一种快速鉴定多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗药性的方法及专用引物对与流程

文档序号：12300252阅读：579来源：国知局

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶b亚基基因sdhb的克隆及其在氟吡菌酰胺抗性检测及监测中的应用，具体公开一种快速鉴定多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗药性的方法及专用引物对。

背景技术：

近年来，多主棒孢菌(corynesporacassiicola(berk.&m.a.curtis)c.t.wei)引起的黄瓜棒孢叶斑病在我国黄瓜生产上已由次要病害上升为一种主要病害。田间发病一般减产20％，严重时可达60％～70％。该病害于1906年在欧洲首次报道，1957年美国的北卡罗来纳州报道了该病害的发生，20世纪60年代，戚佩坤等首次在我国报道了该病害的发生。20世纪90年代，房德纯等报道了该病害已成为辽宁省瓦房店市保护地黄瓜主要病害。近年来，在我国辽宁，河北，山东，河南，甘肃等19个省市该病已发展成为主要病害，给黄瓜生产造成严重损失，成为保护地黄瓜生产中亟待解决的叶部病害之一。

多主棒孢菌，隶属于子囊菌门座囊菌纲格孢菌目棒孢科棒孢属，是一种遗传变异性较大的真菌。该均能够侵染植株的叶片、茎秆和根以及线虫的孢囊和人的皮肤，其寄主植物包括380个属的530种植物，包括单子叶、双子叶等。由于该病原菌是一种高度变异的群体，因此在使用抗性品种进行病害控制时存在持效期短的问题。化学防治成为目前是防治该病害最为重要的手段。目前国内外已报道的对黄瓜棒孢叶斑病有效的化学药剂主要包括啶酰菌胺、甲霜灵、氟吡菌酰胺、甲基硫菌灵、嘧菌酯、咪鲜胺、福美双、异菌脲、多菌灵、百菌清、吡唑醚菌酯、代森锰锌、噁唑菌酮及它们的混配制剂及系统性抗病诱导剂苯并噻二唑。其中最具有代表性的是以氟吡菌酰胺和啶酰菌胺为代表的琥珀酸脱氢酶抑制剂(succinatedehydrogenaseinhibitors，sdhis)。sdhis是杀菌剂抗性行动协会(frac)按照其相似的作用机制和抗性机理新划分出的结构上属酰胺类的杀菌剂。其作用靶标为病原真菌线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶(succinatedehydrogenase，sdh)，即复合物ⅱ或琥珀酸：泛醌氧化还原酶(succinate：ubiquinoneoxidoreductase，sqr)。包括氟吡菌酰胺，啶酰菌胺，吡噻菌胺，萎锈灵等共18种杀菌剂。该类杀菌剂由于活性高，杀菌谱广而在全世界范围内被广泛用于农作物病害的防治。

目前，已有14种植物病原真菌报道了对该类杀菌剂的抗性发生，且大部分关于抗性机制报道的文章均将引起病原真菌抗药性的因子锁定在了琥珀酸脱氢酶的b/c/d亚基基因的位点突变上，其中多主棒孢菌对啶酰菌胺的抗药性机制研究表明不同抗性水平的多主棒孢菌，其机制不同。对于超高抗菌株，主要发生sdhb-h278y(cac-tac)突变，对于高抗菌株，主要发生sdhb-h278r(cac-cgc)突变，对于中抗菌株，抗性突变包括sdhc-s73p(tcg-ccg),sdhd-g109v(ggc-gtc)，sdhd-s89p(tcc-ccc)。

用于植物病原菌抗药性检测或监测的传统生物学方法，包括菌落生长测定法、孢子萌发测定法等，均是通过测定药剂对植物病原菌的ec50以区分敏感和抗性菌株，比较耗时费力。近年来，随着核酸相关分子检测技术的快速发展与进步，分子生物学技术在病原菌抗药性检测以及监测中得到了广泛的应用，例如as-pcr(allele-specificpcr)以及pcr-rflp(restrictionfragmentlengthpolymorphism)。相比于传统的检测方法，后者从dna提取到特异性pcr或酶切分析，耗时短、灵敏度高，检测频率在10^-5～10^-4，适于检测低频抗药性基因，是一种田间抗药性早期检测或监测的理想方法。

技术实现要素：

本发明一个目的是提供检测多主棒孢菌基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基的物质的用途。

本发明提供了多主棒孢菌基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基的物质在检测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗性中的应用；

