检测多项病原体，但是由于免疫法检测的是样本中病原体引起机体产生的特异性抗体，因此存在一个较长的空窗期，并且灵敏度相对较低；而对于细菌类病原体的检测，采用细菌培养法虽然准确率高，但是耗时较长，培养效果差，很多细菌无法培养，延误了最佳治疗时机。

技术实现要素：

本发明针对10种常见的呼吸道感染病原体，包括肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、鼻病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、合胞病毒、副流感病毒等的基因特异性保守序列设计引物探针，提供一种实时荧光pcr检测方法，低成本快速检测10种病原体的基因，能够对痰液和咽拭子样本中提取的核酸进行检测。

为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

用于检测10种呼吸道感染病原体的试剂盒，包括有用于扩增如下10种呼吸道病原体的引物和taqman探针：肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)、肺炎衣原体(chlamydophilapneumoniae)、嗜肺军团菌(legionellapneumophila)、百日咳杆菌(bordetellapertussis)、鼻病毒(humanrhinovirus)、呼吸道腺病毒(adenovirus)、甲型流感病毒(influenzaavirus)、乙型流感病毒(influenzabvirus)、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)和副流感病毒(humanparainfluenzavirus)。

进一步地，所述引物的序列为：肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)，seqidno.1-2；肺炎衣原体(chlamydophilapneumoniae)，seqidno.4-5；嗜肺军团菌(legionellapneumophila)，seqidno.7-8；百日咳杆菌(bordetellapertussis)，seqidno.10-11；鼻病毒(humanrhinovirus)，seqidno.13-14；呼吸道腺病毒(adenovirus)，seqidno.16-17；甲型流感病毒(influenzaavirus)，seqidno.19-20；乙型流感病毒(influenzabvirus)，seqidno.22-23；呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)，seqidno.25-26；副流感病毒(humanparainfluenzavirus)，seqidno.28-29；

所述taqman探针的序列为：肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)，seqidno.3；肺炎衣原体(chlamydophilapneumoniae)，seqidno.6；嗜肺军团菌(legionellapneumophila)，seqidno.9；百日咳杆菌(bordetellapertussis)，seqidno.12；鼻病毒(humanrhinovirus)，seqidno.15；呼吸道腺病毒(adenovirus)，seqidno.18；甲型流感病毒(influenzaavirus)，seqidno.21；乙型流感病毒(influenzabvirus)，seqidno.24；呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)，seqidno.27；副流感病毒(humanparainfluenzavirus)，seqidno.30。

进一步地，所述引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nm；所述taqman探针在扩增体系中的终浓度为50-500nm。

进一步地，所述试剂盒还包括rt-pcrbuffer、混合酶液和阳性质控品。

进一步地，所述rt-pcrbuffer包括pcr缓冲液、datp、dutp、dctp、dgtp和mgcl2。

进一步地，所述混合酶液包括hotstarttaq酶、逆转录酶和ung酶。

进一步地，所述阳性质控品中含有对应上述10项呼吸道病原体的扩增基因序列的质粒。

上述用于检测10种呼吸道感染病原体的试剂盒的使用方法，是将样品dna/rna共提取模板2μl、rt-pcrbuffer20μl、混合酶液1μl和引物探针混合液2μl混合进行pcr扩增反应；

pcr扩增反应的条件为：50℃逆转录15-30min；92-97℃预变性1-10min；92-97℃变性10-15s；58-62℃退火3-50s；40-45个循环。

有益效果：

本发明的试剂盒采用taqman探针荧光pcr技术，针对10种常见的呼吸道感染病原体进行检测，能够在2小时内获得检测结果，特异性强，灵敏度可达100copies/μl。

本发明采用了ung酶/dutp防污染体系，能减少前次pcr反应产物带来的污染干扰。

本发明将逆转录酶与hotstarttaq酶混合在一个pcr反应管中使用，先进行逆转录过程合成出cdna，再进行pcr扩增，没有添加随机引物，过程一步完成，无需开盖，既能减少实验操作步骤，节省时间，同时还避免了开盖操作可能带来的样本污染。

本发明所使用的探针为5’端fam标记的taqman探针，探针两端分别标记荧光报告基团(r)和荧光淬灭基团(q)的寡核昔酸。在探针完整时，即随机状态和无pcr产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在荧光pcr扩增过程中，当特异的pcr产物与taqman探针发生杂交反应时hotstarttaq酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。pcr每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板rna的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。

