本发明涉及生物医药领域,具体而言,涉及一种乌司他丁融合蛋白及其制备方法与应用。
背景技术:
乌司他丁是含有两个kunitz型结构域的单链糖蛋白,是重要的尿胰蛋白酶抑制剂(urinarytrypsininhibitor,uti)。在人体细胞中,uti是由a-microglobulinprecursor(ambp)基因编码,含有10个外显子和9个内含子。成熟的基因编码产物含有147个氨基酸。乌司他丁对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、白细胞弹力蛋白酶、纤溶酶等在内的多种蛋白酶具有较强的抑制作用。此外uti还在抗炎、抗休克、抑制肿瘤细胞转移等方面起作用。
乌司他丁最初是从人尿中提取获得。从人尿中来源的乌司他丁含有共价结合的硫酸软骨素分子,并且高度糖基化。最初人们认为共价结合的硫酸软骨素以及糖基化对乌司他丁的生物活性至关重要,然而德国bayeraltiengsellschaft公司证明糖基化并非uti活性所必需。而后的研究表明,利用大肠杆菌(e.coli)表达的重组乌司他丁也同样具有对胰蛋白酶的抑制作用。由于利用基因工程技术表达重组蛋白可以避免从尿液中提取蛋白存在的来源限制、样品污染、后提取工艺复杂等,目前已成为获得乌司他丁的最佳途径。然而,目前利用基因工程手段从e.coli等微生物中获得的重组乌司他丁产量仍然低,难以满足商业化要求。
此外,根据文献报道,自人尿提取的乌司他丁给健康正常男性30万单位/10ml静脉注射给药后,3小时内血药浓度直线下降,清除半衰期为40分钟;给药后6小时给药量的24%从尿中排泄。研制长效的乌司他丁可以降低给药剂量、减少给药次数,具有良好的临床应用效益。
有鉴于此,特提出本发明。
技术实现要素:
本发明目的在于提供一种乌司他丁融合蛋白,并提供了其制备与应用。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
本发明涉及一种乌司他丁融合蛋白,其结构为uti-rhsa所示;
其中,uti为乌司他丁,或其部分片段、突变体和缺失体;
rhsa为人血白蛋白,或其部分片段、突变体和缺失体。
1909年,beuer和berich首次报道了尿液中存在蛋白酶抑制剂(urinarytrypsininhibitor,uti),现在也多称之为乌司他丁(ulinastatin),其在治疗急性胰腺炎、辅助治疗休克、改善手术预后尤其是减少体外循环并发症等方面有重要的作用,加上其本身来源于人体,无免疫原性,安全性高。
本发明所提供的乌司他丁融合蛋白,生物效价好,且具有更长的半衰期,且蛋白序列本身来源于人体,无免疫原性,安全性高。
其中,“部分片段、突变体和缺失体”的选择为仍具有uti或rhsa活性的多肽片段,其选择方式为本领域技术人员所熟知。
优选的,如上所述的乌司他丁融合蛋白,所述uti的氨基酸序列如seqidno:1所示。
优选的,如上所述的乌司他丁融合蛋白,所述rhsa的氨基酸序列如seqidno:2所示。
优选的,如上所述的乌司他丁融合蛋白,所述uti与所述rhsa还包括linker;
优选的,所述linker的氨基酸数目为1~30个;氨基酸数量可以是1,2,3,4,5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个;
优选的,所述linker的序列选自(ggggs)n、(gggs)n、(ggs)n或gn,其中n可以是1,2,3,4,5或6;
优选的,所述linker的氨基酸序列如seqidno:3所示。
根据本发明的一方面,本发明还涉及编码权利要求如上所述的乌司他丁融合蛋白的核苷酸序列。
优选的,编码所述uti的核苷酸序列如seqidno:4所示;
优选的,编码所述rhsa的核苷酸序列如seqidno:5所示;
优选的,编码所述linker的核苷酸序列如seqidno:6所示。
根据本发明的一方面,本发明还涉及一种表达盒,其含有如上所述的核苷酸序列;
