检测菜用大豆炭疽病菌的环介导等温扩增引物及应用的制作方法

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及菜用大豆炭疽病菌的环介导等温扩增（lamp）检测引物及其应用，可用于菜用大豆炭疽病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于菜用大豆炭疽病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术：

菜用大豆又称为毛豆，因味道鲜美、营养丰富而深受广大消费者的喜爱，正逐渐成为具有较高经济价值的蔬菜之一，给城郊农户带来较大的经济效益，也是我国南方部分省市春季主要栽培的出品创汇的农产品之一，产品大量用于保鲜和速冻加工。然而在菜用大豆种植过程中尤其在结荚至收获上市期间，由大豆炭疽菌[colletotrichumtruncatum(schwein.)andrus&w.d.moore]侵染引起的炭疽病在豆荚上严重发生，感病品种一般田块株发病率为50%左右，豆荚发病率为30%左右，重病田块株发病率达90%以上，豆荚发病率达50%以上，极大地影响了豆荚的商品性及其经济价值，是菜用大豆生产上的一种重要病害，并且其发生危害有日益严重的趋势。菜用大豆炭疽病菌具有潜伏侵染的特性，在发病初期症状一般不明显，常给病害的正确诊断造成极大的困难，在生产中常因病害诊断不准确，未能达到实施“对症下药”的正确防治措施而致使病害造成惨重损失的现象时有发生。因此建立菜用大豆炭疽病菌快速检测体系，在发病早期对植株是否携带炭疽病菌进行快速准确的检测，这对于病害的准确预测预报、制定适时有效的防治措施、控制病害的传播和流行（蔓延）以及减少病害造成的经济损失都具有重要的理论和实际意义。

目前检测菜用大豆炭疽病菌的方法很多，主要以传统方法和分子生物学方法为主，即分离培养、致病性测定、症状观察等及先进的分子生物学技术包括dna探针、pcr技术及血清免疫学检测等，传统检测方法所需时间长，一般情况下需要5～7天，有时达到10～15天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的pcr技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，pcr技术虽能提高检测效率，但是需要专用pcr仪等贵重设备和专业操作人员和电泳观测结果，在基层的农业部门难以大规模推广应用；快速的elisa方法检测，作为筛选方法具有快速、灵敏的特点，是受到广泛欢迎的筛选方法，但是所使用的试剂盒价格高，而且需要配备其专门的昂贵仪器。

环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，lamp）是日本荣研化学株式会社在2000年开发的一种继pcr技术发展起来的基于检测遗传物质dna的一种新的扩增技术。该技术针对待测靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，在bstdna聚合酶的作用下，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列；其特点是无需特殊的、昂贵的检测仪器，只需简单的恒温设备或者是加热块，扩增结果可直接观察焦磷酸镁沉淀或者加入显色剂进行判断，可以满足现场检测的需要，近年来已广泛用于各种病原检测。目前尚未见应用lamp技术用于检测菜用大豆炭疽病菌的相关技术报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测菜用大豆炭疽病菌的环介导等温扩增引物及应用，针对现有技术中对菜用大豆炭疽病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有pcr分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了菜用大豆炭疽病菌的分子检测方法，对菜用大豆炭疽病菌进行lamp检测，检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。

实现本发明的目的包括下列步骤（技术方案）：

1.菜用大豆炭疽病菌lamp检测特异性引物的设计：通过测定菜用大豆炭疽病菌（colletotrichumtruncatum）和其它炭疽病菌（colletotrichumspp）的核糖体转录间隔区（its）基因，对炭疽菌属不同种间its基因序列进行比对分析，利用在线lamp引物设计软件primersoftwareexplorerv4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html;eikenchemicalco.,japan)设计一套菜用大豆炭疽病菌特异性lamp引物组，由f3、b3、fip和bip组成，引物序列如下：f3:5’-atgcctgttcgag-cgtca-3’，b3:5’-tgggggttttacggctaga-3’，fip:5’-cgccactacctttaagggcct-tttcaaccctcaagctctgc-3’，bip:5’-gaccctctcggagcctcctt-gtccctccgaatcccaatg-3’。

2.菜用大豆炭疽病菌lamp检测方法的建立，包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组dna。

