一种热稳定性蛋白质（多肽）及其制备方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种热稳定性蛋白质(多肽)及其制备方法。
背景技术：
：目前，蛋白质(多肽)类药物因其具有高活性，高特异性，低毒性以及生物功能明确等优势而广泛应用于临床。蛋白质(多肽)类药物可以分为细胞因子、酶类、抗体、疫苗等。随着蛋白质(多肽)组学和分子生物学的发展，应用于各种疾病治疗的蛋白质(多肽)类药物的研制和应用已成为生物医药产业的热点。与小分子化合物药物相比，蛋白质(多肽)药物分子大，通常为几千或几万甚至十几万道尔顿。蛋白质(多肽)的功能由多种功能团组成，但这些功能基团很不稳定，容易在同一时相上发生多种降解反应，导致蛋白失活，药物效应消失。蛋白质(多肽)的这种不稳定性极大的限制了这类药物的临床应用。影响蛋白质(多肽)不稳定的因素很多，其中温度是最常见原因之一。蛋白质(多肽)分子在热的作用下易发生结构伸展，使原本包埋于分子内部的疏水区域暴露于溶剂之中并最终失活。由于蛋白质(多肽)的活性对温度十分敏感，因此，在蛋白质(多肽)药物的生产、运输、保存过程中都需要一个相对稳定的低温环境。然而，冷链的维持费用相当昂贵，尤其在缺乏可靠冷链基础设施的发展中国家和贫困地区，蛋白质(多肽)类药物的低温保存很大程度上限制了其在这些地区的使用。因此，提高蛋白质(多肽)的热稳定性具有较高的临床和经济价值。目前，提高蛋白质(多肽)药物的热稳定性的方法主要有以下几种：(1)添加蛋白质(多肽)稳定剂，最简单有效的添加剂是离子化合物的盐类，离子的结合能增加蛋白质(多肽)的热稳定性，盐类通过与蛋白质(多肽)非特异性结合，减缓蛋白质(多肽)的变性。(2)化学修饰，主要是指利用修饰剂对蛋白类药物进行化学修饰，以改变它们的生物分配行为和溶解行为，从而增强药物的物理，化学和生物稳定性。(3)蛋白质(多肽)工程，通过化学，物理，分子生物学手段对基因进行修饰或合成新的基因，对现有蛋白质(多肽)进行高度专一的改造的方法，从而起到增强蛋白质(多肽)稳定性的作用。(4)在液体状态，利用矿化技术直接在蛋白表面形成磷酸钙矿化外壳以提高蛋白质(多肽)的稳定性。以上策略在提高蛋白质(多肽)药物的应用上存在一些限制，例如方法(1)(2)(3)一般需要复杂的处理过程、并且应用范围有限，方法(3)尚不能产生良好的保护效果、而且可能会改变蛋白质(多肽)的性质，影响蛋白质(多肽)药物的效果。方法(4)直接矿化的策略需要蛋白表面存在大量的对钙离子高吸附性的基团，而且该方法仅适用于个别蛋白。利用仿生矿化在蛋白质(多肽)表面引入无机物外壳来提高疫苗的热稳定性是一种新型的、具有良好应用前景的策略。在此前，有申请人申请过“一种基因工程热稳定疫苗及其制备方法”的相关技术，其申请号为201310278495.x，申请日2013.07.02，该技术主要应用于病毒颗粒疫苗的制作，但不适用于可溶性生物大分子的稳定性改进，因为病毒本身是一个颗粒分子，因此可以通过表面表达矿化肽而形成矿化外壳，而可溶性分子不能直接在表面矿化，从而该技术不能提高可溶性大分子的稳定性，且通过该技术形成的无定形磷酸钙在液体溶液中不能稳定存在，不能使蛋白质(多肽)获得热稳定性。为了提高蛋白质(多肽)热稳定性，从而使蛋白质(多肽)类药物具有更广泛的应用性，本发明提出一种通过基因工程技术联合化学修饰技术的方法，在蛋白质(多肽)药物中融合具有诱导无机物矿化能力的多肽，通过形成纳米颗粒使其被包裹于矿物质中，从而提高蛋白质(多肽)热稳定性，并使其同时具有抗蛋白酶降解作用的性质。技术实现要素：本发明所要解决的问题是提供一种热稳定性蛋白质(多肽)及其制备的方法，同时该蛋白具有抗蛋白酶的降解作用，本发明制备的蛋白质(多肽)是自身形成矿化纳米颗粒并且表面包裹一层无定形磷酸钙外壳的热稳定性蛋白质(多肽)。由于本发明利用基因工程在蛋白质(多肽)上引入了生物矿化肽，从而打破了蛋白质(多肽)自身矿化的限制，该方法适用于几乎所有的蛋白质(多肽)，这大大促进了蛋白质产品的广泛应用。本发明采用如下技术方案：一种具有热稳定性的蛋白质(多肽)，所述蛋白质(多肽)上连接有生物矿化肽，所述的多肽具有诱导无机物矿化的能力，所述的多肽通过基因工程技术引入。所述诱导无机物矿化能力是指蛋白质(多肽)上连接的多肽具有较强的螯合无机物离子的能力，可以促使蛋白质(多肽)在无机物浓度较低的溶液中富集无机物离子，使蛋白质(多肽)形成一定大小的纳米颗粒。