一种去棕榈酰化PD-L1蛋白质及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种去棕榈酰化pd-l1蛋白质及其制备方法和应用。

背景技术：

恶性肿瘤是我国发病率和死亡率均居前列的一类疾病，近年来临床诊断、手术、放化疗的发展使得一部分恶性肿瘤患者得到早期发现和有效治疗。然而在全世界范围内，寻找新的治疗方法和药物长期以来是肿瘤研究领域的热点。不同于传统的治疗方法，肿瘤免疫治疗能够激活或诱导人体建立起对肿瘤抗原的特异性免疫应答，清除原发或转移的肿瘤细胞，并建立免疫记忆，组织肿瘤的复发、耐药和转移。程序性细胞死亡分子1(pd-l1)是免疫检查点蛋白之一，其在限制t细胞活性中起主要作用，所属t细胞提供了主要的免疫抵抗机制，通过这种限制作用肿瘤细胞能够躲过免疫监视。在活化的t细胞上表达的pd-1与在肿瘤细胞上表达的pd-l1的相互作用对免疫应答起负调节并减弱抗肿瘤免疫力。pd-l1在肿瘤上的表达与黑色素瘤、肺癌、食管癌和其它类型的癌症的生存率下降相关，该通路可作为新的有前途的肿瘤免疫治疗靶点。

目前，已经有制药公司已经开发出了靶向pd-l1的抗体，在不同的肿瘤类型中显示出临床活性。pd-l1抗体通过在细胞表面结合pd-l1，阻断其与pd-1的结合并激活t细胞的免疫应答，提高抗肿瘤免疫力。但是，目前基于抗体的免疫检查点阻断疗法仍存在很大挑战及不足之处，例如有部分肿瘤患者对pd-l1抗体治疗反应不佳，此外治疗的效果还可能随着用药时间的延长而有所降低。因此对研究靶向pd-l1的新方法存在需求，以期使肿瘤患者获得更有效的治疗。

现有技术关于pd-l1蛋白质棕榈酰化修饰的存在、可发生棕榈酰化的氨基酸位点、棕榈酰化修饰对pd-l1蛋白质的表达和细胞内定位的影响等均未见公开。我们通过整合的生物信息学分析、蛋白质质谱检测、click-it棕榈酰化特异性免疫沉淀联合免疫印迹等方法，发现并证实了272位点半胱氨酸(cys)可以发生棕榈酰化修饰，并且是pd-l1蛋白质唯一可以发生棕榈酰化修饰的位点；同时，棕榈酰化对于pd-l1表达量的升高、细胞膜和高尔基体的定位均有显著的影响。因此，棕榈酰化的调控可能成为靶向pd-l1肿瘤免疫相关蛋白的新途径，为肿瘤的免疫治疗提供新的方法。

技术实现要素：

鉴于现有技术的上述不足，本发明的目的在于针对新发现的pd-l1的棕榈酰化修饰及其对pd-l1在癌细胞中表达和定位的显著影响。提供一种去棕榈酰化pd-l1蛋白质、制备方法及用途。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供一种去棕榈酰化pd-l1蛋白质，如下所示：

一种去棕榈酰化pd-l1蛋白质，其中，pd-l1蛋白质氨基酸序列中在272位点氨基酸的半胱氨酸替换为其它氨基酸；

进一步地，所述去棕榈酰化pd-l1蛋白质，其氨基酸序列中，氨基酸可任意被取代、可缺失或添加一个或几个氨基酸；

进一步地，所述其它氨基酸选自丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸；

进一步地，所述pd-l1蛋白质氨基酸序列中在272位点其他氨基酸为丙氨酸；

本发明第二方面提供一种去棕榈酰化pd-l1蛋白质的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、分析检测pd-l1蛋白质存在的棕榈酰化位点；

