亨利兜兰EST‑SSR标记引物、其开发方法及其应用与流程

本发明涉及基于亨利兜兰(paphiopedilumhenryanum)转录组序列开发的est-ssr标记引物、其开发方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术：

亨利兜兰属于兰科(orchidaceae)兜兰属(paphiopedilum)植物，原产我国广西西南部、云南东南部及越南北部，生长于海拔900-1300m的石灰岩地区隐蔽缝隙中或常绿阔叶林和灌木林中多石或排水良好之地。现所有兜兰属植物均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录一名录而被禁止贸易。兜兰作为一种濒危物种，其遗传多样性的研究变得十分重要，兜兰的保育工作更加刻不容缓。

简单重复序列(simplesequencerepeat，ssr)标记因具有多态性高，重复性好，特异性强，检测方便，共显性，标记覆盖整个基因组且均匀分布等特点，已成为遗传多样性分析中很重要的一种遗传标记之一(phuekvilai，prattana&pongtongkam，pradit&peyachoknagul，surin“developmentofmicrosatellitemarkersforvandaorchid，”kasetsartjournal-naturalscience，2009，43(3)：497-506；kaliark，raimk，kalias等，“microsatellitemarkers：anoverviewoftherecentprogressinplants，”euphytica，2011，177(3)：309-334)。与基因组ssr标记相比，est-ssr来源于表达基因组区域，可为功能基因提供“绝对”的标记，开发成本低，物种间通用性较高(朱振东，贾继增，“小麦ssr标记的发展及应用”，《遗传》，2003，(03)：355-360；varshney，r.k.等，“interspecifictransferabilityandcomparativemappingofbarleyest-ssrmarkersinwheat，ryeandrice，”plantscience，2005.168(1)：第195-202页)。近年来测序技术不断发展，转录组测序技术(rna-seq)为发现新转录本和基因表达丰度及ssr位点的发掘提供了机遇(zhangh，weil，miaoh，等，“developmentandvalidationofgenic-ssrmarkersinsesamebyrna-seq，”bmcgenomics，2012，13(1)：316-316；noakesag，bestt，statonm等，“crossamplificationof15est-ssrmarkersinthegenusfraxinus，”conservationgeneticsresources，2014，6(4)：969-970；adalam，demissieza，mahmoudss等，“identification，validationandcross-speciestransferabilityofnovellavandulaest-ssrs，”planta，2015，241(4)：987-1004)，对于非模式生物或者是无全基因组测序的生物，利用转录组测序开发具有基因信息的ssr标记来分析生物的遗传多样性也是一种简单高效的研究方法，该方法在兰花中也多次报道(tsaicc，shihhc，wanghv，linys，changch等，“rna-seqssrsofmothorchidandscreeningformolecularmarkersacrossgenusphalaenopsis(orchidaceae)，”plosone，2015，10(11)：e0141761)。然而迄今为止，兜兰属植物est-ssr标记的研究尚未见报道。

因此，利用亨利兜兰转录组序列信息开发est-ssr引物，将会对亨利兜兰及兜兰属尤其是兜兰亚属其它种的种质资源遗传多样性、亲缘关系分析、重要性状基因定位、分子标记辅助育种以及兜兰属植物相关的分子研究等起重要推动作用。

技术实现要素：

本发明公开了一组基于亨利兜兰转录组序列开发的est-ssr标记引物组，包括34对引物，所述引物的核苷酸序列如序列表seqidno.1～seqidno.68所示。本发明还公开了包含本发明所述的亨利兜兰est-ssr标记引物的试剂。本发明进一步公开了用于开发亨利兜兰est-ssr标记引物的方法，包括：(a)基于亨利兜兰花器官转录组测序拼接得到的unigenes的序列数据设计est-ssr引物；(b)提取亨利兜兰植物样品基因组dna；(c)利用步骤(a)得到的est-ssr引物，以步骤(b)所得dna为模板进行pcr；(d)将步骤(c)所得pcr产物进行电泳，并对电泳结果进行分析，从而筛选出具有期望特性的亨利兜兰est-ssr引物。本发明提供的亨利兜兰est-ssr标记引物具有诸多优势，例如多态性丰富、可重复性好、扩增稳定以及便于统计等，可用于亨利兜兰和其兜兰属尤其是兜兰亚属其它种的种质资源遗传多样性分析、分子标记辅助育种以及兜兰属植物相关的分子研究。