所述的无机物为含钙矿物。所述的含钙矿物是指其主要的阳离子成分是ca2+离子的矿物，所述的含钙矿物可选自磷酸钙、碳酸钙、草酸钙中的任意一种或任意多种。所述的无机物可以通过在蛋白质(多肽)溶液中加入ca2+离子(例如：氯化钙)和酸根离子(所述的酸根离子选自磷酸根离子、碳酸根离子、草酸根离子的任意一种或任意多种，例如，可加入含有上述酸根离子的可溶性盐)形成矿物而获得，作为优选，本发明加入磷酸根矿化形成无定形磷酸钙。所述的一种具有热稳定性的蛋白质(多肽)，在矿化中加入镁离子，以稳定无定形磷酸钙在溶液中的稳定性。在蛋白质(多肽)螯合钙离子时加入镁离子能够使矿化的无定形磷酸钙在溶液中不容易形成结晶，从而使无定形磷酸钙更加稳定。作为优选，所述的多肽包含如下所示序列其中之一：cgpkdvvvgvpggqdgpc；dsseekflrrigrfg；svkrgtsvgmkpsprp；rwrlegtddkeepesqrrigrfg。进一步地，本发明提供了一种制备具有自矿化蛋白质(多肽)的方法，包括以下步骤：(1)将编码生物矿化肽的碱基添加到编码蛋白质(多肽)碱基序列上，得到蛋白质(多肽)的重组克隆；(2)将步骤(2)得到的蛋白质(多肽)重组克隆在细菌中表达，得到具有自矿化能力的蛋白表达菌。(3)利用蛋白质(多肽)表达纯化技术，得到纯化的具有自矿化能力的蛋白质(多肽)。作为优选，所述的多肽包含如下所示序列其中之一：cgpkdvvvgvpggqdgpc；dsseekflrrigrfg；svkrgtsvgmkpsprp；rwrlegtddkeepesqrrigrfg进一步的，本发明提供一种具有自矿化能力的蛋白质(多肽)的矿化方法，包括如下步骤：(1)配置初始体系：在1ml体系中加入具有自矿化能力的蛋白质(多肽)100-600ng。向蛋白质(多肽)溶液中加入cacl2、mgcl2和(na)2hpo4/nah2po4。(2)将所述体系在4℃、ph>6.0条件下磁珠旋转搅拌4h,制备具有热稳定的矿化蛋白。作为优选，所述的原始体系中ca2+离子浓度为5-10μmol/ml；更优选的ca2+离子浓度为7-9μmol/ml。作为优选，所述的原始体系中mg2+离子浓度为5-10μmol/m；更优选的mg2+离子浓度为7-9μmol/ml。作为优选，所述的原始体系中po43-离子浓度为3-10μmol/ml。更优选的po43-离子浓度为5-7μmol/ml。更优选的，所述的原始体系中蛋白质(多肽)与ca2+离子，mg2+离子和po43-的离子的比例为100-600ng：7-9μmol：7-9μmol：5-7μmol作为优选，本发明中的ph值为6-9,更优选的ph值为6.8-7.8。所述步骤(1)的目的是使ca2+离子充分在蛋白质(多肽)上富集，加入mg2+离子是使钙离子中间镶嵌部分镁离子，当加入磷酸根离子时在蛋白上形成稳定的无定形磷酸钙。所述步骤(2)的孵育过程是使蛋白质(多肽)形成大小均一的纳米颗粒，并使蛋白质(多肽)上形成一层矿化的无定形磷酸钙。作为优选，所述步骤(2)的孵育温度在0℃-10℃，更优选的所述步骤(2)的孵育温度为4℃。作为优选，所述步骤(2)的孵育时间为2-4h，更优选的所述步骤(2)的孵育时间为4h。本发明通过基因工程技术将能够诱导无机物矿化的多肽引入到蛋白质(多肽)上，引入的矿化肽能够从溶液中富集无机物离子进而诱导无机物矿化，使蛋白质(多肽)形成大小均一的矿化纳米颗粒。本发明引入矿化肽能够使几乎所有的蛋白质(多肽)拥有自矿化能力，具有普适性。本发明制备热稳定性蛋白质(多肽)的方法简单，成本低廉。矿化得到的蛋白质(多肽)具有以下优点：通过在蛋白质(多肽)上引入生物矿化肽，使蛋白质(多肽)自身矿化形成一定大小的纳米颗粒的同时在其外形成一层无定形磷酸钙包裹，该方法打破了对颗粒载体的限制，能够提高可溶性大分子的稳定性，在蛋白质(多肽)药物的稳定性方面有很大的应用前景。矿化提高了蛋白质(多肽)的沉降性，使得蛋白质(多肽)能在常速离心条件下富集。矿化蛋白质(多肽)表面包裹了一层无定形磷酸钙外壳，无定形磷酸钙能减缓蛋白质(多肽)内部和外界的氢键交换，从而减速蛋白质(多肽)的失活，同时无定形磷酸钙的包裹能减少蛋白质(多肽)消化酶的活性中心与蛋白质(多肽)得结合位点，从而对蛋白酶的消化具有一定的抵抗能力，有效的提高蛋白质(多肽)的稳定性。按照本方法制备的蛋白质(多肽)能在室温储存一周以上仍然具有蛋白质(多肽)活性。