同步检测Malsoor与HeartLand病毒双重荧光定量RT‑PCR方法与流程

本发明涉及病毒检测领域，具体是涉及一种用于同步检测malsoor病毒与heartland病毒双重荧光定量rt-pcr试剂盒和方法。
背景技术：
：malsoor病毒与heartland病毒属于布尼亚病毒科白蛉病毒属成员，这两种病毒的全基因系统进化分析与中国新发现的发热伴血小板减少综合征病毒(severefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus，sftsv)紧密相关，具有潜在的流行风险。malsoor病毒于2010年在印度的棕果蝙蝠体内被发现。heartland病毒于2012年在美国密苏里州医院住院的两名病人血液中被发现，其临床症状与当前在中国流行的发热伴血小板减少综合征十分相似，人与家畜可被携带有heartland病毒的蜱虫叮咬而感染，出现发热、疲乏、腹泻、血小板显著减少、白细胞减少，严重者出现多脏衰竭而死亡，成为当前国际上较为关注的公共卫生问题。目前，malsoor病毒与heartland病毒检测的金标准是病毒分离方法，但因该方法操作繁琐、技术难度大、实验要求高、耗时长等限制，在传染病早期诊断中难以推广应用。近年来多重荧光定量pcr在病毒检测方面发挥了重要作用。但鉴于该类病人血液中的病毒维持时间短，载量低等原因，建立一种操作简单、特异灵敏、快速定量的检测技术有利于早期发现、早期诊治与早期防控。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一组用于同步检测malsoor病毒与heartland病毒的引物对和核酸序列；本发明还提供一种用于同步检测malsoor病毒与heartland病毒的双重荧光定量rt-pcr试剂盒及检测方法。本发明利用taqman探针双重荧光rt-pcr技术，建立一种操作简便、特异敏感、快速定量的检测方法，应用于malsoor病毒与heartland病毒的监测检测。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用于检测malsoor病毒和heartland病毒的双重荧光定量rt-pcr引物对，所述的引物对的核苷酸序列如序列表中序列1和2序列3和4所示。一组用于定量检测malsoor病毒和heartland病毒的双重荧光定量rt-pcr核酸，该组核酸包括引物对、荧光探针和作为阳性对照的扩增产物，所述的引物对的核苷酸序列如序列表中序列1和2，序列3和4所示，所述荧光探针的核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示，所述作为阳性对照的扩增产物包含有如序列表中序列7和序列8所示的核苷酸序列。一种定量检测malsoor病毒和heartland病毒的双重荧光定量rt-pcr试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：2×rt-pcr反应液、25×rt-pcr逆转录酶与taq酶混合液、上游引物、下游引物、荧光探针、阴性对照、阳性对照；所述的上游引物的核苷酸序列如序列表中序列1和2所示；所述的下游引物的核苷酸序列如序列表中序列3和4所示；所述的荧光探针的核苷酸序列如序列表中序列5和6所示，荧光探针的5′端链接荧光基团，荧光探针的3′端链接淬灭基团；所述的阴性对照为无核酸酶灭菌超纯水；所述的阳性对照及定量参照物为包含有核苷酸序列如序列表中序列4所示的基团。作为优选，所述的荧光基团为fam、hex和vic中的任意一种，所述的淬灭基团为tamara和bhqi中的任意一种。一种用于同步检测malsoor与heartland病毒双重荧光定量rt-pcr方法，包括以下步骤：从样本中提取病毒rna；对提取的rna进行双重荧光rt-pcr扩增，扩增反应体系为：1×rt-pcr反应液；1×rt-pcr酶混合液；上游引物：核苷酸序列表中序列1和2所示；下游引物：核苷酸序列表中序列3和4所示；荧光探针：核苷酸序列表中序列5和6所示，所述荧光探针5′端链接荧光基团，3′端链接淬灭基团；同时以无核酸酶灭菌超纯水为阴性对照；包含有核苷酸序列如序列表中序列7和8所示的基团为阳性对照；阳性对照；收集荧光信号，选择荧光基团的荧光检测模式：基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；结果判定：携带有预期扩增产物的质粒dna，所述预期扩增产物核苷酸序列如序列表中序列7和8所示。作为优选，步骤d中，所述上下游引物终浓度为0.2μμ，荧光探针终浓度为0.1μμ。作为优选，所述双重荧光rt-pcr反应程序为：rt：42℃5min→95℃15s，1个循环；pcr：95℃15s→60℃35s，40个循环。作为优选，所述的荧光基团为fam、hex和vic中的任意一种，所述的淬灭基团为tamara和bhqi中的任意一种。因此，本发明具有如下有益效果：建立了特异灵敏、操作简单的malsoor病毒和heartland病毒的快速检测方法，提供了双重荧光定量rt-pcr检测试剂盒。本发明提供的试剂盒使用方便、操作简单，实时快速、自动化程度高，有效替代了传统的病毒分离来获得检测结果，可在一个反应体系中同步检测2种病毒，达到试剂用量明显减少检测速度显著提高的效果，且试剂配制简单减少了在操作过程中的污染，检测结果准确度高、稳定性好。本发明的检测试剂盒最低检出限为5×101拷贝/μl与5×101拷贝/μl。附图说明图1是发明双重荧光定量rt-pcr试剂盒检测malsoor病毒与heartland病毒的双扩增曲线。图2是本发明双重荧光定量rt-pcr试剂盒检测malsoor病毒的特异性扩增曲线。图3是本发明双重荧光定量rt-pcr试剂盒检测heartland病毒的特异性扩增曲线。