一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法与流程

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法。
背景技术：
：幽门螺杆菌(helicobacterpylori，hp)是一种螺旋状、微需氧革兰阴性杆菌，主要定植于人胃粘膜，已造成全球50％以上人口感染(leea.preventionofhelicobacterpyloriinfection.scand-j-gastroenterol.1996.suppl215:11-15.)。hp感染是慢性胃炎、消化性溃疡及胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(malt)等疾病的重要致病因子，并与胃癌的发生密切相关，已被who列为ⅰ类致癌因子。目前质子泵抑制剂加两种抗生素的三联疗法是全球推荐的hp根除治疗一线方案，但是随着抗生素在hp感染治疗中的广泛应用，hp耐药株的发生率不断上升，以致hp根除的难度加大。由于hp在胃内栖居部位的特殊性，以及现在药物治疗的不足，单纯依靠药物根除hp并不是一件易事，对hp感染所致的胃、十二指肠疾病的防治难度仍很大，必须寻找新的有效方法进行防治。借鉴人类与传染病作斗争的经验，接种疫苗有望成为预防hp感染、大幅度降低hp相关性疾病发病率的最佳途径。目前，hp疫苗取得了极大的进展，我国已成功研制出一种hp疫苗并获得新药证书，国外也有多种hp疫苗已进入临床实验。所有的研究都表明，hp疫苗需要添加粘膜免疫佐剂，才具有免疫保护效果。目前公认的最强的粘膜免疫佐剂是霍乱肠毒素(ct)和大肠杆菌不耐热肠毒素(lt)，但是ct和lt对人具有较强的毒性，限制了它们的应用。在粘膜疫苗研究中，作为佐剂的lt无毒或减毒突变体研究较多[parkej,chang0jh,kimjs,etal.themucosaladjuvanticityoftwonontoxicmutantsofescherichiacoliheat-labileenterotoxinvarieswithimmunizationroutes.exp.mol.med.,2000,32(2):72-78]，其基本原理是对lt具有肠毒素毒性的a亚单位进行氨基酸点突变，使lt不具有毒性或降低毒性，但是仍保留其很强的粘膜佐剂活性。技术实现要素：综上所述，本发明目的在于提供一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法，将hp尿素酶a亚单位富含抗原表位的基因片段插入编码lta亚单位的基因中，并替换其包含毒性部位的片段制成重组质粒，进行表达获取重组融合蛋白多聚体作为疫苗抗原，本发明融合抗原与ltb蛋白五聚体结合形成六聚体结构，既保留了lt的粘膜佐剂结构基础及活性，又去除了其毒性，通过粘膜途径免疫可有效诱导机体粘膜免疫应答，产生特异性iga抗体，提供了一种用于预防和治疗幽门螺杆菌感染的疫苗方式。本发明通过下述技术方案实现：一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白是由重组lta1-urea1蛋白和ltb蛋白构成，所述重组lta1-urea1蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述ltb蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。进一步地，所述重组融合蛋白是由重组lta1-urea1蛋白和ltb蛋白五聚体通过lta2亚单位连接构成的六聚体结构。一种编码上述重组融合蛋白的基因，所述基因是由幽门螺杆菌(helicobacterpylori，hp)的尿素酶a亚单位中富含抗原表位的基因片段插入大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labileenterotoxin，lt)基因中并替换a亚单位毒性基因片段制成。进一步地，所述编码重组融合蛋白基因的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述编码重组融合蛋白基因用于编码重组lta1-urea1蛋白和ltb蛋白。一种重组质粒，所述重组质粒包括表达载体和外源基因，所述外源基因如seqidno.3所示。所述表达载体可采用现有基因工程常用表达质粒作为表达载体。进一步地，所述表达载体为pet-11c。一种制备上述重组融合蛋白的方法，包括以下步骤：步骤a，将大肠杆菌不耐热肠毒素基因中a亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp去除以形成基础基因，并将幽门螺杆菌尿素酶a亚单位基因片段插入所述基础基因获得了lt-urea1融合基因序列；步骤b，将所述lt-urea1融合基因序列与质粒表达载体pet-11c连接，获得重组质粒pet-11c/lt-urea1；步骤c，将所述组质粒pet-11c/lt-urea1转入宿主菌进行表达获取重组融合蛋白。一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗，所述疫苗的活性成分包括上述重组融合蛋白。d-半乳糖填料(thermo，20372)仅能与ltb五聚体结合，不能与lta1-urea1蛋白结合。如果lta1-urea1蛋白与ltb蛋白五聚体解离，则纯化产物中就不含有lta1-urea1蛋白。而采用d-半乳糖填料纯化获得的产物，电泳可见lta1-urea1蛋白条带。这一结果，间接证实了lta1-urea1蛋白和ltb蛋白五聚体结合形成六聚体。