本发明的第一方面提供如下表1所示的基于亨利兜兰转录组序列开发的est-ssr引物对：

表1亨利兜兰est-ssr多态性引物信息

上述引物的序列编号分别为seqidno.1～seqidno.68。

在一个实施方案中，本发明所述的亨利兜兰est-ssr引物对中的任一条引物可以被可检测地标记。标记方法是本领域熟知的。所述标记包括本领域常用的那些，例如，所述标记包括但不限于荧光标记、同位素标记等。优选地，所述标记是荧光标记。在进一步地实施方案中，所述引物对中的正向引物被标记。在另外的实施方案中，所述引物对中的反向引物被标记。

在一个实施方案中，本发明所述的亨利兜兰引物对中的引物可由于一个或多个核苷酸的插入、缺失、替换或本领域技术人员已知的修饰手段进行修饰而发生变化，从而提高所述引物的特异性、用于同属或同种其他植物的分子生物学研究、或获得其它期望的性能。

本发明的第二方面提供了基于亨利兜兰转录组序列开发的一组est-ssr引物，所述引物组包括本发明上述引物对的任意组合。

本发明的第三方面提供了通过本发明所述的引物对或引物组从亨利兜兰基因组分离得到的dna片段或基因产物，即est-ssr标记。这些est-ssr标记可用于亨利兜兰和其它兜兰种质资源遗传多样性分析、分子标记辅助育种以及兜兰属植物相关的分子研究。尤其地，由于这些est-ssr标记来源于dna的转录区域，与功能基因相关，因此可用于分子标记辅助育种的相关研究如遗传连锁图构建、重要性状相关标记关联分析、分离和鉴定新基因等。

本发明还提供利用本发明所述的est-ssr引物构建的亨利兜兰、兜兰属其它植物甚至兰科植物的ssr指纹图谱。

本发明的第四方面提供了用于分离亨利兜兰est-ssr标记的试剂，所述试剂包含本发明所述的任何一对引物或一组引物。

在一个实施方案中，本发明所述的试剂包含如上所述的一组引物，其中所述引物组中的每一对引物被单独包装。

本发明的第四方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明如上所述的试剂。

本发明的第四方面提供了一种基于亨利兜兰转录组序列开发est-ssr引物的方法，所述方法包括：

(a)基于亨利兜兰花器官转录组测序拼接得到的unigenes的序列数据设计est-ssr引物；

(b)提取亨利兜兰植物样品基因组dna；

(c)利用步骤(a)得到的est-ssr引物，以步骤(b)所得dna为模板进行pcr；

(d)将步骤(c)所得pcr产物进行电泳，并对电泳结果进行分析，从而筛选出亨利兜兰est-ssr引物。

在一个实施方案中，所述步骤(a)如下进行：将亨利兜兰花器官转录组测序拼接得到unigenes的序列数据；运用microsatelliteidentificationtool(misa)软件查找各个unigene中可能存在的ssr位点(thiel，t.，michalek，w.，varshney，r.k.和graner，a.，“exploitingestdatabasesforthedevelopmentandcharacterizationofgene-derivedssr-markersinbarley(hordeumvulgarel.)，”theoreticalandappliedgenetics，2003，106，411-422)，ssr位点的查找的标准是：二、三、四、五和六核苷酸的重复序列基序的次数分别不小于7、5、5、5和5次；运用primer3软件基于ssr位点两翼的序列设计ssr引物。

在一个实施方案中，引物设计的筛选策略为：长度在17～24bp之间(最适20bp)，熔解温度(tm)在55～62℃之间，pcr扩增产物大小在100～350bp之间，含有的gc比例在40％～60％之间(最适为50％)，其他为默认设置。以最接近设计要求的引物组合作为ssr位点的引物。