优选的,所述表达盒还包括表达蛋白二硫化物异构酶pdi的核苷酸序列;
天然二硫键的形成是许多蛋白正确折叠中的限速步骤,在稳定蛋白质构象和保持蛋白质活性方面起重要作用。二硫化物异构酶(proteindisulfideisomerase,pdi)是内质网中一种重要的蛋白折叠催化剂,它催化蛋白二硫键的形成和错误配对二硫键的重排,并有抑制错误折叠蛋白聚集的分子伴侣活性。
优选的,所述pdi的核苷酸序列位于所述rhsa的下游;
优选的,所述pdi的核苷酸序列如seqidno:7所示。
优选的,如上所述的表达盒,在所述rhsa与所述pdi之间包括启动子元件;
优选的,所述启动子元件的核苷酸序列如seqidno:8所示。
根据本发明的一方面,本发明还涉及一种重组载体,其含有如上所述的核苷酸序列,或如上所述的表达盒。
本发明进一步包含至少一种编码如上所述的核酸分子的核构建体,优选为表达载体,比如质粒,在本申请的一个实施例中会介绍该载体的构建方法。
根据本发明的一方面,本发明还涉及一种宿主细胞,其被如上所述的核苷酸序列,或如上所述的表达盒,或如上所述的重组载体所转化;
所述宿主细胞是真核细胞,比如酵母,优选为毕赤酵母。
根据本发明的一方面,本发明还涉及一种制备乌司他丁融合蛋白的方法,包括:
在培养基中和合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞;
从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的乌司他丁融合蛋白。
如上所述的乌司他丁融合蛋白在制备用于治疗和/或预防肿瘤、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、变态反应以及感染的药物中的应用;
优选的,所述肿瘤包括:白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤;
优选的,所述自身免疫性疾病包括:关节炎、风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、扩张型心肌病样疾病、斯耶格伦氏综合征、过敏性接触性皮炎、多肌炎、硬皮病、动脉周性多动脉炎、风湿热、白癜风、胰岛素依赖性糖尿病、白塞氏综合征和慢性甲状腺炎;
优选的,所述神经退行性疾病包括:帕金森氏病、亨廷顿氏病、马查多-约瑟夫病、肌萎缩性侧索硬化症、克罗伊茨费尔特-雅各布病。
本发明利用毕赤酵母表达系统成功表达了乌司他丁与人血清白蛋白的融合蛋白,构建了用于表达重组乌司他丁的质粒,在表达质粒中引入了与蛋白折叠和分泌相关的二硫键异构酶基因(pdi),及启动子元件pgap,并将pdi基因正确连接到pgap下游,实现了重组uti与人血白蛋白的融合蛋白的高量表达,融合蛋白经纯化后具有与重组uti基本相同的抑制胰蛋白酶的活性、在小鼠上与重组uti相比具有更长的半衰期。本发明研制的uti人血白蛋白融合蛋白具有重要的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为质粒ppicza::uti-rhsa构建示意图;
图2为质粒picza::uti构建示意图;
图3为质粒peasy-t3-pgap-pdi构建示意图;
图4为质粒ppicza::uti-rhsa-pdi构建示意图;
图5为发酵上清电泳图;a:ppbuh-uh上清;b:ppbuh-ulh上清;c:ppbuh-uhp上清;d:ppbuh-ulhp上清;
图6为发酵上清和蛋白纯化液sds-page电泳图;a:ppbuh-uhp上清;b:ppbuh-ulhp上清;c:uti-hsa纯化液;d:uti-l-hsa纯化液;e:uti纯化液。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例
1.毕赤酵母表达载体ppicza::uti-rhsa和ppicza::uti-l-rhsa的构建