所述a1020g位点为所述琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因中第1020位；

所述a1020g位点的碱基为a或g。

本发明另一个目的是提供检测多主棒孢菌基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基第280位氨基酸残基的物质的用途。

本发明提供了检测多主棒孢菌基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基第280位氨基酸残基的物质在检测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗性中的应用；

所述第280位氨基酸残基为所述琥珀酸脱氢酶b亚基氨基酸序列第280位；

所述第280位氨基酸残基为ile或val。

本发明第3个目的是提供一种检测或辅助检测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗性的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测多主棒孢菌中基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基，所述a1020g位点的碱基为a或g；若该位点的碱基为a，则该多主棒孢菌为或候选为对氟吡菌酰胺敏感；若该位点的碱基为g，则该多主棒孢菌为或候选为对氟吡菌酰胺具有抗性。

本发明第4个目的是提供一种检测或辅助检测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗性的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测多主棒孢菌中基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因编码的蛋白第280位的氨基酸残基，所述第280位氨基酸残基为ile或val；若该位点的氨基酸残基为ile，则该多主棒孢菌为或候选为对氟吡菌酰胺敏感；若该位点的氨基酸残基为val，则该多主棒孢菌为或候选为对氟吡菌酰胺具有抗性。

本发明第5个目的是提供一种检测或辅助检测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗性的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测多主棒孢菌中基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基，所述a1020g位点的碱基为a或g；该位点的碱基为g的待测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺的抗性高于该位点的碱基为a的待测多主棒孢菌。

本发明第5个目的是提供一种检测或辅助检测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗性的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测多主棒孢菌中基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因编码的蛋白的第280位的氨基酸残基，所述第280位氨基酸残基为ile或val；该位点的氨基酸残基为val的待测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺的抗性高于该位点的氨基酸残基为异亮氨酸的待测多主棒孢菌。

上述方法中，

所述检测待测多主棒孢菌中基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因编码的蛋白第280位的氨基酸残基通过检测待测多主棒孢菌中基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基实现；

所述检测待测多主棒孢菌中基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基通过如下1)或2)方法实现：

1)测序；

2)用所述检测多主棒孢菌基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基的物质扩增所述待测多主棒孢菌，检测扩增产物，若所述扩增产物得到特异片段，则所述检测待测多主棒孢菌中基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基为g，若扩增产物未得到特异片段，则所述检测待测多主棒孢菌中基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基为a；

所述检测多主棒孢菌基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基的物质包括如下a或b：

a)扩增所述a1020g位点的引物对；

b)含有所述引物对的pcr试剂或试剂盒。

上述方法中，

所述扩增所述a1020g位点的引物对由序列5所示的核苷酸和序列6所示的核苷酸组成；

或所述特异片段大小为250-270bp；

或所述扩增的退火温度为61.4-68.4℃。

上述应用或上述方法中的所述检测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗性的物质也是本发明保护的范围。

本发明第6个目的是提供一种检测待测多主棒孢菌中基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用所述检测多主棒孢菌基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基的物质扩增所述待测多主棒孢菌，检测扩增产物，若所述扩增产物得到特异片段，则所述检测待测多主棒孢菌中基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基为g，若扩增产物未得到特异片段，则所述检测待测多主棒孢菌中基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基为a；

所述检测多主棒孢菌基因组中的琥珀酸脱氢酶b亚基编码基因a1020g位点碱基的物质包括如下a或b：

a)扩增所述a1020g位点的引物对；

b)含有所述引物对的pcr试剂或试剂盒。

上述方法的中，所述扩增所述a1020g位点的引物对由序列5所示的核苷酸和序列6所示的核苷酸组成；

或所述特异片段大小为250-270bp，在实施例中具体为260bp，核苷酸序列为序列1中自5’末端起第785至1044位。

或所述扩增的退火温度为61.4-68.4℃。

本发明的实验证明，本发明提供检测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺产生抗药性的点突变的方法，可以用于快速、灵敏地检测田间多主棒孢菌对氟吡菌酰胺的抗性发生发展动态，以便及时调整黄瓜棒孢叶斑病的防治策略，以延缓和控制抗药性的进一步发展。

附图说明

图1为对氟吡菌酰胺表现抗性和敏感的多主棒孢菌菌株琥珀酸脱氢酶b亚基基因sdhb全序列比对结果。

图2为对氟吡菌酰胺表现抗性和敏感的多主棒孢菌菌株琥珀酸脱氢酶b亚基sdhb全序列比对结果。

图3为采用不同as-pcr引物对进行温度梯度pcr扩增电泳图。

图4为引物对特异性检测结果。

图5为引物对灵敏度检测结果。

图6为引物对在检测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗性中的应用。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