在一个实施方案中，所述步骤(b)包括用改良的ctab法批量提取样品dna，具体操作如下：

①用液氮将亨利兜兰的叶片研磨成粉末，加入65℃预热的ctab(含β-巯基乙醇v/v1％)；

②在65℃水浴1h；

③取出冷却至室温(或放入冰箱)，加入预冷的氯仿：异戊醇(24∶1)，轻摇5min；

④离心，取上清，重复两次后加入2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀；

⑤-20℃放置30min，dna抱团析出，将液体弃掉；

⑥加入70％乙醇洗涤沉淀，上下颠倒6-8次，离心后弃上清，再用90％乙醇洗涤；

⑦通风处吹干2h，至dna干燥透明，无酒精味道；

⑧加入无菌水复溶。

用改良后的ctab法提取dna的优势在于：在dna抱团后直接弃掉液体，巧妙地避免了离心法导致的各种杂质沉淀，使最后得到的dna纯度及浓度质量均大幅度提高。

在一个实施方案中，所述步骤(c)通过降落pcr(touchdownpcr)进行，其反应体系如下表2所示：

表2pcr反应体系

使用降落pcr的方式，具有扩增效率高，非特异性扩增少且通用性强的优势。

在一个实施方案中，采用8％聚丙烯酰胺凝胶对pcr产物进行电泳，采用银染法染色，最后将凝胶置于凝胶成像系统上拍照，以识别电泳图谱上的多态性条带，从而筛选出条带清晰、多态性高、特异性好的亨利兜兰est-ssr引物。

在进一步的实施方案中，可利用本发明所述的方法开发兜兰属其他植物的est-ssr引物，甚至可用于开发兰科其他植物或兰科以外的其他植物的est-ssr引物。

本发明的另一方面还提供了本发明所述的est-ssr引物在亨利兜兰不同居群间、不同品种间、兜兰属植物间以及兰科植物间进行遗传多样性分析中的应用。

在本发明中，“一对引物”与“引物对”可互换使用，是指由正向引物和反向引物组成的一对引物；“一组引物”与“引物组”可互换使用，是指包括两对引物或更多对引物的一组引物。

本发明的实施方案中提供了技术方案带来的有益技术效果是：首次开发了亨利兜兰的est-ssr引物，提供了34对多态性丰富、可重复性好、特异性高、扩增稳定的亨利兜兰est-ssr引物，为亨利兜兰种质资源遗传多样性分析、分子标记辅助育种以及兜兰属植物相关的分子研究提供基础；由于这些est-ssr标记来源于dna的转录区域，与功能基因相关，且种间通用性好，因此可用于同属植物的分子生物学研究，尤其可用于分子标记辅助育种的相关研究如遗传连锁图构建、重要性状相关标记关联分析、分离和鉴定新基因等；并且，本发明提供的方法简单易高效、生产成本低，也可用于兜兰属其他植物est-ssr引物的开发。

前述内容仅仅是示意性的并且决不旨在是限制性的。除了上述示意性方面、实施方式和特征，通过参考下述详细说明，进一步的方面、实施方式和特征将更容易被理解。

附图简述

通过参考下述附图，本发明的进一步的方面、特征将更容易被理解。本领域技术人员应该理解，这些附图仅示意性地阐述了根据本发明的一些实施方式，而不应将其视为是对本发明范围的限制。

图1示出了来自2个亨利兜兰野生居群的33份不同亨利兜兰材料的dna琼脂糖凝胶电泳图。

图2-图35分别示出了表1所列出的34对引物在33份亨利兜兰样品上的多态性扩增结果的电泳图。

图36示出了利用表1列出的34对引物对来自2个亨利兜兰野生居群的33份不同亨利兜兰材料进行聚类分析后的upgma聚类图。

具体实施方式

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

实施例1.亨利兜兰est-ssr引物的开发

1.est-ssr引物设计

实验材料：亨利兜兰花器官获取自中国农业科学院蔬菜花卉所温室；本发明所有实施例中使用的各种试剂或培养基成分均经商购获得。

1)构建转录组文库：提取亨利兜兰花器官总rna，分离mrna，反转录合成并纯化cdna，末端修复、加腺嘌呤核苷连接测序接头，通过琼脂糖凝胶电泳回收大小为200～700bp的片段，将回收片段进行pcr扩增，即构建得到转录组文库。