当蛋白质(多肽)分子作为疫苗时，矿化的蛋白质(多肽)疫苗中矿化纳米颗粒可有效增强疫苗蛋白的抗原递呈，促进体液免疫和细胞免疫，增强疫苗蛋白对宿主的保护效应，且不存在免疫局部结节出现的情况，较铝佐剂的效应更好。通过本发明，能够有效地提高蛋白质(多肽)的热稳定性，减少在蛋白质(多肽)药物冷藏中的财政支出，促进蛋白质(多肽)药物的广泛应用，在新型热稳定蛋白质(多肽)的生产和制备中具有较高的实用价值。附图说明图1为构建重组质粒的电泳图，其中图1中的1、2、3、4、5条带分别是δply、δply-pa44、δply-nw、δply-n6、δply-w6。图2为表达并纯化后的重组蛋白，其中图2中的1、2、3、4、5条带分别是δply、δply-pa44、δply-nw、δply-n6、δply-w6。图3为矿化蛋白的电镜图。其中图3a为δply-pa44；3b为δply-pa44-ca；3c为δply-pa44-cap-mg2+；3d为δply-nw-cap；3e为δply-w6-cap；3f为δply-n6-cap。图4为矿化蛋白的xps分析，其中a:δa146ply-pa44；b:δa146ply-nw；c:δa146ply-n6；d:δa146ply-w6；e:δa146ply-pa44@cap；f:δa146ply-nw@cap；g:δa146ply-n6@cap；h:δa146ply-w6@cap图5为蛋白质的蛋白酶k消化稳定性分析。1、2、3条带为蛋白酶k处理0分钟，4、5、6条带为蛋白酶k处理1分钟，7、8、9条带为蛋白酶k处理5分钟，10、11、12条带为蛋白酶k处理10分钟；条带1、4、7、10为δply-pa44、2、5、8、11为δply-pa44-cap、3、6、9、12为δply-pa44-cap-mg2+图6为蛋白质的热稳定性分析。1、2、3条带为室温放置0周，4、5、6条带为室温放1周，7、8、9条带为蛋白酶k处理5分钟室温放置2周，10、11、12条带为室温放置3周；条带1、4、7、10为室温放置4周。条带1、4、7、10为δply-pa44-cap-mg2+、2、5、8、11为δply-pa44-cap、3、6、9、12为δply-pa44。图7为皮下免疫后抗δa146plyigg抗体效价分析。图8为皮下免疫小鼠后再刺激脾细胞分泌细胞因子的量分析。具体实施方式实施例1、具有自矿化能力的蛋白质的制备该实施例以去掉146位氨基酸的肺炎链球菌溶血素δply蛋白为模型骨架，首先以pet28a质粒为载体，构建pet28a(+)-δply-pa44、pet28a(+)-δply-nw、pet28a(+)-δply–n6、pet28a(+)-δply–w6重组表达质粒，然后将重组表达质粒转化到大肠杆菌，并在大肠杆菌中表达、鉴定及纯化(一)δply蛋白上连接矿化肽1、构建重组表达质粒(1)材料：质粒pet28a(+)购自novagen公司，pcr用primestar高保真酶、dntps、buffer、mgcl2购自大连宝生物技术公司，ptc－200pcr仪为perkinelmer产品，rg－3000为corbettresearch产品。(2)引物的设计合成：以肺炎链球菌tigr4基因组dna为模板，参照其全序列(genebank编号ae005672)，使用premier5.0设计引物，由上海生工公司合成。δply片段上连接上多肽pa44、nw、n6、w6,并将对应的重组蛋白命名为δply-pa44、δply-nw、δply-n6、δply-w6。多肽pa44、nw、n6、w6对应的融合pcr引物为：(3)pcr扩增目的基因：δply-pa44基因的扩增体系：条件：98℃10s、55℃15s、72℃100s、30cycle；72℃10min,1次利用上述条件，扩增出了相应目的基因(4)原核表达载体的构建pcr产物回收按罗氏提供的试剂盒说明进行，质粒pet28a(+)按omega小量质粒dna抽提试剂盒说明进行，然后进行载体dna和外源dna进行双酶切及回收，最后连接回收产物，连接反应体系如下：连接反应体系1：δply-pa44片段6μl；pet28a(+)dna大片段2μl；连接bufferi1μl；t4连接酶1μl总体积：10μl反应条件：置0.5mlep管中，22℃，10min将连接产物转化大肠杆菌e.colidh5α感受态细胞：取e.colidh5α菌划线接种lb平板37℃孵育过夜(12-14h)挑取单菌落，接种于3mllb中37℃200rpm过