文中“抗性菌株”均指对氟吡菌酰胺抗性或对氟吡菌酰胺ec50大于等于25μg/ml的多主棒孢菌菌株；“敏感菌株”均指对氟吡菌酰胺敏感或对氟吡菌酰胺ec50小于2μg/ml的多主棒孢菌菌株。

下述实施例中使用的多主棒孢菌菌株：hg15050729-5(cgmccno.14544)、hg15050825-6、hg15050731和hg15050737为抗性菌株；hg14102405-2,hg14102524-4(cgmccno.14543)，hg15050755-3、hg15041321-2和hg15041414-2为敏感菌株。

上述菌株hg15050755-3、hg15050729-5及hg15050825-6均由本课题组成员于2015年采自于中国辽宁地区；hg15041321-2和hg15041414-2采自于中国山东地区。hg14102405-2和hg14102524-4采自于中国河北地区。以上各菌株均经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定为多主棒孢菌菌株。上述各菌株均经过菌落生长速率法进行敏感性测定和抗药性验证。

实施例1、多主棒孢菌中琥珀酸脱氢酶b亚基基因sdhb及其对应蛋白突变位点的发现

一、多主棒孢菌对氟吡菌酰胺的敏感性测定

5株敏感菌株hg15050755-3、hg15041321-2、hg15041414-2、hg14102405-2和hg14102524-4；4株抗性菌株hg15050729-5、hg15050731、hg15050737和hg15050825-6。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水定容至1l，121℃湿热灭菌30min。

1)将氟吡菌酰胺用丙酮配成5×10⁴μg/ml的母液。对于5株多主棒孢菌敏感菌株及4株多主棒孢菌抗性菌株的敏感性测定，将氟吡菌酰胺稀释成10μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10000μg/ml和25000μg/ml的浓度梯度。

2)按由低到高的顺序，用移液枪吸取各个浓度梯度的药液135μl加入已灭菌的冷却至55℃的135mlpda培养基中，使溶剂含量为1‰，混匀，将含药的培养基倒入直径为5.5cm的培养皿中，以只加135μl丙酮的处理为空白对照。每个浓度重复3次。

3)自保存于4℃的斜面上活化供试菌株，26℃下黑暗培养5天后，用打孔器沿菌落边缘打取直径为0.5cm的菌饼，菌丝面向下接种于步骤2)中的含药和对照平板中，置于26℃培养箱中黑暗培养，5d后测量菌落直径。

4)十字交叉法测量菌落直径，根据菌落平均直径值计算出各个浓度下对供试多主棒孢菌菌株的菌丝生长抑制率。然后运用sas9.4probit分析计算各菌株的ec50值及其置信区间。

结果如表1所示，敏感性测定结果表明，氟吡菌酰胺对敏感菌株hg15050755-3、hg15041321-2、hg15041414-2、hg14102405-2和hg14102524-4的ec50均小于2μg/ml，而对抗性菌株hg15050729-5、hg15050731、hg15050737和hg15050825-6的ec50均大于25μg/ml，抗性倍数均在12.5倍以上。

表15株多主棒孢菌敏感菌株和4株多主棒孢菌抗性菌株对氟吡菌酰胺的敏感性

二、多主棒孢菌中琥珀酸脱氢酶b亚基基因sdhb及其对应蛋白突变位点的发现

1、菌株：抗性菌株hg15050729-5、hg15050731、hg15050737和hg15050825-6，敏感菌株hg15050755-3、hg15041321-2、hg15041414-2、hg14102405-2和hg14102524-4。

2、方法：

1)模板：分别以抗性菌株和敏感菌株的基因组dna为模板。

2)琥珀酸脱氢酶b亚基基因sdhb全序列的pcr扩增

引物(表2)：ccsdhb-f(5’-cgcaacgacactcttctt-3’)

ccsdhb-r(5’-ccattcagcaacgactct-3’)

采用北京博迈德科技发展有限公司试剂，50μl反应体系中包括2μl模板dna(30-50ng)，每条引物(10μm)2μl，25μl2×taqmix(购自北京博迈德科技发展有限公司)，19μlddh2o，反应体系根据后续试验需要进行成倍增减。反应程序为：预变性94℃5min；94℃45s，58℃45s，72℃2min，35个循环；最后72℃下延伸5min。扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测。

