植物作为宿主在表达胰岛素样生长因子中的应用的制作方法
本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物尤其是植物作为宿主在表达人igf中的应用。
背景技术：
生长因子是一种天然存在的物质，可以刺激细胞生长,扩散、疗愈以及细胞分化。生长因子通常是一个蛋白质或者一个甾类激素。生长因子对调节多种细胞过程具有非常重要的作用。生长因子通常作为细胞间信号分子，促进细胞分化和成熟。但是每个生长因子之间的的作用不同。例如,骨形成蛋白刺激骨细胞分化，成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子刺激血管分化(血管生成)。
胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactors，igf)蛋白质序列与胰岛素高度相似，功能和结构也类似于胰岛素，大小约6kda。属于同一个蛋白质家庭来协调细胞增长和发展。编码的蛋白质前体经过加工后变成成熟蛋白，绑定特定的受体,并分泌出来。这个基因缺陷导致缺乏胰岛素样生长因子的一个原因。
目前，igf在大肠杆菌中生产。植物作为药物蛋白质的表达和生产系统，已经研究了近三十年。除了低成本和产量高等的优点外，基于植物的表达系统还降低了人和动物病原体从产生蛋白质的过程中传播到人类的风险。此外，植物真核蛋白内膜表达系统和分泌途径类似于哺乳动物细胞。植物表达系统可大量生产大分子量以及多亚基的药物蛋白质，且大大优于原核生物表达系统，比如大肠杆菌表达系统。如需要翻译后修饰的，糖基化的蛋白，以及需要组装的单克隆抗体，其不能用原核系统实现。利用植物生产的药用蛋白作为生物试剂已经商业化，或用作家禽的疫苗添加剂。2012年，美国食品和药物管理局(fda)批准了用于治疗遗传疾病1型戈谢病的蛋白elelysotm(taliglucerasealfa)，而这种蛋白是利用胡萝卜生产的。在过去十年中，人们对药物蛋白质的需求急剧增加，所以fda批准用于临床试验的植物药用蛋白质的数量也在不断增加。
植物瞬时表达系统可以大量生产重组蛋白用于临床研究或者应对突发性疾病。2014年，唯一用于有效抵抗埃博拉病毒爆发的抗体治疗药物，zmapptm，就是农杆菌渗透方法在烟草叶片中生产。zmapp的功效和安全性为推动植物制药业的行业开辟了道路。目前，烟草瞬间蛋白表达最常见的宿主植物，并且已经开发了各种载体和农杆菌渗透方法，用于在短时间内进行大规模生产。然而，烟草具有高纤维含量和潜在的有毒化合物，如生物碱尼古丁，显著增加了下游纯化过程中的成本，极大地阻碍了植物外源蛋白药物的进一步发展。与烟叶系统相比，生菜中含有更少的酚类和有毒化合物，因此，将生菜作为宿主在表达生长因子具有重要的现实意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供植物尤其是生菜作为宿主在表达胰岛素样生长因子中的应用。本发明利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了igf，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产igf。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了植物作为宿主在表达胰岛素样生长因子中的应用；所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述胰岛素样生长因子生长因子为人胰岛素样生长因子。
本发明还提供了一种表达载体，包括胰岛素样生长因子的核苷酸序列和双元植物载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述胰岛素样生长因子生长因子为人胰岛素样生长因子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：
步骤1：在胰岛素样生长因子的核苷酸序列的5’末端加入xbal限制性酶切位点，在3’末端加入sacl限制性酶切位点；
步骤2：克隆获得puc57-igf克隆载体；
步骤3：通过xbal/sacl分别从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段igf，克隆至双元植物载体pcam35s，获得表达载体p35s-igf。
具体的，本发明提供的表达载体的构建方法为：将igf(genbankaccession号：nm_001111285.2)由金斯瑞(南京)设计并合成。在igf序列5’末端加入xbal，在3’末端加入sacl位点，并由金斯瑞(南京)克隆到puc57-igf载体中(图1a)。生长因子基因片段igf通过xbal/sacl从puc57-igf克隆载体中分离(图1b)，并克隆到双元植物载体pcam35s，分别产生瞬时表达载体p35s-igf(图2)。在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的。植物表达载体通过xbal/sacl分离出igf基因片段。
将植物表达构建体通过用multiporator(eppendorf，hamburg，germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌gv3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/l)的选择性lb平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5lyeb(酵母提取物肉汤，5g/l蔗糖，5g/l胰蛋白胨，6g/l酵母提取物，0.24g/lmgso4，ph7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/l卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加yeb培养基测量od600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mmmes，10mmmgso4)中至o.d.600为0.5。
在本发明中，igfcdna序列(genbank:nm_001111285.2)如seqidno.1所示；igf氨基酸序列如seqidno.2所示。
本发明还提供了所述表达载体在表达胰岛素样生长因子中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述胰岛素样生长因子生长因子为人胰岛素样生长因子。
本发明还提供了一种植物作为宿主表达生长因子的方法，将所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得生长因子；