用于检测病原菌纯培养物时，采用ctab法进行提取基因组dna，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5ml离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µl2%ctab（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2%ctab；100mmol/ltris-hcl,ph8.0；20mmol/ledta，ph8.0；1.4mol/lnacl）和90µlsds（十二烷基苯磺酸钠）【注：ctab，sds需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（dna释放至缓冲液中），12000r·min^-1离心15min；取上清液700µl，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min^-1离心9min；取上清液500µl，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r·min^-1离心5min；取上清液350µl，加入上清液体积1/10的3mol·l^-1naac和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min^-1离心5min；弃去上清液，加入700µl冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60µlte（10mmol/ltris-hcl，0.1mmol/ledta，ph8.0）溶液进行溶解，得到dna溶液，用紫外分光光度计检测dna浓度并稀释至100ng/µl待用。

用于检测植物组织中存在菜用大豆炭疽病菌时，采用naoh快速裂解法提取dna，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µl0.5mol/lnaoh，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5ml离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5µl加入495µl0.1mol/ltris-hcl（ph=8.0）混合均匀，取1.0µl作为pcr模板进行扩增；

用于检测土壤样品中存在菜用大豆炭疽病菌时，采用土壤dna提取试剂盒，提取dna。

（2）lamp反应体系的建立：以步骤（1）提取的dna为模板，在pcr管中配制25μl反应体系，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2%trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；

（3）lamp反应条件：将配制好的pcr管于64℃水浴锅中恒温反应60min；

（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0µl，静置5min，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即样品为菜用大豆炭疽病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品不是菜用大豆炭疽病菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品为菜用大豆炭疽病菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不是菜用大豆炭疽病菌。采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0µllamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条形判断为阳性，即样品为菜用大豆炭疽病菌，没有出现梯形条形判断为阴性，即不是菜用大豆炭疽病菌。

本发明的有益效果：本发明建立了菜用大豆炭疽病菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的lamp检测技术体系，可用于带菌植株组织和土壤中菜用大豆炭疽病菌的检测，或用于菜用大豆炭疽病的发病前期、初期检测，对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强、结果可靠：本发明分析了菜用大豆炭疽病菌和其他病原菌rdna-its在序列上的差异，选取6个特定区域，设计了4条特异性的lamp引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，具有很强的特异性。本发明利用所设计出的lamp引物基础上建立了菜用大豆炭疽病菌lamp检测方法，只有菜用大豆炭疽病菌能检测出来，其它病原菌均未检测出，多次试验结果均一致，说明本发明lamp检测方法特异性强，结果可靠。

2、灵敏度高：本发明对菜用大豆炭疽病菌的检测灵敏度在dna水平上可达到10fg/μl，具有很高的灵敏性。

3、快速：应用本发明检测方法，可在1～1.5h得到检测结果，而以往的pcr或巢式pcr检测需4～6h才可得到检测结果，本发明所述方法大大缩短了操作时间，方便快速。

4、成本低、易操作、简单：本发明最大的优点是不需要以往pcr检测所需要的pcr仪、电泳仪、凝胶成像系统等昂贵的专业仪器，仅需一台廉价的恒温仪器，如水浴锅，省去了繁琐的操作步骤和规程，简单易行。

5、检测结果直观，肉眼可判断：本发明扩增产物可通过加显色剂进行染色，绿色为阳性，即待测样品中含菜用大豆炭疽病菌，橙色为阴性，说明待测样品中不含菜用大豆炭疽病菌，肉眼可判断检测结果，无需电泳检测及凝胶成像。

附图说明

图1为本发明菜用大豆炭疽病菌的lamp特异性检测。a为lamp扩增后的琼脂糖凝胶电泳图，b为lamp扩增后的常光照射可视化显色，c为lamp扩增后的紫外光照射可视化显色，其中1-4为菜用大豆炭疽病菌，5-7分别为黄瓜炭疽病菌、胶孢炭疽病、香蕉炭疽病菌，8为阴性对照，1-4号显示绿色荧光。

图2为本发明菜用大豆炭疽病菌lamp检测灵敏性。a为lamp扩增后的琼脂糖凝胶电泳图，b为lamp扩增后的常光照射可视化显色，c为lamp扩增后的紫外光照射可视化显色，其中1-9模板dna浓度分别为1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、10ag，10为阴性对照，1-6号显示绿色荧光。