夜(12-14h),取100μl加入2mllb37℃，300rpm3h取1.5ml菌液加入冰预冷ep管中，冰浴10min后4000rpm,5min收集菌体加入预冷的0.1mmcacl2150μl,重悬后9000rpm，2min收集菌体再加入预冷的0.1mmcacl2150μl,重悬加入10μl连接反应产物，混匀后，冰水浴30min42℃热击5min，冰水浴2min加入800ullb培养基，37℃，100rpm1h复苏取200μl菌液涂布于lk平板37℃孵育，13h挑取单菌落进行增菌鉴定(5)pet28a(+)-δply-pa44重组子的筛选及鉴定挑取10个卡纳霉素抗性菌落，分别置2mllk(含50ug/mlkana的lb)培养基中，180rpm3h增菌，菌液pcr鉴定；选取3个可疑阳性菌落增菌，送往成都擎科梓熙生物技术有限公司作双向测序。结果见附图1，获得单一的pcr条带；pcr产物测序结果与预期序列比对完全吻合。以上结果证实目的基因片段正确插入表达载体中。2、原核表达pet28a(+)-δply-pa44重组质粒在大肠杆菌中的表达、鉴定及纯化(1)重组质粒pet28a(+)-δply-pa44转化至宿主菌bl21(dh5α)中(2)iptg诱导δply-pa44的大量表达(3)重组蛋白的纯化：超声破菌后，取细菌破碎液上清用于纯化；4℃，10000rpm×10min，上清用0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。亲合层析纯化：吸2ml50％的ni2+-nta树脂混悬液于层析柱内，以20ml超声破碎缓冲液平衡；吸出平衡后的ni2+-nta树脂混悬液与上述滤液充分混匀，冰浴1h，其间每间隔5min轻轻混匀一次；将悬液转入层析柱内，让液体自然流出，平衡柱床；不同咪唑浓度进行梯度洗脱，分别收集洗脱液后进行sds-page鉴定。(4)pbs超滤除去咪唑。(5)重组蛋白的定量(bradford检测法)a.吸20mg/ml的标准品牛血清白蛋白溶液6μl以0.15mmo1/lnacl稀释40倍至0.5mg/ml，分别在两组各4支试管中加入10μl、20μl、30μl、40μlbsa溶液，然后以0.15mmol/lnacl补足总体积为200μl，同时取一支试管仅加200μl0.15mmol/lnacl作为调零用；b.取纯化产物20μl，也以0.15mmol/lnacl补足至总体积200μl；c.每管加入考马斯亮蓝g-250染液2ml，振荡混匀后室温静置30min；d.于-series600全波长分光光度计中读取a590值，由仪器自动绘制标准曲线及计算样品蛋白含量。结果显示：经sds-page和图像分析表明，重组蛋白纯度可达90％以上，经bradford法测得纯化透析后蛋白浓度结果见附图1，获得单一的pcr条带；pcr产物测序结果与预期序列比对完全吻合。以上结果证实目的基因片段正确插入表达载体中。δply-pa44为8.81ug/ul按照步骤(一)类似的步骤，在δply蛋白上连接上多肽nw、n6、w6,成功构建具有自矿化能力的蛋白质δply-nw、δply-n6、δply-w6,经bradford法测得纯化透析后蛋白浓度δply-nw为4.8ug/ul、δply-n6为2.4ug/ul、δply-w6为3.4ug/ul。(结果见附图1,附图2)(二)dnaj蛋白上连接生物矿化肽(1)重组表达质粒按照步骤(一)类似的步骤，在dnaj蛋白上连接上多肽pa44、nw、n6、w6,并将对应的重组蛋白命名为dnaj-pa44、dnaj-nw、dnaj-n6、dnaj-w6。(2)将重组质粒转化到大肠杆菌方法同步骤(一)(3)表达并纯化重组蛋白dnaj-pa44、dnaj-nw、dnaj-n6、dnaj-w6。方法同步骤(一)成功构建具有自矿化能力的蛋白质dnaj-pa44、dnaj-nw、dnaj-n6、dnaj-w6。经bradford法测得纯化透析后蛋白浓度dnaj-pa44为2.4ug/ul、dnaj-nw为4.1ug/ul、dnaj-n6为2.1ug/ul、dnaj-w6为1.4ug/ul。实施例2、重组蛋白δply-pa44的磷酸钙自矿化及生物特征分析(一)重组蛋白的矿化在δply-pa44蛋白溶液(调整蛋白质浓度为100ng/ml)中加入cacl2、使ca2+离子浓度达到5μmol/ml,再加入mgcl2离子，使mg2+离子浓度为5μmol/ml；最后加(na)2hpo4/nah2po4使po43-离子浓度为3μmol/ml,将所述体系在4℃、ph＝6.5条件下磁珠旋转搅拌2h,制备具有热稳定的矿化蛋白。