本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法，将候选抗原尿素酶a亚单位中富含抗原表位的片段插入lt的a亚单位片段中并替换其毒性部位作为疫苗抗原，通过lta2片段与ltb蛋白五聚体连接，既保留了lt的粘膜佐剂结构基础及活性，又去除了其毒性，通过粘膜途径免疫可有效诱导机体粘膜免疫应答，产生特异性iga抗体，无需添加佐剂即可获得较高的免疫效果，提供了一种用于预防和治疗治疗幽门螺杆菌感染的疫苗方式，具有重要的社会价值和经济价值。附图说明此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：图1为本发明重组质粒pet-11c/lt-urea1的构建示意图；图2为本发明重组质粒酶切鉴定结果；图3为本发明sds-page观察目的蛋白表达鉴定结果；图4为本发明蛋白纯化鉴定结果；图5为对比例重组质粒pet-22b/urea-1构建示意图；图6为对比例urea-1蛋白表达鉴定结果；图7为对比例urea-1蛋白纯化鉴定结果；图8为唾液特异性iga检测结果；图9为血清特异性igg检测结果。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。实施例1合成基因：以genbank公布的大肠杆菌不耐热肠毒素基因(genbank:ab011677.1)核酸序列为模板进行改造，具体设计如下：编码lt的基因全长1148bp，包括：lta信号肽(18个氨基酸)基因、编码lta(240个氨基酸)的基因、编码ltb信号肽(21个氨基酸)基因及编码ltb(103个氨基酸)的基因。在编码lta的基因末尾与编码ltb信号肽基因开头处有一个移码阅读框，因而编码整个lt的基因是一个连续的dna序列。其完整基因核苷酸序列如seqidno.4所示。经生物信息学分析及结构分析，去除lta亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp，将幽门螺杆菌尿素酶a亚单位基因片段urea1插入其中以替换去除的lta亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp，并在5’端引入ndei酶切位点，3’端引入bamhi酶切位点，形成编码重组融合蛋白的融合基因lt-urea1，其核苷酸序列如seqidno.3所示。所述幽门螺杆菌尿素酶a亚单位基因片段urea1核苷酸序列如seqidno.5所示。合成基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。实施例2重组质粒pet-11c/lt-urea1的构建，如图1所示：表达载体采用pet-11c，购于novagen公司。该表达载体携带氨苄抗性基因，是化学物质iptg诱导控制的模式，表达水平高。未诱导前iaciq编码阻遏蛋白，该蛋白可同操纵子中的操纵基因相结合，从而控制相邻结构基因的转录作用；当诱导物存在时，阻遏蛋白因受诱导物的作用，其构形发生变化，从而失去同操纵基因的亲和性而解脱下来，聚合酶便可对结构基因进行转录，进而进行表达。在该质粒ndei位点后插入含有lta信号肽的重组目的基因及含有ltb信号肽的ltb基因，pet-11c能在宿主菌中共表达重组目的蛋白lta1-urea1及ltb蛋白，利用lta及ltb信号肽，分别将目的蛋白lta1-urea1蛋白和ltb蛋白分泌至胞周质组装成lta1-urea1+5ltb的六聚体而发挥相应的靶向和佐剂作用。编码蛋白lta1-urea1蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，编码ltb蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。将合成基因序列，上游引入ndei、下游引入bamhi酶切位点，双酶切后连接经同样酶双酶切的pet-11c，酶切反应体系配制如表1所示：表1重组质粒构建酶切反应体系将上述反应物混匀，酶切，经琼脂糖凝胶电泳观察，酶切鉴定结果如图2所示。转化e.coli/dh5a感受态，氨苄抗性lb平板37℃培养，调取单菌落用氨苄抗性液体lb培养基培养，提取重组质粒测序鉴定，质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，融合基因序列与预计完全一致。实施例3目的蛋白表达、纯化及鉴定：宿主菌采用e.coli/bl21(de3)，购于天根生化科技(北京)有限公司。基因型：f-omptgaldcmlonhsdsb(rb-mb-)λ(de3[lacilacuv5-t7gene1ind1sam7nin5])。该菌株用于以t7rna聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。t7噬菌体rna聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体de3区的lacuv5启动子，该区整合于bl21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。(1)转化取重组质粒pet-11c/lt-urea1转化e.coli/bl21(de3)感受态细胞(tiangen，code：cb105)，按操作说明书进行，氨苄抗性lb平板筛选阳性重组子。(2)重组工程菌鉴定挑取氨苄抗性筛选平板上的单个菌落，接种10ml氨苄抗性lb液体培养基中培养，抽提质粒，用ndei和bamhi做双酶切鉴定，鉴定结果如图2所示，见5.6kb表达载体片段和996bplt-urea1基因片段，lane1：pet-11c/lt-urea1经ndei和bamhi双酶产物，lane2：核酸marker(takara，dl5000)。