所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述方法中所述胰岛素样生长因子生长因子为人胰岛素样生长因子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：
步骤1：抽真空25～45s；
步骤2：保持真空(-95kpa)压力30～60s；
步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；
重复上述步骤2～3次，避光处理4d。
在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌为根癌土壤杆菌gv3101。
具体的，农杆菌介导真空渗透的方法为：将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2l烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(welchvacuum，niles，il，usa)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。
渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4天后显示淡黄褐色区域。为了增加浸入叶组织的土壤农杆菌的数量，使用剪刀将10％的生菜从头切掉使得生菜叶组织尽可能的浸润在渗透液中，和释放。与更长的真空暴露时间相比，该方法减少了叶片组织坏死。
在本发明的一些具体实施方案中，提取、分离蛋白质具体为：
经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10mmβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至ph为8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60min。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5ml缓冲液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；10mmβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。
收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5ul)热变性(95℃)加载缓冲液(biorad，hercules，ca，usa)在4～12％
植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。本发明用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组igf经过sds-page分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为6kda的条带(图3a)，在隐形对照泳道中没有明显的对应条带。基于bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量为0.57mg/g。另外，western印迹分析也检测到大约6kda的条带(图3b)，观察到的蛋白分子量与阳性对照组一致。
来自小鼠胚胎成纤维细胞nih/3t3细胞系在含有10％(v/v)胎牛血清(fbs，gibco)的dulbecco改良的eagle培养基(dmem，gibco)中于37℃，在5％co2中培养。将nih/3t3细胞在24孔板中生长至100％汇合。血清饥饿细胞16h，用无菌移液针头刮伤nih/3t3表面，用pbs洗涤去除细胞碎片。然后用100ng/ml的剂量用纯化的igf以及标准品刺激细胞48h。使用显微镜(尼康)对初始伤口和细胞在划伤区域。
通过细胞实验研究纯化的igf的生物活性。首先，使用纯化的重组igf培养nih/3t3细胞，使用相同的商业用igf标准作为阳性对照。nih/3t3的细胞增殖可以通过剂量通过使用100ng/ml剂量的纯化重组igf时发现，在48h的时间点检查细胞生长结果表明，没有任何处理的nih/3t3细胞生长较差。相比之下，使用纯化的重组igf或相等的阳性对照igf标准处理的nih/3t3细胞生长良好；它们在划伤表面拉伸蔓延(图4)。这些结果表明，通过生菜系统瞬间表达的外源igf具有生物学活性，生菜系统可能是生物活性重组药物蛋白质批量生产的合适的生物反应器。
用于真空农杆菌渗透的烟草植物的生长时间通常为4至6周。本发明利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了igf，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产igf细胞生长因子。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1(a)示igf克隆载体(金斯瑞构建合成)；
图1(b)示igf基因片段酶切(xbal/saci)鉴定；
图2示植物瞬时表达载体p35s-igf构建流程；利用限制性内切酶(xbai/saci)双酶切，从图1克隆载体分别切下igf片段，连接入pcam35s的xbai/saci位点，生成植物瞬时表达载体p35s-igf；
其中，35s，具有烟草花叶病毒(tmv)5‘utr的camv35s启动子；nptii，用于卡那霉素抗性的编码nptii基因的表达；nos3’，终止子；
图3(a)示利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测纯化的重组成纤维细胞生长因子；泳道1:纯化重组igf(5μg)；泳道2：阳性对照igf(5μg)；
图3(b)示western印记杂交检测纯化的重组成纤维细胞生长因子；泳道1：纯化重组igf(5μg)；泳道2：非真空渗透叶片洗脱液阴性对照；
图4示细胞增值实验；使用纯化的igf处理划痕nih/3t3细胞，进行愈合测定；48小时后，重组细胞生长因子明显促进细胞增殖活性。
具体实施方式
本发明公开了生菜作为宿主在表达生长因子中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明研究表明，生菜系统可以是有效的表达平台，为快速，瞬时表达重组蛋白质提供了方法。真空农杆菌渗透方法简单，快速，减少叶片坏死，而且可以提高重组蛋白产量。生菜可以通过承受真空压力而增加蛋白质产量，并允许每片叶子更完整的渗透。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其他瞬时表达植物，如烟草等更容易获得并且更便宜。并且由于不需要特殊设备或液氮，成本效益更高。本发明证明该方法可以用于短时间内大规模生产igf重组蛋白质。