图3为本发明检测方法对发病植株和带菌土壤中菜用大豆炭疽病菌的检测。a为lamp扩增后的琼脂糖凝胶电泳图，b为lamp扩增后的常光照射可视化显色，c为lamp扩增后的紫外光照射可视化显色，其中1、9为阳性对照，2-3为菜用大豆炭疽病发病豆荚，4-5为菜用大豆炭疽病发病田块土壤，6为健康无病斑豆荚，7为高压灭菌土壤，8为阴性对照，1-5、9号显示绿色荧光。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例1：菜用大豆炭疽病菌环介导等温扩增（lamp）检测特异性引物的设计及引物特异性验证

1.供试菌株基因组dna的提取

采用ctab法提取供试菌株（表1）基因组dna，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5ml离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µl2%ctab（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2%ctab；100mmol/ltris-hcl，ph8.0；20mmol/ledta，ph8.0；1.4mol/lnacl）和90µlsds（十二烷基苯磺酸钠）【注：ctab，sds需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（dna释放至缓冲液中），12000r·min^-1离心15min；取上清液700µl，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min^-1离心9min；取上清液500µl，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r·min^-1离心5min；取上清液350µl，加入上清液1/10体积的3mol·l^-1naac和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min^-1离心5min；弃去上清液，加入700µl冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干至无酒精味，加入30~60µlte（10mmol/ltris-hcl，0.1mmol/ledta，ph8.0）溶液进行溶解，得到dna溶液，用紫外分光光度计检测dna浓度并稀释至100ng/µl待用。

表1供试菌株

2.菜用大豆炭疽病菌lamp检测特异性引物的设计

通过测定菜用大豆炭疽病菌（colletotrichumtruncatum）和其它炭疽病菌（colletotrichumspp）的核糖体转录间隔区（its）基因，对炭疽菌属不同种间its基因序列进行比对分析，利用在线lamp引物设计软件primersoftwareexplorerv4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html;eikenchemicalco.,japan)设计一套菜用大豆炭疽病菌特异性lamp引物组，由f3、b3、fip和bip组成，引物序列如下：f3:5’-atgcctgttcgag-cgtca-3’，b3:5’-tgggggttttacggctaga-3’，fip:5’-cgccactacctttaagggcct-tttcaaccctcaagctctgc-3’，bip:5’-gaccctctcggagcctcctt-gtccctccgaatcccaatg-3’。

3.菜用大豆炭疽病菌lamp检测方法的建立及引物特异性验证

以表1供试菌株的dna为模板，利用f3、b3、fip和bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2wt.%trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：64℃温育60min。

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0µl，静置5min，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即样品为菜用大豆炭疽病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品不是菜用大豆炭疽病菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品为菜用大豆炭疽病菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不是菜用大豆炭疽病菌。采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0µllamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条形判断为阳性，即样品为菜用大豆炭疽病菌，没有出现梯形条形则判断为阴性，即不是菜用大豆炭疽病菌。

4.引物特异性验证结果

lamp扩增结果表明，供试的菌株中只有菜用大豆炭疽病菌显色结果可观察到绿色荧光、浑浊状沉淀或琼脂糖凝胶电泳出现lamp特征的梯形带，其它病原真菌显色结果为橙色、透明状或琼脂糖凝胶电泳未出现扩增条带（图1），说明所设计的菜用大豆炭疽病菌f3、b3、fip和bip可以将菜用大豆炭疽病菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于菜用大豆炭疽病菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：菜用大豆炭疽病菌环介导等温扩增（lamp）检测灵敏度测定

1.不同浓度基因组dna的制备

用无菌超纯水对菜用大豆炭疽病菌基因组dna进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用；

2.lamp检测方法灵敏度测定及结果观察

以不同浓度的菜用大豆炭疽病菌基因组dna为模板，利用f3、b3、fip和bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2wt.%trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：64℃温育60min；

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0µl，静置5min，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即样品为菜用大豆炭疽病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品不是菜用大豆炭疽病菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品为菜用大豆炭疽病菌，透明无色状的判断为阴性，即样品不是菜用大豆炭疽病菌。采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0µllamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条形判断为阳性，即样品为菜用大豆炭疽病菌，没有出现梯形条形则判断为阴性，即不是菜用大豆炭疽病菌。