3)测序

将pcr产物进行测序，测序引物见表2。以基因组dna为模板时，抗性菌株的琥珀酸脱氢酶b亚基基因sdhb全序列共1106bp，序列如序列1所示，存在3段内含子序列，共编码307个氨基酸，序列如序列2所示。

分别将抗性菌株hg15050729-5hg15050731、hg15050737和hg15050825-6，与敏感菌株hg15050755-3、hg15041321-2、hg15041414-2和hg14102405-2的琥珀酸脱氢酶b亚基基因sdhb全序列进行测序。通过danman软件分析序列结果，发现存在如下突变位点：与敏感菌株相比，抗性菌株hg15050729-5、hg15050731、hg15050737和hg15050825-6的琥珀酸脱氢酶b亚基基因sdhb自5’末端起在基因序列的第1020位核苷酸由a突变为g(图1)，该位点为a1020g的突变位点，该位点碱基突变导致氨基酸序列在第280位发生突变，由异亮氨酸(ile，i)突变为缬氨酸(val，v)(图2)。

上述抗性菌株hg15050729-5、hg15050731、hg15050737和hg15050825-6中的琥珀酸脱氢酶b亚基基因sdhb核苷酸序列为序列1，其编码的蛋白琥珀酸脱氢酶b亚基的氨基酸序列为序列2，抗性菌株中的琥珀酸脱氢酶b亚基记作多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶b亚基突变体，命名为sdhb-v280。

上述敏感菌株hg15050755-3、hg15041321-2、hg15041414-2、hg14102405-2和hg14102524-4中的琥珀酸脱氢酶b亚基基因sdhb核苷酸序列为序列3，其编码的蛋白琥珀酸脱氢酶b亚基的氨基酸序列为序列4，敏感菌株中的琥珀酸脱氢酶b亚基记作多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶b亚基，命名为sdhb-i280。

序列1为将序列3第1020位a突变为g，其他核苷酸不变得到的序列；

序列2为将序列4第280位i突变为v，其他氨基酸不变得到的序列。

因此，可以通过检测多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶b亚基基因核苷酸序列第1020位的碱基是a还是g，来检测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺为抗性还是敏感。

实施例2、检测多主棒孢菌中突变位点a1020g的方法

一、引物设计、筛选及扩增方法

菌株为实施例1中所用菌株hg15050729-5、hg15050825-6、hg14102524-4、hg14102405-2、hg15041321-2、hg15041414-2、hg15050755-3。

根据突变体hg15050729-5琥珀酸脱氢酶b亚基基因sdhb的序列设计as-pcr引物。引物对cc1020f-cc1020a/t/c/g.c.r用于检测a1020g的突变位点。其中，反向引物cc1020a.c.r的3’-端最后一个碱基为突变后的碱基，正向引物为cc1020f(表2)。为了增加引物的特异性，在反向引物3’-端第2和第3个碱基引入错配碱基(表2，引物cc1020t/c/g.c.r)。

表2检测对氟吡菌酰胺表现抗性的多主棒孢菌菌株所使用的pcr引物

以待测多主棒孢菌的基因组dna为模板，采用cc1020f和cc1020a/t/c/g.c.r进行pcr扩增，25μl扩增体系为：1μl模板dna(30-50ng)，每条引物(10μm，在l扩增体系中的浓度为0.4μm/l)1μl，12.5μl2×taqmix(购自北京博迈德科技发展有限公司)，9.5μlddh2o。对各引物对进行不同退火温度梯度pcr，确定特异性高的退火温度。反应程序为：预变性94℃5min；94℃30s，50-70℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃下延伸5min。扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳检测。

结果如图3所示，s：敏感菌株；r：抗性菌株；由上至下正向引物依次为cc1020a.c.r、cc1020t.c.r、cc1020c.c.r、cc1020g.c.r，正向引物均为cc1020f，引物对cc1020f-cc1020a/c.c.r在51.3-68.4℃的退火温度下能从敏感菌株和抗性菌株的基因组dna中扩增出260bp的片段，不能很好地将之区分开。当退火温度为61.4-68.4℃时，引物对cc1020f-cc1020t/g.c.r能够从抗性菌株hg15050729-5的基因组dna中扩增出260bp的片段。其中cc1020f-cc1020g.c.r引物对在该温度下亦能从敏感菌株中扩增出微弱的条带，而cc1020f-cc1020t.c.r不能从敏感菌株中扩增出相应的片段。