图4是本发明双重荧光定量rt-pcr试剂盒检测malsoor病毒扩增的定量标准曲线。图5是本发明双重荧光定量rt-pcr试剂盒检测heartland病毒扩增的定量标准曲线。图6是本发明双重荧光定量rt-pcr试剂盒检测malsoor病毒扩增的灵敏度。图7是本发明双重荧光定量rt-pcr试剂盒检测heartland病毒扩增的灵敏度。具体实施方式下面结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。实施例1malsoor病毒与heartland病毒双重荧光定量rt-pcr检测试剂盒的制备，包括以下成分：2×rt-pcr反应液(2×rt-pcrbuffer)；25×酶混合液(25×rt-pcrenzymemix)；上游引物：核苷酸序列如序列表中序列1所示；下游引物：核苷酸序列如序列表中序列2所示；探针：核苷酸序列如序列表中序列3所示；阴性对照：无核酸酶灭菌超纯水；阳性对照：携带有预期扩增产物的质粒dna，所述预期扩增产物核苷酸序列如序列表中序列4所示。定量标准品制备：malsoor病毒阳性质粒dna起始浓度为5.2×1011拷贝/μl，heartland病毒阳性质粒dna起始浓度为7.2×1011拷贝/μl，用核酸稀释剂调整阳性质粒dna起始浓度均为5.0×1011拷贝/μl，然后连续10倍稀释至5.0×100拷贝/μl，用于灵敏度测试及标准曲线制备。进一步地，所述2×rt-pcr反应液和25×酶混合液可选用takara公司的onesteprt-pcrkit(rr064a)，也可选用abi公司agpath-idtmonesteprt-pcrkit；引物、探针的寡核苷酸合成及阳性质粒构建委托大连宝生物(takara)工程有限公司完成，malsoor病毒检测用探针5′端链接fam荧光基团，3′端链接tamara淬灭基团。heartland病毒检测用探针5′端链接hex荧光基团和3′端链接bhq1淬灭基团。实施例2malsoor病毒与heartland病毒双重荧光定量rt-pcr检测方法，包括以下步骤：(1)病毒rna提取病毒rna提取可选用qiaampviralrna提取试剂盒，按试剂盒说明书进行提取；(2)采用实施例1制备的试剂盒配制反应体系，其组份及体积见表1：表1反应体系组份体积(微升)2×rt-pcr反应液12.525×rt-pcr酶混合液1上游引物(10μμ)0.5下游引物(10μμ)0.5探针(5μμ)0.5无核酸酶水7总体积25混合后分装，每孔22.5微升，加模板rna2.5微升；扩增条件，采用以下扩增条件：(3)收集荧光信号，malsoor病毒选择fam荧光检测模式，heartland病毒选择hex或vic荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好阴性对照的最高点设定阈值线；(4)结果判定：待测样本荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，无典型的扩增曲线，则判断为阴性。综上所述，采用本发明的技术方案，进行双重荧光定量rt-pcr试剂盒检测malsoor病毒与heartland病毒的重复性实验，实验结果分别见表2和表3：表2双重荧光定量rt-pcr试剂盒检测malsoor病毒的的重复性表3双重荧光定量rt-pcr试剂盒检测heartland病毒的的重复性序列表<110>舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心<120>同步检测malsoor与heartland病毒双重荧光定量rt-pcr方法<141>2017-08-29<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gagtatgcgtccatgtagacag22<210>2<211>22<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2aggtaactacccagcagaaatg22<210>3<211>22<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cagcattctccttcagctcata22<210>4<211>22<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cacyagagggaacaagatagtg22<210>5<211>24<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5caatgacccaaaggccatgcacat24<210>6<211>24<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6agccaggtttgtcatcctctcagc24<210>7<211>99<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gagtatgcgtccatgtagacagccacatcttccacctgaatgtcgtgtggaatcaatgac60ccaaaggccatgcacatcatttctgctgggtagttacct99<210>8<211>120<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tgtcaacagcattctccttcagctcatagactctagccaggtttgtcatcctctcagcgc60ctttcttagacatcttgccacatgctttcactatcttgttccctctggtgagagcaaata120当前第1页12