步骤2、根据步骤1得到的位点构建突变体氨基酸序列，进一步得到pd-l1蛋白质突变体的核苷酸序列；

步骤3、将编码突变体pd-l1的核苷酸序列片段连入真核生物表达载体中，构建成表达重组质粒；

步骤4、通过步骤3得到的表达重组质粒进行表达得到去棕榈酰化pd-l1蛋白质。

本发明第三方面还提供了上述去棕榈酰化pd-l1蛋白质在制备用于pd-l1蛋白质棕榈酰化相关验证中的用途。

本发明第四方面还提供了一种pd-l1蛋白质去棕榈酰化的方法；

本发明还提供了一种抑制肿瘤细胞中pd-l1表达的方法，其包括向有需求的受试者施用上述带有272位突变体pd-l1的核苷酸序列片段的表达重组质粒，抑制使受试者的肿瘤细胞的pd-l1。

本发明的技术方案，分析检测pd-l1蛋白质的发生棕榈酰化修饰及其准确位点，通过改变该修饰位点的氨基酸完全阻断pd-l1蛋白质的棕榈酰化，得到的去棕榈酰化pd-l1蛋白质具有不发生棕榈酰化的特点，使用本发明的去棕榈酰化pd-l1蛋白质作为阴性对照标准品，提高了棕榈酰化检测方法的准确性，能较好的验证调控pd-l1蛋白质棕榈酰化的方法的有效性；

本发明的去棕榈酰化pd-l1蛋白质的制备的方法，可以用于构建稳定表达细胞株，重复性好，有利于较大的规模制备去棕榈酰化的pd-l1蛋白质标准品，并且，得到的去棕榈酰化的pd-l1蛋白质纯度高，有利于提高验证的可靠性；

综上所述，本发明提供了不发生棕榈酰化的pd-l1蛋白质及其制备的方法，填补了目前尚无其它已知的方法可以可靠地制备完全不发生棕榈酰化的pd-l1蛋白质，更无较大规模的制备方法可供使用的技术空白。在调控pd-l1棕榈酰化修饰的基础和应用研究中，本发明的去棕榈酰化pd-l1蛋白质作为可靠的阴性对照样品，用于验证棕榈酰化检测方法的准确性，并可用于验证调控pd-l1蛋白质棕榈酰化的方法的有效性，在针对pd-l1肿瘤免疫相关蛋白的机制和干预研究中具有重要的应用价值。因此，本发明的技术方案具有明显的技术优势和进步。

附图说明

图1是实施例1中利用非放射标记(click-it棕榈酸标记)的方法，验证野生型pd-l1蛋白质棕榈酰化修饰示意图；

图2是实施例1中css-palm算法分析pd-l1氨基酸序列结果示意图；

图3是实施例1中胰酶切割、串联质谱分析检测pd-l1蛋白质存在棕榈酰化位点示意图；

图4是实施例2中272位点氨基酸替换为丙氨酸后的内切酶切割凝胶电泳图和dna测序结果示意图；

图5是实施例3检测去棕榈酰化pd-l1蛋白质不发生棕榈酰化结果示意图；

图6为实施例4中pd-l1突变体c272a在细胞膜的定位检测结果示意图；

其中，图1中，beads，ip为空白对照样品，click-it，ip为待验证野生型pd-l1蛋白质棕榈酰化样品，inputlysate为细胞裂解液中的pd-l1蛋白质(未发生榈酰化样品)；

图6中，椭圆状斑点为dapi荧光的细胞，箭头指示处，围绕dapi的不规则形状斑点为pd-l1。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原材料、仪器设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

本发明提供了一种去棕榈酰化pd-l1蛋白质，其中，pd-l1蛋白质氨基酸序列中在272位点氨基酸为丙氨酸；

所述去棕榈酰化pd-l1蛋白质的氨基酸序列为seqidno:1；

编码所述去棕榈酰化pd-l1蛋白质的核苷酸序列为seqidno:2；

本发明提供了一种去棕榈酰化pd-l1蛋白质的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、使用css-palm算法分析pd-l1氨基酸序列，对pd-l1蛋白质进行胰酶切割、串联质谱分析检测pd-l1蛋白质存在的棕榈酰化位点，pd-l1蛋白质存在棕榈酰化的位点为cys272；

