一种用于诊断MITF易位性肾癌的分离探针组合及其应用的制作方法

本发明属于荧光原位杂交探针应用领域，涉及一种用于诊断mitf易位性肾癌的分离探针组合及其在制备mitf易位性肾癌诊断试剂中的应用。

背景技术：

2016年新版who肾脏肿瘤病理组织学分类新增了一种肾细胞癌类型：mit家族易位性肾细胞癌。mit家族是小眼畸形转录因子家族(microphthalmia-associatedtranscriptionfactorfamily)的缩写，该家族成员包括mitf，tfe3、tfeb和tfec基因。

目前已经发现的mit家族易位性肾细胞癌包括xp11.2易位/tfe3基因融合相关性肾细胞癌和t(6；11)(p21；q12)易位/tfeb基因融合相关性肾癌。mitf和tfec基因易位的肿瘤在世界范围内暂无文献报道。

mit家族易位性肾细胞癌致病机理清晰明确，mit家族成员基因(tfe3/tfeb)的易位是其关键致病因素：这类肿瘤均涉及mit家族成员基因同其它染色体易位及其所致形成融合基因，通过启动子变换从而高表达tfe3/tfeb融合蛋白，而tfe3/tfeb作为一个转录因子，通过与特异的dna结构相结合，转录调控体内多种基因表达最终致病。目前至少有10种不同的易位伴侣和融合基因被报道，包括aspl-tfe3、prcc-tfe3、sfpq-tfe3、nono-tfe3、cltc-tfe3、luc7l3-tfe3、khsrp-tfe3、parp14-tfe3、dvl2-tfe3、rbm10-tfe3和malat1-tfeb等，每例肿瘤内仅存在单一的易位形式。

mit家族易位性肾细胞癌是一罕见类型肿瘤，tfe3基因易位性肾癌约占所有肾细胞癌的1.6％-4％，tfeb基因易位性肾癌相对更加罕见。但该疾病以发病年龄轻为突出特征，占儿童肾细胞癌的40％，且造成极其沉重的家庭及社会负担。此外，有明确证据表明mit家族易位性肾细胞癌的患者对血管内皮生长因子受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor，vegfr)或哺乳动物雷帕霉素(mammaliantargetofrapamycin，mtor)分子靶向治疗敏感。另有研究表明，met酪氨酸激酶为aspl-tfe3融合基因的靶基因，并有望成为tfe3易位性肿瘤的治疗靶点。因此，精确诊断此类肿瘤显得十分重要。

本发明团队通过高通量测序技术，在一例形态学符合mit家族易位性肾细胞癌特征的病例中检测出prcc-mitf融合基因，该融合基因型为首次发现，国内外均无报道，且这是国际首次发现mitf基因易位相关性肾细胞癌。由于以往没有针对该基因易位的检测手段，可以猜想，以往的mitf基因易位相关性肾细胞癌都被误诊或漏诊了。

目前高通量测序是唯一可以明确未知易位位点的检测手段，然而高通量测序费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广，对于大多数患者来说也不是首选检测手段。

染色体荧光原位杂交(fish)始于传统的细胞遗传学和dna技术的结合，快速灵敏、特异性好，可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示dna片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。此外，fish的方法，可以在石蜡包埋的样本上进行回顾性研究，大大降低了对研究样本的要求。目前，利用荧光原位杂交(fish)诊断该肿瘤的方法国内外均无报道。

应用fish方法检测可有两种探针设计思路，一种是设计mitf基因分离探针，另一种是设计prcc-mitf基因融合探针。两种设计各有优缺点，融合探针检测结果更精确具体，但由于mitf基因易位肿瘤以往未被发掘，暂时仅本课题组发现了一种易位伴侣(prcc基因)，不除外mitf易位性肿瘤也和同家族的tfe3一样，具有多样的易位伴侣，因此prcc-mitf融合探针恐怕不能筛选出所有mitf易位肿瘤。mitf分离探针则弥补这一缺陷，只要mitf基因发生断裂，无论其易位伴侣是哪个基因，mitf分离探针均能检测出阳性结果。