根据毕赤酵母的密码子偏好性,设计乌司他丁的基因序列seqidno:4和人血白蛋白的基因序列seqidno:5及linker(连接区)的基因序列seqidno:6,并提交华大公司全基因合成,不含linker的融合蛋白的uti-rhsa序列以及含linker的融合蛋白的uti-l-rhsa序列。在融合蛋白基因的两端分别引入xhoi和kpni的酶切位点,通过双酶切后插入到同样双酶切的酵母表达载体picza中,经t4连接酶连接后,转化感受态大肠杆菌top10,阳性克隆经测序验证正确后提取质粒分别命名为:picza::uti-rhsa,picza::uti-l-rhsa。
质粒picza::uti-rhsa的图谱如图1所示。
2.uti表达质粒构建
以putif:gttactcgaggtccatgtatgggtatgacttctagatac;和putir:gattggtacctcagagaccgagagcagc为上下游引物(分别引入了xhoi和kpni的酶切位点),以合成基因uti-rhsa为模板进行pcr扩增uti基因,pcr产物经胶试剂盒回收后以xhoi和kpni双酶切回收,与同样双酶切的酵母表达载体picza进行连接,经t4连接酶连接后,转化感受态大肠杆菌top10,阳性克隆经测序验证正确后提取质粒分别命名为:picza::uti,即为uti表达质粒,其质粒图谱如图2所示。
3.二硫键异构酶基因(pdi)的克隆与ppicza::uti-rhsa-pdi和ppicza::uti-l-rhsa-pdi的构建
从毕赤酵母gs115中克隆了与蛋白折叠和分泌相关的二硫键异构酶基因(pdi),同时克隆了高效表达启动子元件pgap,并将pdi基因正确连接到pgap下游,构建pdi表达元件。提取毕赤酵母gs115的基因组,以基因组为模板以ppgapf(agatctatgtcttggtgtcctcgtc)和ppgapr(aagcttaataccgacagtgatagcc)分别为上下游引物(两端分别设计了bglii和hindiii的酶切位点)pcr扩增获得启动子元件pgap(序列如seqidno:8所示),将此pcr产物用bglii和hindiii双酶切后插入到同样双酶切的质粒peasy-t3中,转化感受态大肠杆菌后挑选单克隆测序正确后提取质粒备用,即为质粒peasy-t3-pgap。以毕赤酵母gs115的基因组模板以pppdif(aagcttaaagaactgcccgatgaac)和pppdir(gcggccgcaggccaaccacaagatgaa)分别为上下游引物(两端分别设计了hindiii和noti的酶切位点)pcr扩增获得pdi基因(序列如seqidno:7所示),将此pcr产物用hindiii和noti双酶切后插入到同样双酶切的质粒peasy-t3-pgap中,转化感受态大肠杆菌后挑选单克隆测序正确后提取质粒备用,即为质粒peasy-t3-pgap-pdi,质粒图谱如图3所示。
用noti将含有pgap-pdi的dna片段从peasy-t3-pgap-pdi质粒中切下来,并插入到前期工作构建的ppicza::uti-rhsa和ppicza::uti-l-rhsa质粒的noti酶切位点,得到质粒ppicza::uti-rhsa-pdi和ppicza::uti-l-rhsa-pdi。质粒ppicza::uti-rhsa-pdi的质粒图谱如图4所示。
4.表达融合蛋白重组菌株的构建和高效表达融合蛋白的重组菌株的筛选