本发明提供了生菜作为宿主在表达生长因子中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1植物瞬时表达载体的构建
为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，本发明提供的表达载体的构建方法为：将人igf(genbankaccession号：nm_001111285.2)由金斯瑞(南京)设计并合成。在igf序列5’末端加入xbal，在3’末端加入sacl位点，并由金斯瑞(南京)克隆到puc57-igf载体中。生长因子基因片段igf通过xbal/sacl从puc57-igf克隆载体中分离，并克隆到双元植物载体pcam35s，分别产生瞬时表达载体p35s-igf。将三种植物表达构建体分别通过用multiporator(eppendorf，hamburg，germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌gv3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/l)的选择性lb平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5lyeb(酵母提取物肉汤，5g/l蔗糖，5g/l胰蛋白胨，6g/l酵母提取物，0.24g/lmgso4，ph7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/l卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加yeb培养基测量od600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mmmes，10mmmgso4)中至o.d.600为0.5。
所述克隆igf基因片段(图1)，并且构建两种基于双因素病毒的植物表达载体p35s-igf(图2)。在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的。
实施例2农杆菌介导的真空渗透
本发明优化了农杆菌真空渗透的方法。将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2l烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(welchvacuum，niles，il，usa)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。
渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4天后显示淡黄褐色区域。为了增加浸入叶组织的土壤农杆菌的数量，使用剪刀将10％的生菜从头切掉使得生菜叶组织尽可能的浸润在渗透液中，和释放。与更长的真空暴露时间相比，该方法减少了叶片组织坏死。
实施例3蛋白质提取和分离
经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10m
实施例4sds-page凝胶电泳以及westernblot蛋白印迹杂交
收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5ul)热变性(95℃)加载缓冲液(biorad，hercules，ca，usa)在4～12％
植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。我们用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组igf经过sds-page分离。在泳道中观察到估计分子量大约为5kda，19kda，以及6kda的条带(图3a)，在隐形对照泳道中没有明显的对应条带。基于bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量为分别为0.57mg/g。另外，western印迹分析也检测到大约为6kda的条带(图3b)，观察到的蛋白分子量与阳性对照组一致。
实施例5细胞增值实验
来自小鼠胚胎成纤维细胞nih/3t3细胞系在含有10％(v/v)胎牛血清(fbs，gibco)的dulbecco改良的eagle培养基(dmem，gibco)中于37℃，在5％co2中培养。将nih/3t3细胞在24孔板中生长至100％汇合。血清饥饿细胞16h，用无菌移液针头刮伤nih/3t3表面，用pbs洗涤去除细胞碎片。然后用100ng/ml的剂量用纯化的igf以及标准品刺激细胞48h。使用显微镜(尼康)对初始伤口和细胞在划伤区域。
通过细胞实验研究纯化的haigf的生物活性。首先，使用纯化的重组igf培养nih/3t3细胞，使用相同的商业用igf标准作为阳性对照。nih/3t3的细胞增殖可以通过剂量通过使用100ng/ml剂量的纯化重组igf时发现，在48h的时间点检查细胞生长结果表明，没有任何处理的nih/3t3细胞生长较差。相比之下，使用纯化的重组igf或相等的阳性对照igf标准处理的nih/3t3细胞生长良好；它们在划伤表面拉伸蔓延(图4)。这些结果表明，通过生菜系统瞬间表达的外源igf具有生物学活性，生菜系统可能是生物活性重组药物蛋白质批量生产的合适的生物反应器。
实施例6
对照组：利用烟叶生产igf；
实验组：本发明提供的生菜生产igf；
表1人胰岛素样生长因子
*示与对照组相比p≤0.05；#示与对照组相比p≤0.01；
由表1可知，与对照组的烟叶系统相比，生菜瞬时表达人胰岛素样生长因子(igf)，显著(p≤0.05)缩短了生产周期，显著(p≤0.05)提高了蛋白含量，显著(p≤0.05)提高了蛋白活性，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(p≤0.01)降低了生产成本。
综合上述试验结果表明，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台。能够快速瞬时表达重组蛋白质，可以在短时间内大规模生产人胰岛素样生长因子。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>深圳惠升生物科技有限公司
<120>植物作为宿主在表达胰岛素样生长因子中的应用
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