技术实现要素：

本发明团队通过高通量测序技术，在一例形态学符合mit家族易位性肾细胞癌特征的病例中检测出prcc-mitf融合基因,该基因为mitf基因发生断裂并易位至染色体其他位置与所在位置的基因形成的融合基因；具体是由prcc外显子5和mitf外显子4融合形成。mitf、prcc基因序列来自genebank，序列版本号grch38.p7,prcctranscript_id＝"xm_005245313.1",mitftranscript_id＝"nm_198159.2"。融合基因序列为：

tggtccccccccaggaaattgccccagatgcctccttcatcgatgacgaagcaggattttataagtttgaagagcaaaacagggcagagagcgagtgcccaggcatgaacacacattcacgagcg(seqidno.1)

本发明针对该mit家族易位性肾细胞癌的新融合基因设计了诊断mitf易位性肾癌的分离探针组合。

一种用于诊断mitf易位性肾癌的分离探针组合，该组合为bac克隆探针rp11-26p2和bac克隆探针rp11-963h1。

所述的探针组合，其中，bac克隆探针rp11-26p2定位于mitf着丝粒一侧，标记为任意一种颜色的荧光；bac克隆探针rp11-963h1定位于mitf端粒一侧，标记为与着丝粒一侧标记的颜色不同的荧光。

所述的分离探针组合，其中rp11-26p2优选标记为绿色荧光，rp11-963h1优选标记为红色荧光；标记的荧光颜色可以互换。

本发明所述的探针在制备mitf易位性肾癌诊断试剂中的应用。

一种mitf易位性肾癌诊断试剂盒，包含本发明所述的探针组合。

以下是本发明技术方案详细的说明：

本发明中，mitf着丝粒一侧bac克隆片段为rp11-26p2(片段长度163kb),mitf端粒一侧bac克隆片段为rp11-963h1(片段长度196kb)，这些片段为细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，bac)克隆，其在人类染色体上的定位已经公开，分别为rp11-26p2，定位于3号染色体69542872-69705988和rp11-963h1，定位于3号染色体70151790-70348243。mitf基因的定位为3号染色体69788586-70017488。bac克隆片段与mitf基因的链接顺序为rp11-26p2，mitf，rp11-963h1。

mitf基因与染色体上结合的bac克隆片段之间保持一定距离而不会重叠(本发明中最大为134kb，最小为83kb)，因而mitf基因内部的断裂重排不会影响bac克隆片段与染色体相应位置结合。这样，由于采用的bac克隆片段大小相近(本发明中两个探针相差仅为33kb)，两端bac克隆片段之间最远距离控制在1500kb以内，彼此之间存在适当的间隔，使得在进行荧光观察时，端粒侧bac克隆片段显示一种荧光，如红色，着丝粒侧bac克隆片段显示另一种荧光，如绿色，在非mitf易位性肾癌时，mitf基因不断裂，红绿两种荧光靠得比较近，观察时出现红绿融合信号(表现为红绿相连或黄色信号点)，而在mitf易位性肾癌时，mitf基因断裂，导致红绿两种荧光离得比较远，观察时无需放大即可见到分离较远的红绿两种信号，很容易观察。

选择这2种bac克隆片段有以下两个方面的考虑：①两个片段位于mitf基因两侧，因此只要mitf基因发生断裂，无论易位对象是哪个基因，均能得到阳性检测结果。②这两个bac克隆片段大小相近，带来的好处是：每一端的荧光强度保持一致，防止一端过强而另一端过弱而影响观察；另外可使原位杂交条件保持一致性。③可使mitf基因两端bac克隆片段最远距离控制在1500kb之内，两种荧光颜色之间存在mitf基因，使得在mitf基因未断裂时呈现融合信号(如表现为红绿相连或黄色信号点)，而在mitf基因断裂时两种荧光颜色分离比较远，很容易观察。否则，若mitf基因两端bac克隆片段最远距离过大，如超过1500kb甚至更大，则无论mitf基因是否断裂，均观察到明显分离的两种荧光，就很难判断是否存在mitf易位性肾癌。

