预染发光蛋白marker的制备方法与流程

文档序号：12299250阅读：3863来源：国知局

本发明涉及一种预染发光蛋白marker的制备方法，属于分子生物学与基因工程领域。

背景技术：

蛋白质marker作为一种蛋白质分子量大小的标准被广泛应用于蛋白质电泳中。它是由已知的不同分子量大小的蛋白或多肽组成的混合物。westernblot需要一种用来跟踪检测阳性抗原信号和转膜效率的标尺，于是产生了预染蛋白marker。预染蛋白marker是将普通蛋白marker中的每个蛋白(或多肽)经过化学修饰，与一种蓝色或其他颜色的染料共价偶联而成。预染蛋白marker的出现给westernblot带来了极大便利，研究者在转膜后，可根据膜上蓝色(或其他颜色)蛋白marker的大小来确定目的条带的大概位置，从而对膜进行剪切等处理。但是，预染蛋白marker无法在胶片上曝光，曝光信号需要根据膜上的预染蛋白marker来判断，另外预染蛋白marker经过化学修饰后在sds-page电泳过程中迁移率发生改变，分子量信息不再准确，往往导致westernblot结果判断出现较大偏差。

发光westernblotmarker是专门为westernblot试验设计的分子量标准。在westernblot实验中，marker条带可特异性结合一抗或者二抗，使蛋白样品和蛋白marker经化学发光检测后，能够同时在x光片上显示出来。

目前市面上已有可用于曝光的发光marker，不同公司采用了不同的技术。cst公司的发光marker是纯化的蛋白与生物素共价结合的混合物，抗生物素hrp抗体在westernblots中用来检测生物素化蛋白梯子。大多数公司采用能够结合抗体igg的蛋白组成发光marker的成分，如thermo等。

但是，目前的产品都存在一定的不足，生物素化的蛋白marker需要加入抗生物素-hrp抗体或链酶亲和素-hrp，这使得实验操作变得繁琐。另外，仅仅含有可发光的蛋白marker不能跟踪检测阳性抗原信号和转膜效率，需要另外加一道预染marker，不仅繁琐而且占用泳道，减少了可电泳的样品数量。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种能与目的蛋白同时在x胶片上显示出来，从而更精确地指示蛋白的具体位置，且不需要加入额外试剂的预染发光蛋白marker的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种预染发光蛋白marker的制备方法，其步骤包括：

a、获取proteina基因、proteing基因、mbp基因，小鼠和兔源抗体的重链恒定区基因(ch基因)，根据ncbi注释确定proteina、proteing的iggbindingdomain，根据预染发光蛋白marker中各蛋白大小对proteina基因、proteing基因、mbp基因、ch基因进行切割或组合，切割过程中保留蛋白的bindingdomain；

b、将切割或组合后的proteina、proteing、mbp以及ch基因连接在表达载体上分别进行表达纯化，得到纯化的蛋白；

c、将不同分子量的蛋白按照一定比例混合，得到发光蛋白marker；

d、将调好的发光蛋白marker与预染蛋白marker按不同的比例混合，通过观察转膜后膜上条带深度和显影后x胶片上条带亮度选择合适的混合比例。

优选的，所述表达载体为pet21a或pet28a。

优选的，所述宿主细胞为e.coli。

优选的，所述发光蛋白marker分子量从16kda到200kda。

本发明的预染发光蛋白marker是由发光蛋白marker和预染蛋白marker在互不影响的情况下按照一定比例混合而成，从而实现转膜后的分子量指标和曝光后x胶片上分子量指标双重功能，其中发光蛋白marker是由能够结合抗体igg的proteina、proteing或proteinl，以及能被二抗结合的兔源或鼠源抗体fc区基因融合表达而成，从而使发光蛋白marker中的蛋白可以识别不同来源的一抗或二抗，增加了蛋白的结合位点，使光信号增强。本发明的预染发光蛋白marker不仅能在电泳过程中和转膜后指示蛋白的大致位置，而且能在x胶片上指示蛋白的精确位置，而不需要额外增加预染marker泳道，且不需要加入额外的抗体，如抗生物素抗体-hrp或链酶亲和素-hrp，发光蛋白可结合来源于人、大鼠、小鼠、兔等物种的igg或抗兔和小鼠的二抗。与其他公司的发光marker相比，具有更宽的指示范围，分子量从16kda到200kda。

附图说明

图1为可发光蛋白marker曝光后的电泳图。

图2为预染发光蛋白marker曝光前的电泳图。

图3为预染发光蛋白marker曝光后的电泳图。

图4为mbp+多克隆序列的结构特征图。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

具体实施方式

实施例一

1、合成金黄色葡萄球菌免疫球蛋白g结合蛋白a(proteina)和链球菌免疫球蛋白g结合蛋白g(proteing)的全基因序列；购买质粒pfusess-chig-rg*03(invivogen,catalog#pfusess-rchg)和pfusess-chig-mg2b(invivogen,catalog#pfusess-mchg2b)作为兔源抗体重链恒定区基因(rfc)和小鼠源抗体的重链恒定区基因(mfc)pcr模板；自构建的pet28a-his-mbp载体为mbp序列pcr模板。

2、pet28a-his-mbp载体构建

根据pmal-c2t(genbank:jf795283.1)中的mbp核酸序列设计his+mbp+多克隆序列(seqidno.9)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并构建成pet28a-his-mbp多克隆载体。

3、根据发光marker中各条带分子量大小设计不同的基因片段组合，具体组合见表1：

表1发光蛋白marker条带组成

注：pa:proteina

pg:proteing

根据上表中各基因片段设计引物，如表2：

表2引物设计表

4、以表1中所述基因为模板，用表2中的引物通过pcr扩增相应的核酸片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离回收特定的目的片段；将各片段按照表1中的组合进行酶切和连接；回收连接产物，与相应的载体酶连后转入大肠杆菌dh5α，得到各表达质粒。

5、将测序正确的表达质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，进行蛋白的诱导表达。具体的实验操作可参考《分子克隆手册》。

6、不同分子量的蛋白的分离纯化

载体为pet21a的质粒表达的蛋白用镍离子亲和层析纯化；载体为pet28a-his-mbp的质粒表达的蛋白用麦芽糖亲和层析纯化。具体各种亲和层析柱纯化的操作方法和流程可以参照蛋白纯化实验手册执行。

7、可发光蛋白marker的获得

分别用westernbolt检测各蛋白的发光强度，即对抗体的结合能力；根据单条带的发光强度，将不同分子量的蛋按照一定比例混合，通过westernbolt检测混合后的结果，并调整混合比例，最终得到条带均一的混合物。通过孵育不同种属来源的不同抗体来检测发光marker条带的稳定性。

8、预染发光marker的获得

将调好的发光marker与预染蛋白marker(solarbio，pr1910)按1:2的比例混合，得到预染发光蛋白marker。

<110>张海灵

<120>预染发光蛋白marker的制备方法

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<213>人工序列

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