因此选择cc1020f-cc1020t.c.r引物对作为as-pcr引物用来检测a1020g的突变位点，退火温度为61.4-68.4℃。

将引物对cc1020f-cc1020t.c.r对抗性菌株hg15050729-5的扩增产物260bp的片段进行测序，结果260bp的片段的核苷酸序列为序列1中自5’末端起第785至1044位。

因此，检测多主棒孢菌中突变位点a1020g的试剂盒包括cc1020f和cc1020t.c.r组成的引物对；

或检测多主棒孢菌中突变位点a1020g的试剂盒包括含有cc1020f和cc1020t.c.r组成的引物对的pcr试剂，该pcr试剂包括：cc1020f、cc1020t.c.r、2×taqmix和水，其中cc1020f、cc1020t.c.r在试剂中的浓度分别为0.4μm/l和0.4μm/l。

二、引物对的特异性检测

以供试多主棒孢菌和其他真菌及细菌的基因组dna为模板，采用cc1020f和cc1020t.c.r进行pcr扩增。

25μl扩增体系为：1μl模板dna(30-50ng)，每条引物(0.4μm/l)1μl，12.5μl2×taqmix(购自北京博迈德科技发展有限公司)，9.5μlddh2o。

反应程序为：94℃5min；94℃30s，68℃30s，72℃30s，30个循环；72℃下延伸5min。扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳检测。

结果如图4所示，m：marker(bm5000，北京博迈德科技发展有限公司)；1,多主棒孢菌(corynesporacassiicola)hg15050729-5(抗性)；2,多主棒孢菌(c.cassiicola)hg15050825-6(抗性)；3,多主棒孢菌(c.cassiicola)hg14102524-4(敏感)；4,辣椒疫霉菌(phytophthoracapsici)lj12010805；5,茄病镰刀(fusariumsolani)hg13060501；6,煤污假尾孢(pseudocercosporafuligena)fq10013003；7,茄匍柄霉菌(stemphyliumsolani)fq14111912；8,多主棒孢菌(c.cassicola)hg15030802(敏感)；9,尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)hg15060516；10,立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)dbc16070604；11,灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)fq13010701；12,茄链格孢菌(alternariasolani)jgfq15080702；13,丁香假单胞菌黄瓜致病变种(pseudomonassyringaepv.lachrymans)hg1501050702；14,胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(pectobacteriumcarotovorumsubsp.brasiliensis)hg0903060203；15,阴性对照“-”；引物对cc1020f-cc1020t.c.r仅能从携带sdhb-v280突变的多主棒孢菌株中扩增出大小为260bp的片段。

三、引物对的灵敏度检测

对供试的多主棒孢菌hg15050729-5的基因组dna(nanodrop2000测定其初始浓度为：9.9ng/μl)进行10倍梯度稀释(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9)，采用cc1020f和cc1020t.c.r进行pcr扩增。

25μl扩增体系为：1μl模板dna(30-50ng)，每条引物(0.4μm/l)1μl，12.5μl2×taqmix(购自北京博迈德科技发展有限公司)，9.5μlddh2o。

反应程序为：预变性94℃5min；94℃30s，68.4℃30s，72℃30s，30个循环；72℃下延伸5min。扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳检测。

结果如图5所示，m：marker(bm5000，北京博迈德科技发展有限公司)；1,9.9ng/μl；2,9.9×10^-1ng/μl；3,9.9×10^-2ng/μl；4,9.9×10^-3ng/μl；5,9.9×10^-4ng/μl；6,9.9×10^-⁵ng/μl；7,9.9×10^-6ng/μl；8,9.9×10^-7ng/μl；9,9.9×10^-8ng/μl；10,9.9×10^-9ng/μl；11,阴性对照“-”，可以看出，该体系的检测灵敏度为9.9×10^-2ng/μl。

四、检测多主棒孢菌中突变位点a1020g的引物对在检测多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗性中的应用

以待测多主棒孢菌hg15050755-3、hg15041321-2、hg15041414-2、hg14102405-2、hg14102524-4、hg15050729-5、hg15050731、hg15050737和hg15050825-6的基因组dna为模板，采用引物对cc1020f-cc1020t.c.r进行pcr扩增。

pcr反应体系如下：

25μl反应体系中包括1μl模板dna(30-50ng)，cc1020f(0.4μm/l)和cc1020t.c.r(0.4μm/l)各1μl，12.5μl2×taqmix(购自北京博迈德科技发展有限公司)，9.5μlddh2o。

反应程序为：预变性94℃5min；94℃30s，68.4℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃下延伸5min。扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳检测。