本发明的有益效果：

本发明根据mitf易位性肾癌的特点，设计结合在mitf基因两端的荧光标记dna探针组合，在石蜡包埋组织切片的基础上进行原位杂交，检测融合及分离信号，可大大提高诊断该类肿瘤的准确率，为分子靶向治疗提供依据。根据我们的实验结果，该探针组合诊断的特异性和敏感性均达到了100％，且操作对象只需要在石蜡包埋组织切片上进行，时间仅为两个工作日。采用本发明提供的探针组合进行检测mitf易位性肾癌，不但方便、快速、可靠而且成功率高，可用于制备mitf易位性肾癌诊断试剂盒，为mitf易位性肾癌的快速准确的诊断提供了新的工具。

附图说明

图1：bac克隆探针定位模式图。

图2：mitf易位性肾癌融合基因的测序图

rt－pcr结果示1例mitf易位性肿瘤组织检测出prcc-mitf融合基因(prcc外显子5与mitf外显子4相连)；

图3：mitf易位性肾癌肿瘤组织细胞核内箭头所指可见1个红绿融合信号(红绿重叠部分表现为黄色，放大后观察实为靠得很近的红绿信号)和1对红绿分离信号(无需放大即可清楚地观察到红绿信号分离较远)，代表一条染色体上mitf基因完整而另一条染色体mitf基因断裂。

图4：正常肾组织每个细胞核内可见2个红绿融合信号(红绿重叠部分表现为黄色，放大后观察实为靠得很近的红绿信号)，代表2条染色体上的mitf基因均完整。

图5：乳头状肾细胞癌中每个细胞核内可见2个红绿融合信号(红绿重叠部分表现为黄色，放大后观察实为靠得很近的红绿信号)，未见红绿分离信号。

图6：透明细胞性肾细胞癌中每个细胞核内可见2个红绿融合信号(红绿重叠部分表现为黄色，放大后观察实为靠得很近的红绿信号)，未见红绿分离信号。

图7：tfe3易位性肾癌中每个细胞核内可见2个红绿融合信号(红绿重叠部分表现为黄色，放大后观察实为靠得很近的红绿信号)，未见红绿分离信号。

图8：tfeb易位性肾癌中每个细胞核内可见2个红绿融合信号(红绿重叠部分表现为黄色，放大后观察实为靠得很近的红绿信号)，未见红绿分离信号。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例中所述的探针即bac克隆片段，也可以叫bac克隆探针。

实施例1：dna探针组合的制备：

选择能够在3号染色体mitf基因两端分别连接的2个bac克隆片段，控制两端探针之间最远距离在1500kb以内，bac克隆片段之间保持一定距离不重叠，片段大小相近。克隆片段出处为empiregenomics公司的人类bac克隆中心(http://www.empiregenomics.com/helixhq/clonecentral/search/human)。mitf着丝粒一侧bac克隆片段为rp11-26p2(片段长度163kb),mitf端粒一侧bac克隆片段为rp11-963h1(片段长度196kb)。bac克隆片段与mitf基因的链接顺序为rp11-26p2，mitf，rp11-963h1。探针组合的定位结构如图1所示。利用缺口平移方法将端粒侧的bac克隆片段标记成任意一种颜色的荧光，优选红色荧光，将着丝粒侧的bac克隆片段标记成与着丝粒一侧标记的颜色不同的荧光，优选绿色荧光；两端标记的荧光颜色可以互换。这些方法为本领域技术人员所熟知(由美国empiregenomics公司提供上述这些服务)。mitf着丝粒一侧bac克隆片段在荧光显微镜下为一个绿色荧光信号，代表mitf基因着丝粒侧。mitf端粒一侧bac克隆片段在荧光显微镜下为一个红色荧光信号，代表mitf基因端粒侧。两端标记的荧光颜色可以互换。正常情况下红绿信号相连或重叠为融合信号，在mitf易位性肾癌时，由于3号染色体mitf基因断裂易位使得红绿信号分离。

进一步，可将制备的探针组合采用荧光原位杂交方法，在mitf易位性肾癌、非mitf易位性肾癌和癌旁组织中验证其定位和/或诊断效果是否可靠。

实施例2：荧光原位杂交过程：

通过高通量测序及rt-pcr检测融合基因结果确诊mitf易位性肾癌1例(图2，与本实验结果相互对应更能体现出本实验的可靠性)，以及由两位经验丰富的病理医生参照who2016泌尿及男性生殖系统分类标准，收集南京军区南京总医院诊断肾细胞癌30例作为对照组。