步骤2、对步骤1得到的棕榈酰化的272位点的氨基酸替换为其他氨基酸得到pd-l1蛋白质272位点突变体氨基酸序列；

根据pd-l1蛋白质272位点突变体氨基酸序列，选用真核生物偏好密码子，合成编码pd-l1蛋白质272位点突变体的核苷酸序列；

步骤3、将编码突变体pd-l1的核苷酸序列片段连入真核生物表达载体中，构建成表达重组质粒；

步骤4、通过步骤3得到的表达重组质粒转染哺乳动物细胞，构建稳定细胞株进行表达得到去棕榈酰化pd-l1蛋白质。

在本发明较优的实施方式中，

所述步骤2中，其他氨基酸为不包括半胱氨酸；

在本发明较优的实施方式中，

所述步骤2中，其他氨基酸为丙氨酸；

在本发明较优的实施方式中，

所述步骤2中，所述pd-l1蛋白质272位点突变体氨基酸序列为seqidno:1；

所述编码pd-l1蛋白质272位点突变体的核苷酸序列为seqidno:2；

在本发明较优的实施方式中，所述步骤2中，

编码pd-l1蛋白质突变体的核苷酸序列的获得方法还可以使用以野生型pd-l1为模板通过定点突变的方法；

在本发明较优的实施方式中，所述步骤4中，

还可以利用瞬时转染方法表达目的蛋白；

在本发明较优的实施方式中，所述制备方法，

任选地，包括步骤5、对细胞表达的目的蛋白进行纯化。

本发明技术方案提供了以下方面用途或方法：

去棕榈酰化pd-l1蛋白质在验证棕榈酰化检测方法的准确性中的用途。

去棕榈酰化pd-l1蛋白质在用于验证调控pd-l1蛋白质棕榈酰化的方法的有效性中的的用途。

一种使用上述去棕榈酰化pd-l1蛋白质验证pd-l1蛋白质棕榈酰化相关的方法；

一种pd-l1蛋白质去棕榈酰化的方法；

一种抑制肿瘤细胞中pd-l1表达的方法，其包括向有需求的受试者施用上述带有272位突变体pd-l1的核苷酸序列片段的表达重组质粒，抑制使受试者的肿瘤细胞的pd-l1。

在调控pd-l1棕榈酰化修饰的基础和应用研究中，需要可靠的阴性对照样品(即不发生棕榈酰化的pd-l1蛋白质制剂)。本发明提供的去棕榈酰化pd-l1蛋白质可作为标准品，用于验证棕榈酰化检测方法的准确性，并可用于验证调控pd-l1蛋白质棕榈酰化的方法的有效性，在针对pd-l1肿瘤免疫相关蛋白的机制和干预研究中具有重要的应用价值。

下面结合实施例对本发明的技术方案作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、pd-l1蛋白质的棕榈酰化位点的确定

1、利用非放射标记(click-it棕榈酸标记)的方法，验证pd-l1蛋白质棕榈酰化的存在：

将click-itazide-palmiticacid作为棕榈酸类似物加入细胞培养基，标记被棕榈酰化修饰的所有蛋白质；进行alkyne-biotin的click-it反应，对棕榈酰化蛋白质进一步进行生物素标记；利用avidin微球免疫沉淀被标记的蛋白质，采用pd-l1特异性抗体检测发生棕榈酰化的pd-l1，以细胞裂解液中的pd-l1蛋白质作为对照，进行凝胶电泳和免疫印迹实验。结果如图1所示，表明野生型pd-l1发生了棕榈酰化修饰；

2、生物信息学方法预测的pd-l1蛋白质存在棕榈酰化位点；使用css-palm算法分析pd-l1氨基酸序列，提示272位点的半胱氨酸存在棕榈酰化修饰，该位点附近的氨基酸符合已知的棕榈酰化基序，如图2所示；

3、对通过免疫沉淀纯化肿瘤细胞rko中表达的野生型pd-l1蛋白质，进行胰酶切割、串联质谱分析检测pd-l1蛋白质存在的棕榈酰化位点，结果表明cys272位点存在棕榈酰化修饰，如图3所示；