将构建的表达质粒ppicza::uti-rhsa,ppicza::uti-l-rhsa,ppicza::uti-rhsa-pdi和ppicza::uti-l-rhsa-pdi以及ppicza::uti分别用bglii酶切获得线性化的表达质粒,通过电击转化导入毕赤酵母gs115中,并涂布于含有100μg/ml的zeocin的ypd平板上。28℃培养3天,随机挑取多个单克隆转接到新鲜的含有100μg/ml的zeocin的ypd平板上,并分别提取基因组dna进行pcr验证。以puhf(atgggtatgacttctagatacttc)和puhr(tcagagaccgagagcagcctg)分别为上下游引物,表达质粒ppicza::uti-rhsa,ppicza::uti-l-rhsa,ppicza::uti-rhsa-pdi和ppicza::uti-l-rhsa-pdi的转化菌株应能够扩增出约2100bp的dna片段。以putif和putir为上下游引物,ppicza::uti的转化菌株应能够扩增出约530bp的dna片段。每个重组菌株随机挑取36个单克隆,分别接种于含有3mlbmgy的大试管中,于28℃,220rpm培养18小时。取培养物于室温下3000g离心1分钟,收集菌体,并用2mlbmmy重新悬浮菌体,于28℃,220rpm继续培养。每隔24小时向培养基中添加100%甲醇至终浓度1%。培养3天后,离心收集发酵液上清。通过page胶检测融合蛋白的表达情况,最终获得了表达量相对较高的转化子,表达质粒ppicza::uti-rhsa,ppicza::uti-l-rhsa,ppicza::uti-rhsa-pdi,ppicza::uti-l-rhsa-pdi和ppicza::uti转化毕赤酵母gs115获得的表达量高的重组菌株分别命名为ppbuh-uh,ppbuh-ulh,ppbuh-uhp和ppbuh-ulhp,pputi。
有pdi共表达的菌株ppbuh-uhp、ppbuh-ulhp较没有pdi共表达的菌株ppbuh-uh、ppbuh-ulh的uti融合蛋白的表达量较高,如图5所示。
5.uti及uti融合蛋白重组菌株的摇瓶发酵及融合蛋白纯化
将融合蛋白的表达菌株ppbuh-uhp和ppbuh-ulhp,分别涂含有100μg/ml的zeocin的ypd平板上,自平板挑取单克隆接种到5mlypd试管中,30℃、250rpm培养过夜,18h后od600应在15左右,再按按1‰接种量接种于100mlbmgy摇瓶中,30℃、250rpm培养24小时,3000g离心后收集菌体,将菌体悬于110mlbmmy中,加入终浓度为0.5%的甲醇,30℃、250rpm继续培养,每24h补加一次甲醇并测量od600,培养110小时后结束培养。5000g收集菌液上清。各取发酵上清约100ml,用10mmtrisph:8.5缓冲液稀释至250ml,用固体tris将稀释后的发酵上清ph值调节至8.5,上阴离子交换层析qff。以含0.1mnacl的10mmtrisph8.5缓冲液冲洗,以含nacl0.1m至1.0m的10mmtrisph8.5缓冲液作连续梯度洗脱,收集到2个蛋白峰,用sds-page检测,样品上样过程中的流穿峰和0.1mnacl的冲洗峰中均无目标蛋白,目标蛋白基本在2个洗脱峰中,合并洗脱峰,通过截留10k的超滤离心管将缓冲液换为20mmph7.2的pb缓冲液中。因融合蛋白中含有人白蛋白,可用ge公司的bluesepharosehp亲合层析,将换液后的蛋白液上bluesepharosehp层析柱,用含nacl0-1.5m的ph7.2的pb缓冲液做连续梯度洗脱,收集蛋白峰。接下来进行疏水层析,用5mnacl将样品电导值调至155ms/cm左右,蛋白样品上ge公司的苯基高密疏水层析,缓冲液为buffera:10mmtrisph:7.52.5mnacl,bufferb:10mmtrisph:7.5。冲洗条件为100%buffera,洗脱条件为0-100%bufferb,收集蛋白洗脱峰,用截留10k的超滤离心管将缓冲液换为20mmph7.2的pb缓冲液中,用0.22um的除菌滤器过滤后即为纯化液于-20℃冰箱备用。