综上所述，本发明与普通荧光pcr法、免疫法和细菌培养法等相比，具有以下优势：

1.特异性强：本发明的引物探针针对10种常见呼吸道感染病原体的特异性保守区域序列设计，特异性强。

2.敏感性高：本发明能检测到100copies/μl浓度的目的基因序列。

3.通量高：本发明能够同时检测10种常见呼吸道感染病原体。

4.检测过程为闭管反应，并将逆转录过程和pcr扩增过程结合，减少实验步骤，并大大降低了污染及结果偏差的可能性。

5.操作简单快速，从标本送检到得出结果可在3个小时以内完成。

6.结果判读明确、客观；若需要亦可对结果进行定量分析。

7.安全：整个体系中不包含有毒有害物质，无需pcr产物的后处理，对操作员和环境都无危害。

附图说明

图1为本发明的样本pcr扩增曲线图，其中1为基线，2为阴性对照，3为需要重新检测的样本，4为阳性质控品，5为三个阳性结果的样本；

图2为本发明试剂盒检测肺炎支原体的灵敏度试验结果图；

图3为本发明试剂盒检测肺炎衣原体的灵敏度试验结果图；

图4为本发明试剂盒检测嗜肺军团菌的灵敏度试验结果图；

图5为本发明试剂盒检测百日咳杆菌的灵敏度试验结果图；

图6为本发明试剂盒检测鼻病毒的灵敏度试验结果图；

图7为本发明试剂盒检测呼吸道腺病毒的灵敏度试验结果图；

图8为本发明试剂盒检测甲型流感病毒的灵敏度试验结果图；

图9为本发明试剂盒检测乙型流感病毒的灵敏度试验结果图；

图10为本发明试剂盒检测呼吸道合胞病毒的灵敏度试验结果图；

图11为本发明试剂盒检测副流感病毒的灵敏度试验结果图；

图12为本发明试剂盒检测肺炎支原体的特异性试验结果图；

图13为本发明试剂盒检测肺炎衣原体的特异性试验结果图；

图14为本发明试剂盒检测嗜肺军团菌的特异性试验结果图；

图15为本发明试剂盒检测百日咳杆菌的特异性试验结果图；

图16为本发明试剂盒检测鼻病毒的特异性试验结果图；

图17为本发明试剂盒检测呼吸道腺病毒的特异性试验结果图；

图18为本发明试剂盒检测甲型流感病毒的特异性试验结果图；

图19为本发明试剂盒检测乙型流感病毒的特异性试验结果图；

图20为本发明试剂盒检测呼吸道合胞病毒的特异性试验结果图；

图21为本发明试剂盒检测副流感病毒的特异性试验结果图。

具体实施方式

实施例1

用于检测10种呼吸道感染病原体的试剂盒，该试剂盒由引物探针混合液、rt-pcrbuffer、混合酶液、阳性质控品和无rnase水组成；rt-pcrbuffer包括pcr缓冲液、datp、dutp、dctp、dgtp和mgcl2；混合酶液包括hotstarttaq酶、逆转录酶和ung酶；阳性质控品中含有对应上述10项呼吸道病原体的扩增基因序列的质粒。

所述引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nm；所述探针在扩增体系中的终浓度为50-500nm。

该试剂盒的反应体系为25μl，具体为：核酸模板2μl、rt-pcrbuffer20μl、混合酶液1μl和引物探针混合液2μl。

试剂盒的操作和结果判定

(1)将样品dna/rna共提取模板(从人的痰液、咽拭子等中提取)、无rnase水、阳性质控品各2μl分别加入不同的pcr反应管中，并向各管中加入rt-pcrbuffer20μl、混合酶液1μl和引物探针混合液(1-10)2μl，配成体系，盖好管盖，放入荧光定量pcr仪中进行荧光pcr检测。

(2)设置仪器中的pcr扩增反应的条件为：50℃逆转录30min；92℃预变性10min；94℃变性15s；58℃退火40s；40个循环。

(3)反应完成后，基线设定为自动调整，根据扩增曲线图和ct值对检测结果进行分析。

(4)有效性判定：

无rnase水检测出的ct值为undet或40，且阳性质控品检测出的ct值≤35，否则实验视为无效；

(5)结果判读：

样本检测孔ct值为undet或40，该样本结果判断为阴性，样本rna提取失败、待测样本中不含rna或含量低于检测限；

样本检测孔ct值≤35，该样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；

样本检测孔ct值为35-40，需要复检一次，如果ct值仍为35-40，则判断为阴性。

图1为本发明的pcr扩增曲线图，其中1为基线，2为阴性对照，3为需要重新检测的样本，4为阳性质控品，5为三个阳性结果的样本。阳性质控品4检出扩增曲线，且ct值＜35，阴性对照2无扩增曲线，表明结果有效；样本3扩增曲线的ct值＞35，建议重新检测；样本5均有扩增曲线，且ct值＜35，判定为阳性结果。

实施例2

用本试剂盒分别检测对应的病原体质粒样本，按照稀释浓度10⁵copies/μl、10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10copies/μl五个梯度进行灵敏度试验。按照与实施例1相同的方法进行检测。

检测结果表明本发明试剂盒灵敏度良好，并且ct值随浓度减少呈梯度改变，结果见图2-11。

试验结果表明本试剂盒对于呼吸道病原体肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、鼻病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、合胞病毒、副流感病毒的诊断具有高度的灵敏性，各项目检测灵敏度均能达到100copies/μl。

实施例3

用本试剂盒分别检测肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、鼻病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、合胞病毒、副流感病毒等样本。按照与实施例1相同的方法进行检测。

检测结果表明本发明试剂盒仅能检测出检测试剂对应的病原体，不会检测到其他病原体。

试验结果表明本试剂盒对于呼吸道病原体肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、鼻病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、合胞病毒、副流感病毒的检测特异性强，不与其他病原体的核酸发生交叉反应，结果见图12-21。

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<110>苏州岚轩生物科技有限公司

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