综合上述分析检测表明，pd-l1蛋白质存在唯一棕榈酰化位点为cys272位点。

实施例2、去棕榈酰化pd-l1蛋白质的制备

1、构建编码去棕榈酰化pd-l1蛋白质的真核表达载体

对实施例1的棕榈酰化pd-l1蛋白质的氨基酸序列中272位点的氨基酸替换为丙氨酸，根据此pd-l1蛋白质272位点突变体氨基酸序列，选用真核生物偏好密码子，合成编码pd-l1蛋白质272位点突变体的核苷酸序列片段；

将编码突变体pd-l1的核苷酸序列片段连入真核生物表达载体中，构建成表达重组质粒；

经过限制性内切酶切割和dna凝胶电泳，证实编码突变体pd-l1的核苷酸序列片段插入成功；经过dna测序检测，显示编码突变体pd-l1蛋白在272位点带有错义突变，表明272位点氨基酸由原来半胱氨酸替换为丙氨酸，如图4所示；

2、通过上述得到的表达重组质粒转染哺乳动物细胞，构建稳定细胞株进行表达得到去棕榈酰化pd-l1蛋白质。

试验例3、检测去棕榈酰化pd-l1蛋白质不发生棕榈酰化的试验

将实施例2构建的带有272位点突变的pd-l1表达载体、对照空载体、野生型pd-l1表达载体分别转染不表达内源性pd-l1的sw480人结直肠癌细胞，并采用g418筛选稳定表达细胞株；将click-itazide-palmiticacid作为棕榈酸类似物加入细胞培养基，标记被棕榈酰化修饰的所有蛋白质；进行alkyne-biotin的click-it反应，对棕榈酰化蛋白质进一步进行生物素标记；利用avidin微球免疫沉淀被标记的蛋白质，进行凝胶电泳和免疫印迹实验，以细胞裂解液中的pd-l1蛋白作为对照，采用pd-l1特异性抗体检测发生棕榈酰化的pd-l1。

结果如图5所示，显示野生型pd-l1发生棕榈酰化修饰，而带有272位点突变的pd-l1完全不发生棕榈酰化修饰。

试验例4、检测去棕榈酰化pd-l1的定位试验

1、对人类结直肠癌细胞rko分别转染野生型pd-l1和突变体c272a的pd-l1，在48小时后，以甲醛固定细胞，用pd-l1特异性抗体标记pd-l1的细胞内定位，以dapi免疫荧光染色结果显示，野生型pd-l1存在显著的膜定位，而pd-l1突变体c272a在细胞膜的定位消失，如图6所示；

2、对人类结直肠癌细胞rko分别转染野生型pd-l1和突变体c272a的pd-l1。在48小时后，以甲醛固定细胞，使用58k特异性抗体标记高尔基体，并使用pd-l1特异性抗体标记pd-l1的细胞内定位，以dapi免疫荧光染色结果显示，结果相类似与细胞膜定位结果，野生型pd-l1存在显著的高尔基体定位，而pd-l1突变体c272a在高尔基体的定位明显减少或消失；

综合1和2表明，相对于野生型pd-l1存在的显著膜定位和高尔基体定位，pd-l1突变体c272a的定位明显减少。

综上所述，通过改变pd-l1唯一的棕榈酰化修饰位点(cys272)的半胱氨酸为其它氨基酸，通过转染真核细胞或者构建稳定表达细胞株，可以表达和纯化去棕榈酰化的pd-l1蛋白质，可较大规模制备去棕榈酰化的pd-l1蛋白质标准品。对pd-l1蛋白的靶向和功能研究中具有应用广泛的应用价值，对pd-l1肿瘤免疫相关蛋白的机制和干预研究中也具有重要的应用价值

以上详细描述了本发明的具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验得到的技术方案，皆应在权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110>上海交通大学医学院附属仁济医院

<120>一种去棕榈酰化pd-l1蛋白质及其制备方法和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>290

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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151015

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<213>人工序列(artificialsequence)

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