若得到260bp的片段，则该多主棒孢菌基因组中琥珀酸脱氢酶b亚基基因sdhb核苷酸序列第1020位核苷酸为g，则该多主棒孢菌为或候选为氟吡菌酰胺抗性菌株；

若未得到260bp的片段，则该多主棒孢菌基因组中琥珀酸脱氢酶b亚基基因sdhb核苷酸序列第1020位核苷酸不为g，则该多主棒孢菌不为或候选不为氟吡菌酰胺抗性菌株。

结果如图6所示，m：marker(bm5000，北京博迈德科技发展有限公司)；1,hg15050729-5；2,hg15050731；3,hg15050737；4,hg15050825-6；5,hg14102524-4；6,hg14102405-2；7,hg15041321-2；8,hg15041414-2；9,hg15050755-3；10,阴性对照“-”；引物对cc1020f-cc1020t.c.r从多主棒孢菌菌株hg15050729-5、hg15050731、hg15050737和hg15050825-6扩增出约260bp特异性片段，其为对氟吡菌酰胺表现抗性，这与前面的对氟吡菌酰胺敏感性检测一致；

引物对cc1020f-cc1020t.c.r从多主棒孢菌菌株hg15050755-3、hg15041321-2、hg15041414-2、hg14102405-2和hg14102524-4中未扩增出约260bp特异性片段，其为对氟吡菌酰胺表现敏感，这与前面的对氟吡菌酰胺敏感性检测一致。

表明该对引物可以用于特异性检测多主棒孢菌是否对氟吡菌酰胺产生了抗性。

序列表

<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>一种快速鉴定多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗药性的方法及专用引物对

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1106

<212>dna

<213>多主棒孢菌(corynesporacassiicola)

<400>1

atggcttgcacacgcgctttcgctcgtctggctacgacgcggaccggtacgtgaacccct60

ctacgtgcactacacacccattggagctctactgacagctctccccgcagccgtacggcc120

cgctgccgtcttcacgcgcggttttgcctccgtgaccgacacggccgcccgcgagcccgt180

ctccaaggtggccgagaagatcgtgcccgacccggcccgcaaggtggttcccgagagtca240

gaccagcactgtcaaggacccccagccggacaaggacgcgaagaccaagaccttccacat300

ctaccgctggaacccggacgagcccacgtcgaagccaaagatgcagacgtacacgctgga360

cctgaacaagaccggccccatgatgttggatgcgctgatccgcatcaagaacgagctcga420

cccgaccttgacctttaggcgaagttgccgtgagggaatttgtggaagctgcgcaatgaa480

cattgacggcgtgaacacgctggcctgtctttgtacgtggaaccgcagtctccacgaatg540

cggaattgggtggctaacgagtgcgcaacaggccgcatccccaccgataccaccaaggaa600

tcgcgcatttaccctctccctcacatgtacattgtcaaggacttggtccccgacatgacg660

ctcttctacaagcagtaccgctccgtgaagccctacctccagcgcgacactcctgctcct720

gacgtaagaacaccgcacacctcaccatagcctcgaactcgccactaacgattgctctct780

agggccgtgaataccgccagtccaaggaggagcgcaagaagctcgacggcctgtacgagt840

gcattctgtgcgcctgctgctcaacgtcctgcccgtcgtactggtggaaccaggaggagt900

acctcggccctgccgtgctgctccagtcgtaccgctggatcgccgattcgcgtgacgaga960

agacggcacaacgccaggatgccctcaacaactcgatgagcatgtaccgctgccacacgg1020

ttctcaactgctcgaggacgtgccccaagggcttgaacccggctctggccattgccgaaa1080

tcaagaagagcatggctttcacgtag1106

<210>2

<211>307

<212>prt

<213>多主棒孢菌(corynesporacassiicola)

<400>2

metalacysthrargalaphealaargleualathrthrargthrala

151015

valargproalaalavalphethrargglyphealaservalthrasp

202530

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354045

aspproalaarglysvalvalprogluserglnthrserthrvallys

505560

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

glugluarglyslysleuaspglyleutyrglucysileleucysala

210215220

cyscysserthrsercysprosertyrtrptrpasnglngluglutyr

225230235240

leuglyproalavalleuleuglnsertyrargtrpilealaaspser

245250255

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260265270

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275280285

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290295300

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305

<210>3

<211>1106

<212>dna

<213>多主棒孢菌(corynesporacassiicola)

<400>3