表达菌株pputi涂含有100μg/ml的zeocin的ypd平板上,自平板挑取单克隆接种到5mlypd试管中,30℃、250rpm培养过夜,再按按1‰接种量接种于100mlbmgy摇瓶中,30℃、250rpm培养24小时,3000g离心后收集菌体,将菌体悬于110mlbmmy中,加入终浓度为0.5%的甲醇,30℃、250rpm继续培养,每24h补加一次甲醇并测量od600,培养110小时后结束培养。5000g收集菌液上清。各取发酵上清约100ml,用10mmtrisph:8.5缓冲液稀释至250ml,用固体tris将稀释后的发酵上清ph值调节至8.5,上阴离子交换层析qff。以含0.1mnacl的10mmtrisph8.5缓冲液冲洗,以含nacl0.1m至1.0m的10mmtrisph8.5缓冲液作连续梯度洗脱,收集蛋白峰,用sds-page检测,合并目标蛋白峰,通过截留10k的超滤离心管将缓冲液换为20mmph7.2的pb缓冲液中。用5mnacl将样品电导值调至160ms/cm左右,蛋白样品上ge公司的苯基高密疏水层析,缓冲液为buffera:10mmtrisph:7.52.5mnacl,bufferb:10mmtrisph:7.5。冲洗条件为100%buffera,洗脱条件为0-100%bufferb,收集蛋白洗脱峰,用截留10k的超滤离心管将缓冲液换为20mmph7.2的pb缓冲液中,用0.22um的除菌滤器过滤后即为纯化液于-20℃冰箱备用。ppbuh-uhp和ppbuh-ulhp发酵上清以及纯化的uti蛋白、融合蛋白uti-rhsa,uti-l-rhsa的电泳结果如图6所示,纯化后的uti,uti-rhsa,uti-l-rhsa的纯度在95%以上。
6.生物活性的检测
按照《中国药典》2015年版二部p83-84中乌司他丁溶液效价测定方法进行,以人尿中提取的乌司他丁作对照,结果如下表所示,人尿中提取的乌司他丁的效价为3600u/mg,重组表达的uti活性为3700u/mg,而融合蛋白uti-rhsa与uti-l-rhsa的比活按摩尔浓度计算与uti相当,在4.4-5.0万u/nmol之间。
表1效价检测结果
7.小鼠异常毒性试验和大鼠血药浓度检测
取纯化后的uti和uti-rhsa为实验组,分别以腹腔给药方式,按5mg/kg剂量注射babl/c小鼠(体重18-22g),以生理盐水为阴性对照组,每组小鼠5只,观察各组的异常情况,观察7天,检测体重变化。结果如下表所示,各组小鼠体重增加,均无异常。
表2小鼠异常毒性结果
取纯化后的uti和uti-rhsa为实验组,以静脉注射给药方式,按1.0mg/kg/剂量注射sd大鼠(体重230-250g),以生理盐水为阴性对照组,每组大鼠3只,自尾静脉取血,取血时间点为0,5min,20min,60min,120min,以elisa法检测血中uti(包被兔抗uti多抗过夜,封闭后加稀释100倍以上的血清样品,加抗uti鼠源单抗和羊抗小鼠酶标抗体,tmb显色,2m硫酸终止反应,450nm比色)elisa检测的od值大于0.15判定为阳性,每份血清自100倍稀释,以后倍比稀释,计算每份血清检测结果为阳性时的最大稀释倍数计为滴度,每组3只大鼠的滴度结果取几何平均值,阴性结果计为n,各组的结果如下表所示,uti组的滴度在5分钟最大为102400,以后快速下降,半衰期小于20分钟,在120分钟时滴度仅为4031;融合蛋白uti-rhsa组的滴度也是在5分钟最大;由于融合蛋白和uti给药的质量相同但融合蛋白的分子量是uti分子量的6.6倍,所以检测的血清滴度也相差4倍左右,但融合蛋白的血清半衰期比uti组应明显延长,融合蛋白组半衰期应在20分钟以上,在120分钟时滴度仍有5080。融合蛋白较uti的血清半衰期明显延长。
表3uti和uti-rhsa在大鼠血清中含量elisa检测结果
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,但本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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<110>北京百华百汇生物科技有限公司
<120>乌司他丁融合蛋白及其制备与应用
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