蜡块3μm厚切片，在脱蜡后，依次置于100％、85％、70％乙醇中各2min，随后浸入去离子水中，100℃水浴15min。将组织切片放入胃蛋白酶k溶液(0.1g胃蛋白酶，40ml0.01mhcl)37℃，15min；2×ssc(氯化钠、柠檬酸钠)漂洗2次，各5min，切片置于0.1mol/lhcl中室温浸泡10min，用2×ssc漂洗2次，各5min；经70％、85％、100％乙醇各脱水2min，于空气中干燥；在组织区域加10μl探针混合液(其中每个探针各1μl，2个探针共2μl，另加8μl的杂交缓冲液，杂交缓冲液在购买探针时由empiregenomics公司提供，内含人类cot1dna)，加盖玻片，用橡皮胶封边；放入原位杂交仪(geneampinsitupcrsystem1000)中88℃变性6min后37℃过夜(16h)；移去盖玻片，将玻片置于0.4×ssc(氯化钠、柠檬酸钠、0.3％np-40)溶液中，69℃漂洗1min；2×ssc(氯化钠、柠檬酸钠、0.1％np-40)溶液中漂洗1min，70％乙醇3min，室温暗处干燥；靶区域滴加10μl4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindoledapi)，用盖玻片封片后，再用荧光显微镜观察结果。

结果判定：

正常细胞可见2个红绿融合信号，表现为红绿相连或黄色信号点。

mitf易位性肾癌病例的mitf易位性肿瘤细胞，可见一个正常的融合信号和一对异常的红绿分离信号。

为排除假阳性和假阴性，每个样本计数100个细胞，只有当4个荧光信号均存在时，才纳入计数对象(无论正常和肿瘤我们都会看到4个单信号(两绿和两红)，只不过在正常组织红绿信号是成对融合的，看上去是两个融合信号，但实际是由四个单信号组成。在肿瘤中见到一个融合信号和一对红绿分离的单信号，表面上看是3个信号，但实际还是由4个单信号组成的)。红绿荧光信号之间的距离大于一个信号宽度时计为分离信号。当异常信号大于10％时记为阳性。以上结果判断方法依据市面上多数类似的商业化探针所行使的评判标准，如vysis公司和dako公司的探针使用方法。

结果：

我们对31例肾癌进行检测，其中mitf易位性肾癌1例、tfe3易位性肾癌6例、tfeb易位性肾癌4例、透明细胞性肾细胞癌10例、乳头状肾细胞癌10例。结果1例mitf易位性肾癌检测出异常分离信号(图3)，其阳性细胞数范围在85％，其余对照组肿瘤组织及癌旁正常肾组织均未检测出异常信号(图4－8给出了正常肾组织、乳头状肾细胞癌、透明细胞性肾细胞癌、tfe3易位性肾癌、tfeb易位性肾癌的阴性图片)。说明使用该探针检测mitf易位性肾癌的特异性和敏感性同为100％

敏感性＝真阳性/所有mitf易位性肾癌肿瘤病人数×100％；

特异性＝真阴性/所有非mitf易位性肾癌肿瘤病人数×100％；

评价：

本组探针使用的克隆片段相对较少，且克隆片段大小相对一致，在设计上即考虑到了经济性又考虑到了原位杂交条件的一致性。此外，在本实验中mitf双色破裂分离荧光原位杂交探针的特异性和敏感性均达到了100％。利用fish技术，使用mitf双色破裂分离荧光原位杂交探针来诊断mitf易位性肾癌。快速、可靠且成功率高，是诊断mitf易位性肾癌的一项新技术，值得推广。

序列表

<110>中国人民解放军南京军区南京总医院

<120>一种用于诊断mitf易位性肾癌的分离探针组合及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>125

<212>dna

<213>人类(human)

<400>1

tggtccccccccaggaaattgccccagatgcctccttcatcgatgacgaagcaggatttt60

ataagtttgaagagcaaaacagggcagagagcgagtgcccaggcatgaacacacattcac120

gagcg125