3.lamp扩增灵敏度检测结果

lamp扩增灵敏度检测结果表明，1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg/μl浓度的菜用大豆炭疽病菌基因组dna显色结果可观察到绿色荧光、浑浊状沉淀或琼脂糖凝胶电泳出现lamp特征的梯形带，其余浓度及阴性对照显色结果为橙色、透明状或琼脂糖凝胶电泳未出现扩增条带，说明所设计的菜用大豆炭疽病菌引物f3、b3、fip和bip通过lamp扩增，对菜用大豆炭疽病菌的检测灵敏度可达10fg/μl（图2）。

实施例3：发病组织中菜用大豆炭疽病菌的lamp检测

样品采集：从福建漳州、三明、连江采集菜用大豆炭疽病发病症状典型的豆荚及健康豆荚带回实验室备用；

植物组织dna的提取：采用naoh快速裂解法提取dna，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µl0.5mol/lnaoh，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5ml离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5µl加入495µl0.1mol/ltris-hcl（ph=8.0）混合均匀，取1.0µl作为pcr模板进行扩增。

扩增检测及观察：以上述提取的dna为模板，利用f3、b3、fip和bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2%trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：64℃温育60min；

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0µl，静置5min，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即样品中含有菜用大豆炭疽病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品中不含菜用大豆炭疽病菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品中含有菜用大豆炭疽病菌，透明无色状的判断为阴性，即样品中不含有菜用大豆炭疽病菌。采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0µllamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条形判断为阳性，即样品中含有菜用大豆炭疽病菌，没有出梯形条形带则判断为阴性，即样品中不含有菜用大豆炭疽病菌。

检测结果：检测结果（图3）表明，菜用大豆炭疽病发病的豆荚通过lamp扩增，显色结果可观察到绿色荧光、浑浊状沉淀或琼脂糖凝胶电泳出现lamp特征的梯形带，说明存在菜用大豆炭疽病菌，而健康豆荚及阴性对照显色结果为橙色、透明状或琼脂糖凝胶电泳未出现扩增条带，说明不存在菜用大豆炭疽病菌，该套技术能用于植物组织中菜用大豆炭疽病菌的快速分子检测。

实施例4：带菌土壤中菜用大豆炭疽病菌的lamp检测

样品采集：从福建漳州、三明、连江菜用大豆炭疽病发病严重的田块采集植株根部土壤带回实验室备用，以高压灭菌的土壤为对照；

土壤dna提取：采用sigma公司的土壤dna提取试剂盒（sigma,dnb100,soildnaisolationkit）提取土壤中的总dna，取1.0µl作为pcr模板进行扩增。

扩增检测及观察：以上述提取的dna为模板，利用f3、b3、fip和bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括5μm引物f3和b3各1.0μl，40μm引物fip和bip各1.0μl，lamp反应混合液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2%trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl；lamp反应条件：64℃温育60min；

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0µl,静置5min，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，即样品中含有菜用大豆炭疽病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，即样品中不含菜用大豆炭疽病菌，紫外光显色结果观察到浑浊状沉淀的判断为阳性，即样品中含有菜用大豆炭疽病菌，透明无色状的判断为阴性，即样品中不含有菜用大豆炭疽病菌。采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0µllamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条形判断为阳性，即样品中含有菜用大豆炭疽病菌，没有出现梯形条形则判断为阴性，即样品中不含有菜用大豆炭疽病菌。

检测结果：检测结果（图3）表明，菜用大豆炭疽病发病严重田块土壤dna通过lamp扩增，显色结果可观察到绿色荧光、浑浊状沉淀或琼脂糖凝胶电泳出现lamp特征的梯形带，说明存在菜用大豆炭疽病菌，而高压灭菌土壤及阴性对照显色结果为橙色、透明状或琼脂糖凝胶电泳未出现扩增条带，说明不存在菜用大豆炭疽病菌，该套技术可用于土壤中菜用大豆炭疽病菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>一种检测菜用大豆炭疽病菌的环介导等温扩增引物及应用

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