在上述制备过程中，初始体系中蛋白质、ca2+离子、mg2+离子和po43-离子的比例为100(ng):5(umol):5(umol):3(umol)。(二)生物特征分析(1)将矿化蛋白δply-pa44离心(5000g；5min)得到沉淀与上清，沉淀用40ulpbs重悬，分别向40ul上清和40ul重悬的沉淀中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白的上清液中未检测到蛋白质。(2)将蛋白质溶液δply-pa44，矿化蛋白δply-pa44@cap，矿化蛋白δply-pa44@cap-mg2+溶液稀释50倍，电镜观察结果。结果见附图3a、3b、3c。结果显示未加矿化肽的蛋白质不能形成大小均一的纳米颗粒，磷酸钙矿化的蛋白质能形成一定大小的纳米颗粒，但放置一段时间后容易结晶，矿化加镁离子稳定的蛋白质能够形成大小均一的矿化纳米颗粒且能在溶液中稳定较长的一段时间。(3)将矿化蛋白质溶液δply-pa44@cap滴于载玻片上，充分干燥，x射线能谱检测矿化蛋白质表面元素。结果见附图4，矿化蛋白表面能够检测到钙离子等元素。(三)矿化蛋白质的稳定性分析(1)矿化蛋白质对蛋白酶k的消化抵抗分析将矿化蛋白δa146ply-pa44@cap，δa146ply-pa44@cap-mg2+和未矿化的蛋白δa146ply-pa44分别用蛋白酶k处理0min,1min,5min,10min后，向40ul样本中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,分别取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果见附图5。结果显示，在蛋白酶处理10min后，未矿化的蛋白已经无法检测到，但矿化蛋白δa146ply-pa44@cap，δa146ply-pa44@cap-mg2+仍然能够被检测到。(2)矿化蛋白质的热稳定分析将矿化蛋白δa146ply-pa44@cap，δa146ply-pa44@cap-mg2+和未矿化的蛋白δa146ply-pa44室温放置一周，两周，三周后，向40ul样本中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,分别取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果见附图6。结果显示室温放置2周后未矿化的蛋白已经无法检测到，而但矿化蛋白δa146ply-pa44@cap，δa146ply-pa44@cap-mg2+仍然能够被检测到。实施例3：重组蛋白δply-nw磷酸钙自矿化及生物特征分析(一)重组蛋白的矿化在δply-pa44蛋白溶液(调整蛋白质浓度为200ng/ml)中加入cacl2、使ca2+离子浓度达到7μmol/ml,再加入mgcl2离子，使mg2+离子浓度为7μmol/ml；最后加(na)2hpo4/nah2po4使po43-离子浓度为5μmol/ml,将所述体系在4℃、ph＝6.5条件下磁珠旋转搅拌2h,制备具有热稳定的矿化蛋白。在上述制备过程中，初始体系中蛋白质、ca2+离子、mg2+离子和po43-离子的比例为200(ng):7(umol):7(umol):5(umol)。(一)生物特征分析(1)将矿化蛋白δply-nw离心(5000g；5min)得到沉淀与上清，沉淀用40ulpbs重悬，分别向40ul上清和40ul重悬的沉淀中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白的上清液中未检测到蛋白质。(2)将蛋白质溶液δply-nw,矿化蛋白δply-nw@cap溶液稀释50倍，电镜观察结果。结果见附图3d，矿化蛋白能形成一定大小的矿化颗粒。(3)将矿化蛋白质溶液δply-nw滴于载玻片上，充分干燥，x射线能谱检测矿化蛋白质表面元素。结果见附图4，矿化蛋白表面能够检测到钙离子等元素。