2)转录组数据的获得：将步骤1)得到的转录组文库进行测序，获得转录组测序数据，将测序数据进行拼接，得到unigenes的序列数据。

3)ssr位点查找：运用microsatelliteidentificationtool(misa)软件查找各个unigene中可能存在的ssr位点。ssr位点的查找的标准是：二、三、四、五和六核苷酸的重复序列基序的次数分别不小于7、5、5、5和5次。

4)设计est-ssr引物：运用primer3软件基于ssr位点两翼的序列设计ssr引物。引物设计的筛选策略为：长度在17～24bp之间(最适20bp)，熔解温度(tm)在55～62℃之间，pcr扩增产物大小在100～350bp之间，含有的gc比例在40％～60％之间(最适为50％)，其他为默认设置。以最接近设计要求的引物组合作为ssr位点的引物。用于pcr扩增的ssr引物由生工生物工程(上海)有限股份公司合成。

2.植物样品基因组dna提取

实验材料：亨利兜兰植物叶片分别取自云南省文山州麻栗坡县的太阳冲居群(tyc)的8株植物和大弄居群(dn)的25株植物。

用改良的ctab法批量提取样品dna，具体操作如下：

(1)2ml离心管(灭菌)，装叶片，管盖大小两片；

(2)液氮研磨成粉末，加65℃预热的ctab800μl(含β-巯基乙醇v/v1％)；

(3)65℃水浴1h，每十分钟摇动一次；

(4)取出冷却至室温(或放入冰箱)，加入预冷的氯仿：异戊醇(24∶1)800μl，轻摇5min(手摇)；

(5)13000rpm离心10min，取上清450μl至1.5μl离心管中，再抽提一次(24∶1，450μl)，吸上清300μl，加入2倍体积的预冷无水乙醇600μl，轻轻上下颠倒混匀；

(6)-20℃放置30min，dna抱团析出，用枪头拖住dna团，将液体弃掉；

(7)加入1ml70％乙醇洗涤沉淀，上下颠倒6-8次，7500rpm离心5min，倒上清，1ml90％乙醇洗涤沉淀，7500rpm离心倒上清；

(8)通风处吹干2h，至dna干燥透明，无酒精味道；

(9)加100μl无菌水复溶。

进行琼脂糖凝胶电泳，结果(图1)显示所提取的总dna电泳条带清晰，说明提取的dna质量好。

3.利用est-ssr引物进行pcr扩增

以上面提取的基因组dan为模板，利用上面设计的est-ssr引物进行pcr扩增，从而鉴定引物有效性。pcr反应体系如表2所示。

4.pcr扩增产物的分析

采用8％聚丙烯酰胺凝胶对pcr产物进行电泳，采用银染法染色，显色以后条带完全呈现后，将凝胶置于凝胶成像系统上拍照。根据电泳图谱，筛选条带清晰、多态性高、特异性好的亨利兜兰est-ssr引物。

结果筛选出34对扩增效果好且多态性高的引物对，所述引物对如表1所示。如图2-图35所示，利用34对引物共检测得到等位基因94条，每对引物等位基因的变异幅度在2-5之间，平均等位基因数为2.74，表明本发明开发的esr-ssr引物完全可以用于亨利兜兰的遗传多样性分析。

实施例2.利用亨利兜兰est-ssr引物进行遗传多样性分析

实验材料：亨利兜兰实验样品分别获自云南省文山州麻栗坡县的太阳冲居群(tyc)的8株植物和大弄居群(dn)的25株植物。

对这34对est-ssr引物的扩增多态性信息进行分析(见下面表3)显示，观测及期望杂合度范围分别是0.0303-1.000及0.0597-0.6793，shannon信息指数的分布范围在0.14-1.25之间，平均值为0.61，表明这33份亨利兜兰材料的遗传分化比较丰富。