(3)表达鉴定(a)取鉴定正确的菌液，加入氨苄抗性lb培养基中，37℃，振荡培养；然后加入miptg，16℃诱导表达。(b)细菌破碎：将诱导表达后的菌液取出，离心处理，弃上清，加入pbs重悬，冰水浴超声破菌。取样涂片革兰染色镜检，见破菌完全后，取上清离心处理，分离上清和沉淀。(c)sds-page观察目的蛋白表达情况：分别取破菌未离心样品(全菌)、离心后上清及沉淀样品，调整至适合的浓度，以lt及未诱导全菌样品作对照，用5×sds-page上样buffer处理后，各15μl上样，进行15％sds-page电泳观察结果，如图3所示。lane1：16诱导前全菌，lane2：16诱导后全菌，lane3：16诱导后超声上清，lane4：蛋白marker(thermo，26616)，lane5：16诱导后超声沉淀。见21.1kd重组lta1-urea1表达及11.7kdltb表达，如图中箭头所指。(4)目的蛋白纯化鉴定(a)取d-半乳糖填料(thermo，20372)1ml，按说明书操作，用pbs洗涤，将诱导表达的菌体超声破菌上清10ml加入层析柱中，室温结合1h。(b)用pbs洗涤，用含300mmd-半乳糖的pbs洗脱，分管收集。(c)sds-page观察目的蛋白表达情况：取15μl样品上样，进行15％sds-page电泳观察结果，如图4所示，lane1：蛋白marker(thermo，26616)，lane2-5：纯化样品，见21.1kdlta1-urea1及11.7kdltb条带。对比例urea-1蛋白的制备，所述urea-1蛋白的氨基酸序列如seqidno.6所示：1、pet-22b/urea-1重组质粒获得采用幽门螺杆菌尿素酶a亚单位基因片段urea1编码urea1，所述幽门螺杆菌尿素酶a亚单位基因片段urea1核苷酸序列如seqidno.5所示，上游引入ndei、下游引入xhoi酶切位点，插入pet-22b(+)中构建重组质粒，pet-22b(+)购自novagen(69744-3)。重组质粒构建结构示意图如图5所示。2、urea-1的蛋白表达(1)表达取pet-22b/urea-1质粒转化e.coli/bl21(de3)感受态细胞(tiangen，code：cb105)，按操作说明书进行，氨苄抗性lb平板筛选阳性重组子。挑取氨苄抗性筛选平板上的单个菌落，接种10ml氨苄抗性lb液体培养基中培养，抽提质粒，用ndei和bamhi做双酶切鉴定。取鉴定正确的菌液，接种氨苄抗性的lb培养基中，振荡培养。加入iptg，37℃诱导表达。3、urea-1的蛋白鉴定(1)细菌破碎将诱导表达后的菌液取出，离心处理，弃上清，加入a液重悬(a液：50mmpb(ph7.4)+300mmnacl+50mmimidazole)，冰水浴超声破菌。取样涂片革兰染色镜检，见破菌完全后，离心处理，分离上清和沉淀。(2)纯化用镍离子亲和柱纯化破菌上清(histraptmff，ge)，a液：50mmpb(ph7.4)+300mmnacl+50mmimidazole，b液：50mmpb(ph7.4)+300mmnacl+200mmimidazole。分管收集纯化样品。(3)sds-page观察目的蛋白表达情况分别取破菌未离心样品(全菌)、离心后上清及沉淀样品，调整至适合的浓度，以lt及未诱导全菌样品作对照，用5×sds-page上样buffer处理后，各15μl上样，进行15％sds-page电泳观察结果，urea-1表达如图6所示，lane1：诱导前全菌，lane2：诱导后超声沉淀，lane3：诱导后超声上清，lane4：诱导后全菌，见蛋白表达(箭头所示)。urea-1纯化和如图7所示，lane1-4：urea-1纯化样品，lane5：蛋白marker(thermo，26616)，纯化获得12.6kd蛋白。免疫性能测试：(一)、免疫原性检测以纯化实施例1制备的重组蛋为免疫原，分别通过注射(50μg)和灌胃(200μg)方式免疫小鼠，检测血清、唾液特异性抗体，以鉴定重组蛋白的免疫原性。1、实验动物：balb/c小鼠，6～8周龄，雌性，spf级，60只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。2、动物分组，如表1所示：表1实施例制备的重组融合蛋白a1和对比例制备的urea-1蛋白免疫原性检测动物分组分组动物数(只)抗原及免疫剂量免疫方式1组10a150μg/只注射2组10a1200μg/只灌胃3组10urea-150μg/只注射4组10urea-1200μg/只灌胃5组10pbs注射6组10pbs灌胃注：本发明制备的重组融合蛋白命名为a1。3、免疫方案动物分别于0、7、14天免疫，共3次。4、特异性抗体检测免疫后21天，采集血液和唾液标本，elisa检测抗原特异性血清igg及唾液siga。每个样品做双重复。(1)酶标板包被取urea-1蛋白，用包被液(碳酸盐缓冲液，ph9.6)稀释为4μg/ml，100μl/孔包被酶标板，封闭后4℃保存备用。(2)标本稀释：以抗体稀释液按1：1000稀释血清；1：5稀释唾液。(3)加样：按100μl/孔向酶标板加入稀释后的待检测样品，37℃放置60min，pbst洗涤4次，拍干。(4)抗体稀释：以抗体稀释液按1：10000分别稀释辣根酶标记羊抗小鼠igg及辣根酶标记羊抗小鼠iga。(5)加二抗：按100μl/孔向酶标板加入抗体，37℃放置40min，pbst洗涤4次，拍干；(6)显色：向各孔加入100μl显色液，37℃显色10min，50μl/孔加入2mh2so4终止反应。