(三)矿化蛋白质的稳定性分析(1)矿化蛋白质对蛋白酶k的消化抵抗分析将矿化蛋白δa146ply-nw@cap,矿化的蛋白δa146ply-nw分别用蛋白酶k处理0min,1min,5min,10min后，向40ul样本中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,分别取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白δa146ply-nw@cap具有一定的抵抗蛋白酶的消化作用。(2)矿化蛋白质的热稳定分析将矿化蛋白δa146ply-nw@cap，和未矿化的蛋白δa146ply-nw室温放置一周，两周，三周后，向40ul样本中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,分别取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白δa146ply-nw@cap具有一定的热稳定性。实施例4：重组蛋白δply-w6的磷酸钙自矿化(一)重组蛋白的矿化在δply-nw蛋白溶液(调整蛋白质浓度为300ng/ml)中加入cacl2、使ca2+离子浓度达到9μmol/ml,再加入mgcl2离子，使mg2+离子浓度为9μmol/ml；最后加(na)2hpo4/nah2po4使po43-离子浓度为7μmol/ml,将所述体系在4℃、ph＝8.0条件下磁珠旋转搅拌4h,制备具有热稳定的矿化蛋白。在上述制备过程中，初始体系中蛋白质、ca2+离子、mg2+离子和po43-离子的比例为300(ng):9(umol):9(umol):7(umol)。(二)生物特征分析(1)将矿化蛋白δply-w6离心(5000g；5min)得到沉淀与上清，沉淀用40ulpbs重悬，分别向40ul上清和40ul重悬的沉淀中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白的上清液中未检测到蛋白质。(2)将蛋白质溶液δply-w6,矿化蛋白δply-w6@cap溶液稀释50倍，电镜观察结果。结果见附图3e，矿化蛋白能形成一定大小的矿化颗粒。(3)将矿化蛋白质溶液δply-w6滴于载玻片上，充分干燥，x射线能谱检测矿化蛋白质表面元素。结果见附图4，矿化蛋白表面能够检测到钙离子等元素。(三)矿化蛋白质的稳定性分析(1)矿化蛋白质对蛋白酶k的消化抵抗分析将矿化蛋白δa146ply-w6@cap,矿化的蛋白δa146ply-w6分别用蛋白酶k处理0min,1min,5min,10min后，向40ul样本中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,分别取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白δa146ply-w6@cap具有一定的抵抗蛋白酶的消化作用。(2)矿化蛋白质的热稳定分析将矿化蛋白δa146ply-w6@cap，和未矿化的蛋白δa146ply-w6室温放置一周，两周，三周后，向40ul样本中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,分别取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白δa146ply-w6@cap具有一定的热稳定性。实施例5：重组蛋白δply-n6的磷酸钙自矿化(一)重组蛋白的矿化在δply-n6蛋白溶液(调整蛋白质浓度为300ng/ml)中加入cacl2、使ca2+离子浓度达到10μmol/ml,再加入mgcl2离子，使mg2+离子浓度为10μmol/ml；最后加(na)2hpo4/nah2po4使po43-离子浓度为7μmol/ml,将所述体系在4℃、ph＝9.0条件下磁珠旋转搅拌4h,制备具有热稳定的矿化蛋白。在上述制备过程中，初始体系中蛋白质、ca2+离子、mg2+离子和po43-离子的比例为300(ng):10(umol):10(umol):7(umol)。(二)生物特征分析(1)将矿化蛋白δply-n6离心(5000g；5min)得到沉淀与上清，沉淀用40ulpbs重悬，分别向40ul上清和40ul重悬的沉淀中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白的上清液中未检测到蛋白质。(2)将蛋白质溶液δply-n6,矿化蛋白δply-n6@cap溶液稀释50倍，电镜观察结果。结果见附图3f，矿化蛋白能形成一定大小的矿化颗粒。