表334对est-ssr引物扩增多态性信息分析

另外，还利用这34对引物对上述两个野生居群(太阳冲居群和大弄居群)的33份不同的亨利兜兰材料进行聚类分析，如图36所示。结果显示，33份样品被分成5大类，遗传相似性系数在0.71处将材料分成两组，第i、ii、iii类为一组，样本均来自大弄居群(dn)，第iv、v为一组，样本均来自太阳冲居群(tyc)，这说明亨利兜兰不同野生居群之间的遗传相似性系数较小，遗传基础比较广。大弄居群中，遗传相似性系数为0.77处，可将材料分成3大类。太阳冲居群中，遗传相似性系数为0.70处，即可将材料分成2大类。可见，亨利兜兰不同的野生居群的材料具有差异性，遗传变异相对较大，利用开发出的34对est-ssr引物，能够成功的把居群区分开，同一居群的亨利兜兰的遗传变异相对较大，遗传基础较广。

实施例3.利用亨利兜兰est-ssr引物在兜兰属植物中进行通用性分析

利用亨利兜兰微卫星对来自兜兰属的其他六种兜兰属植物进行通用性分析，结果(见下面表4)显示34对est-ssr引物在紫毛兜兰(p.villosum)、秀丽兜兰(p.venustum)、彩云兜兰(p.wardii)、长瓣兜兰(p.dianthum)、同色兜兰(p.concolor)、硬叶兜兰(p.micranthum)的扩增成功率分别为0.85、0.82、0.74、0.68、0.56、0.56，说明这34对est-ssr引物在兜兰属中具有较高的通用性，特别是在兜兰亚属中的扩增率极高，可见与亨利兜兰的遗传距离越近，ssr引物的扩增效率越高。证明利用亨利兜兰转录组测序开发的34对est-ssr引物可用于近缘物种的遗传多样性与遗传结构的研究。

表434对est-ssr引物在其他六种兜兰属植物中的扩增情况

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到其各种变化或替换，这些都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>亨利兜兰est-ssr标记引物、其开发方法及其应用

<141>2017-09-08

<160>68

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cgaagcacgggtctctttct20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

accaccgacattacctgcag20

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列

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aatttcttccaggagggcgg20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tcggctgtccatgcttgtag20

<210>5

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<212>dna

<213>人工序列

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tcatcccttcatcccgaggt20

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<212>dna

<213>人工序列

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tccccatgctcgaagctttt20

<210>7

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ttgctcgcctttttgacagc20

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ttcccacctcggttatgcac20

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cgacatggtctgagaggagc20

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cactgggggatcttcgaagg20

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cttgggactctttcctcggc20

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ccaggaggctctcagctttc20

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<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

<400>48

cttcgatggatcatgggcga20

<210>49

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>49

ccaccagctttcatatcctcca22

<210>50

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>50

gcccatgctgtgcaaaaaga20

<210>51

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>51

aagaagtggcttccatggca20

<210>52

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>52

gcaaaaccaaggtgtcgtcc20

<210>53

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>53

agccaacacagccacgataa20

<210>54

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>54

aagaaccatcaccaccaccc20

<210>55

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>55

caaacctcgctcggaagact20

<210>56

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>56

agggtttctatcgcttggcc20

<210>57

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>57

gctgccaattcgaatggagg20

<210>58

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>58

gctgccgattctccttcctt20

<210>59

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>59

gaaaaccgattggcgtcgag20

<210>60

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>60

ttcccttctcccatttccgg20

<210>61

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>61

agctatgaggaactgcgctg20

<210>62

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>62

tgttgacatgatccgtggca20

<210>63

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>63

agcttgaagtacttgggggc20

<210>64

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>64

tccaccttctcctcctcact20

<210>65

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>65

ccttcctcatgatccgtccg20

<210>66

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>66

ttagctctctcccctccgag20

<210>67

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>67

ggcgattgacctctgctgat20

<210>68

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>68

tcggctttggttgctgagat20