(7)结果记录：测定450nm各孔吸光度值，保存数据。测定结果如图8和图9所示，经统计学分析(t检验)，a1蛋白免疫组与urea1蛋白免疫组及pbs组比较，a1蛋白免疫组唾液抗原特异性siga水平显著升高(p<0.01)，血清抗原特异性igg水平也显著升高(p<0.01)。urea1蛋白免疫组与pbs组比较，唾液抗原特异性siga及血清抗原特异性igg水平均无显著性差异(p>0.05)。口服免疫a1蛋白有利于唾液抗原特异性siga水平升高(2组与1组比较，p<0.01)，注射免疫a1蛋白有利于血清抗原特异性igg水平升高(1组与2组比较，p<0.01)。以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>成都亿妙生物科技有限公司<120>一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法<130>1<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>203<212>prt<213>重组lta1-urea1蛋白的氨基酸序列<400>1metlysasnilethrpheilephepheileleuleualaserproleu151015tyralaasnglyasplysleutyrargalaaspserargproproasp202530gluprotrplysleuthrprolysgluleuasplysleumetleuhis354045tyralaglygluleualaarglysarglysglulysglyilelysleu505560asntyrvalglualavalalaleuileseralahisilemetgluglu65707580alaargalaglylyslysthralaalagluleumetglngluglyarg859095thrleuleulysproaspaspvalmetaspglyvalalasermetile100105110hisgluvalglyileglualametpheproaspglythrlysleuval115120125thrvalhisthrproileglualaasnglyleugluprotrpilehis130135140hisalaproglnglycysglyasnserserargthrilethraspasp145150155160thrcysasnglugluthrglnasnleuserthriletyrleuarglys165170175tyrglnserlysvallysargglnilepheserasptyrglnserasp180185190ileasplyshisasnargileargaspgluleu195200<210>2<211>124<212>prt<213>ltb蛋白的氨基酸序列<400>2metasnlysvallyscystyrvalleuphethralaleuleuserser151015leucysalatyrglyalaproglnserilethrgluleucysserglu202530tyrargasnthrglniletyrthrileasnasplysileleusertyr354045thrglusermetalaglylysargglumetvalileilethrphelys505560serglyalathrpheglnvalgluvalproglyserglnhisileasp65707580serglnlyslysalailegluargmetlysaspthrleuargilethr859095tyrleuthrgluthrlysileasplysleucysvaltrpasnasnlys100105110thrproasnserilealaalailesermetgluasn115120<210>3<211>987<212>dna<213>编码重组融合蛋白基因的核苷酸序列<400>3catatgaaaaatataactttcattttttttattttattagcatcgccattatatgcaaat60ggcgacaaattataccgtgctgactctagacccccagatgaaccatggaaactcacccca120aaagagttagataagttgatgctccactacgctggagaattagctaggaaacgcaaagaa180aaaggcattaagcttaactatgtggaagcggtagctttgattagtgcccatattatggaa240gaagcgagagctggtaaaaagactgcggctgaattgatgcaagaagggcgcactctttta300aaaccggatgatgtgatggatggtgtggcaagcatgatccatgaagtgggtattgaagcg360atgtttcctgatgggaccaaactcgtaaccgtgcatacccctattgaggctaatggtctc420gagccctggattcatcatgcaccacaaggttgtggaaattcatcaagaacaattacagat480gatacttgtaatgaggagacccagaatctgagcacaatatatctcaggaaatatcaatca540aaagttaagaggcagatattttcagactatcagtcagatattgacaaacataacagaatt600cgggatgaattataaagtaaaatgttatgttttatttacggcgttactatcctctctatg660tgcatacggagctccccagtctattacagaactatgttcggaatatcgcaacacacaaat720atatacgataaatgacaagatactatcatatacggaatcgatggcaggtaaaagagaaat780ggttatcattacatttaagagcggcgcaacatttcaggtcgaagtcccgggcagtcaaca840tatagactcccaaaaaaaagccattgaaaggatgaaggacacattaagaatcacatatct900gaccgagaccaaaattgataaattatgtgtatggaataataaaacccccaattcaattgc960ggcaatcagtatggaaaactaggatcc987<210>4<211>1148<212>dna<213>大肠杆菌不耐热肠毒素完整基因序列<400>4atgaaaaatataactttcattttttttattttattagcatcgccattatatgcaaatggc60gacaaattataccgtgctgactctagacccccagatgaaataaaacgttccggaggtctt120atgcccagagggcataatgagtacttcgatagaggaactcaaatgaatattaatctttat180gatcacgcgagaggaacacaaaccggctttgtcagatatgatgacggatatgtttccact240tctcttagtttgagaagtgctcacttagcaggacagtctatattatcaggatattccact300tactatatatatgttatagcgacagcaccaaatatgtttaatgttaatgatgtattaggc360gtatacagccctcacccatatgaacaggaggtttctgcgttaggtggaataccatattct420cagatatatggatggtatcgtgttaattttggtgtaattgatgaacgattacatcgtaac480agggaatatagagaccggtattacagaaatctgaatatagctccggcagaggatggttac540agattagcaggtttcccaccggatcaccaagcttggagagaagaaccctggattcatcat600gcaccacaaggttgtggaaattcatcaagaacaattacagatgatacttgtaatgaggag660acccagaatctgagcacaatatatctcaggaaatatcaatcaaaagttaagaggcagata720ttttcagactatcagtcagaggttgacatatataacagaattcgggatgaattatgaata780aagtaaaatgttatgttttatttacggcgttactatcctctctatgtgcatacggagctc840cccagtctattacagaactatgttcggaatatcgcaacacacaaatatatacgataaatg900acaagatactatcatatacggaatcgatggcaggtaaaagagaaatggttatcattacat960ttaagagcggcgcaacatttcaggtcgaagtcccgggcagtcaacatatagactcccaaa1020aaaaagccattgaaaggatgaaggacacattaagaatcacatatctgaccgagaccaaaa1080ttgataaattatgtgtatggaataataaaacccccaattcaattgcggcaatcagtatgg1140aaaactag1148<210>5<211>342<212>dna<213>幽门螺杆菌尿素酶a亚单位基因片段核苷酸序列<400>5catatgaaactcaccccaaaagagttagataagttgatgctccactacgctggagaatta60gctaggaaacgcaaagaaaaaggcattaagcttaactatgtggaagcggtagctttgatt120agtgcccatattatggaagaagcgagagctggtaaaaagactgcggctgaattgatgcaa180gaagggcgcactcttttaaaaccggatgatgtgatggatggtgtggcaagcatgatccat240gaagtgggtattgaagcgatgtttcctgatgggaccaaactcgtaaccgtgcatacccct300attgaggctaatggtctcgagcaccaccaccaccaccactga342<210>6<211>112<212>prt<213>urea-1蛋白的氨基酸序列<400>6metlysleuthrprolysgluleuasplysleumetleuhistyrala151015glygluleualaarglysarglysglulysglyilelysleuasntyr202530valglualavalalaleuileseralahisilemetgluglualaarg354045alaglylyslysthralaalagluleumetglngluglyargthrleu505560leulysproaspaspvalmetaspglyvalalasermetilehisglu65707580valglyileglualametpheproaspglythrlysleuvalthrval859095histhrproileglualaasnglyleugluhishishishishishis100105110当前第1页12