(3)将矿化蛋白质溶液δply-n6滴于载玻片上，充分干燥，x射线能谱检测矿化蛋白质表面元素。结果见附图4，矿化蛋白表面能够检测到钙离子等元素。(三)矿化蛋白质的稳定性分析(1)矿化蛋白质对蛋白酶k的消化抵抗分析将矿化蛋白δa146ply-n6@cap,矿化的蛋白δa146ply-n6分别用蛋白酶k处理0min,1min,5min,10min后，向40ul样本中加入10ul5*loadingbuffer沸水煮10min,分别取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白δa146ply-n6@cap具有一定的抵抗蛋白酶的消化作用。(2)矿化蛋白质的热稳定分析将矿化蛋白δa146ply-n6@cap，和未矿化的蛋白δa146ply-n6室温放置一周，两周，三周后，向40ul样本中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,分别取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白δa146ply-n6@cap具有一定的热稳定性。实施例6：重组蛋白dnaj-pa44的磷酸钙自矿化在dnaj-pa44蛋白溶液(调整蛋白质浓度为300ng/ml)中加入cacl2、使ca2+离子浓度达到9μmol/ml,再加入mgcl2离子，使mg2+离子浓度为9μmol/ml；最后加(na)2hpo4/nah2po4使po43-离子浓度为7μmol/ml,将所述体系在4℃、ph＝9.0条件下磁珠旋转搅拌4h,制备具有热稳定的矿化蛋白dnaj-pa44@cap。在上述制备过程中，初始体系中蛋白质、ca2+离子、mg2+离子和po43-离子的比例为300(ng):9(umol):9(umol):7(umol)。(二)生物特征分析(1)将矿化蛋白dnaj-pa44离心(5000g；5min)得到沉淀与上清，沉淀用40ulpbs重悬，分别向40ul上清和40ul重悬的沉淀中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白的上清液中未检测到蛋白质。(2)将矿化蛋白dnaj-pa44@cap溶液稀释50倍，电镜观察结果。(3)将矿化蛋白质溶液dnaj-pa44@cap滴于载玻片上，充分干燥，x射线能谱检测矿化蛋白质表面元素。(三)矿化蛋白质的稳定性分析(1)矿化蛋白质对蛋白酶k的消化抵抗分析将矿化蛋白dnaj-pa44@cap和未矿化的蛋白dnaj-pa44分别用蛋白酶k处理0min,1min,5min,10min后，向40ul样本中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,分别取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白dnaj-pa44@cap具有一定的抵抗蛋白酶的消化作用。(2)矿化蛋白质的热稳定分析将矿化蛋白dnaj-pa44@cap和未矿化的蛋白dnaj-pa44室温放置一周，两周，三周后，向40ul样本中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,分别取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白dnaj-pa44@cap具有一定的热稳定性。实施例7、重组蛋白δply-pa44的草酸钙自矿化在δply-pa44蛋白溶液(调整蛋白质浓度为300ng/ml)中加入cacl2、使ca2+离子浓度达到9μmol/ml,再加入mgcl2离子，使mg2+离子浓度为9μmol/ml；最后加草酸根，使草酸根离子浓度为7μmol/ml,将所述体系在4℃、ph＝8.0条件下磁珠旋转搅拌4h,制备具有热稳定的矿化蛋白。在上述制备过程中，初始体系中蛋白质、ca2+离子、mg2+离子和草酸根离子的比例为300(ng):9(umol):9(umol):7(umol)。(二)生物特征分析(1)将矿化蛋白δply-pa44离心(5000g；5min)得到沉淀与上清，沉淀用40ulpbs重悬，分别向40ul上清和40ul重悬的沉淀中加入10ul5*loadingbuffer沸水煮10min,取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白的上清液中检测到少量蛋白质，矿化不完全。(2)将蛋白质溶液δply-pa44,矿化蛋白δply-pa44@cac2o4溶液稀释50倍，电镜观察结果。结果显示矿化蛋白能形成一定大小的纳米颗粒。(3)将矿化蛋白质溶液滴于载玻片上，充分干燥，x射线能谱检测矿化蛋白质表面含有钙离子等元素。实施例8、重组蛋白δply-pa44的碳酸钙自矿化在δply-pa44蛋白溶液(调整蛋白质浓度为300ng/ml)中加入cacl2、使ca2+离子浓度达到9μmol/ml,再加入mgcl2离子，使mg2+离子浓度为9μmol/ml；最后加草酸根，使碳酸根离子浓度为7μmol/ml,将所述体系在4℃、ph＝8.0条件下磁珠旋转搅拌4h,制备具有热稳定的矿化蛋白。在上述制备过程中，初始体系中蛋白质、ca2+离子、mg2+离子和碳酸根离子的比例为300(ng):9(umol):9(umol):7(umol)。(二)生物特征分析(1)将矿化蛋白δply-pa44离心(5000g；5min)得到沉淀与上清，沉淀用40ulpbs重悬，分别向40ul上清和40ul重悬的沉淀中加入10ul5×loadingbuffer沸水煮10min,取10ul样本于page胶的上样孔中。电压：80v时间：30min电压：120v时间:90min,用考马斯亮蓝染液染色3min(微波炉加热3min)，最后用考马斯亮蓝脱色液脱色过夜。结果表明，矿化蛋白的上清液中未检测到蛋白质。(2)将蛋白质溶液δply-pa44,矿化蛋白δply-pa44@caco3溶液稀释50倍，电镜观察结果。结果显示矿化蛋白能形成一定大小的纳米颗粒。(3)将矿化蛋白质溶液滴于载玻片上，充分干燥，x射线能谱检测到钙离子等元素。实施例9、蛋白质为疫苗时，矿化蛋白疫苗的免疫原性分析：(1)疫苗蛋白的矿化纳米颗粒后血清中的抗体效价检测将矿化的疫苗蛋白质δa146ply-pa44@cap、δa146ply-nw@cap、δa146ply-n6@cap、δa146ply-w6@cap，进行如下实验：取6-8周龄、雌性c57bl/6小鼠随机分为11组，1.5％戊巴比妥钠麻醉，各组分别依照如下试剂及剂量皮下免疫小鼠：pbs100μl/只-δa146ply100μl/只18μg/只δa146ply+铝佐剂100μl/只18μg/只δa146ply-pa44100μl/只18μg/只δa146ply-nw100μl/只18μg/只δa146ply-n6100μl/只18μg/只δa146ply-w6100μl/只18μg/只δa146ply-pa44@cap100μl/只18μg/只δa146ply-nw@cap100μl/只18μg/只δa146ply-n6@cap100μl/只18μg/只δa146ply-w6@cap100μl/只18μg/只共免疫3次，每次间隔14天。使用相同蛋白剂量的可溶性蛋白及矿化纳米颗粒经皮下免疫小鼠，末次免疫7天后取小鼠血清检测抗δa146plyigg(图7)。结果显示，与δa146ply免疫组相比，矿化纳米颗粒免疫组产生的抗δa146plyigg抗体效价显著增加，尽管矿化纳米颗粒免疫组的抗体效价与含铝佐剂的δa146ply免疫组没有统计学差异，但仍可观察到明显增加的趋势。该结果表明，相较于可溶性蛋白及含铝佐剂的可溶性蛋白而言，矿化纳米颗粒可以诱导小鼠产生更强的体液免疫应答。结果见附图7(2)免疫矿化纳米颗粒后脾细胞因子水平的检测为了确定细胞免疫应答的效果，同上免疫小鼠，末次免疫7天后，收集脾细胞并采用免疫抗原再刺激72小时，通过elisa检测上清液中细胞因子ifn-γ，il-4和il-17a的浓度(图8)。结果显示：所有矿化纳米颗粒免疫组的脾细胞均分泌较高水平的ifn-γ，il-4和il-17a，而所有矿化纳米颗粒免疫组分泌的il-4和il-17a均显著高于可溶性蛋白组；与含铝佐剂的δa146ply免疫组相比时，三种生物矿化蛋白纳米颗粒免疫组(δa146ply-pa44@cap，δa146ply-nw@cap，δa146ply-w6@cap)的il-4的分泌量显著增高。这些数据提示矿化纳米颗粒可诱导宿主的th1/th2/th17型细胞免疫应答，其较可溶性蛋白可诱导更强的th2/th17型细胞免疫应答，而较al佐剂可诱导更强的th2型细胞免疫应答，结果见附图8。以上结果表明，磷酸钙矿化蛋白能有效提高蛋白质的热稳定性，当蛋白质为疫苗时，同时能有效提高蛋白质疫苗的免疫原性。当前第1页12