芽孢杆菌属细菌、制剂、其制备方法、优化方法及应用与流程

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及芽孢杆菌属细菌、制剂、其制备方法、优化方法及应用。

背景技术：

近年来，随着城市人口的日益膨胀和工业化的快速发展，我国城市污水和工业废水的排放问题日益严峻。过度排放的废水导致水质环境恶化，富营养化程度增加以及生物多样性的降低等，严重威胁到水体生态健康和生态文明建设。

在水质参数的检测中，氮(n)元素是水质负荷的重要影响指标，水体中氮元素的富余常常导致硝态氮(no3^－)、亚硝态氮(no2^－)和铵态氮(nh4⁺)的含量严重超标，远远超出水体的自净能力，形成n源营养的极大累积，从而引发藻类、微生物的异常增殖，导致赤潮、水华以及腐生微生物的大量滋生，形成水质黑臭、生态景观丧失等后果。

因此，去除水体中的氮元素是环保工作的重要环节，它对清洁水体有着重要意义。目前的脱氮和降氮方法包括化学法、物理法、工程法和生物学方法。在这些方法中，化学法易产生二次污染和生态风险，物理法见效较慢，工程法人力成本过高；而生物法被公认为脱氮、除氮的最经济有效的方法之一，其中最为广泛的是利用微生物的生物脱氮法。

基于微生物的生物脱氮法由硝化反应和反硝化反应组成，反硝化细菌通过硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、no还原酶、n2o还原酶的催化将硝酸盐和亚硝酸盐转化为气态氮，也可将氨在好氧条件下直接转化成气态产物。好氧反硝化脱氮技术具有同步硝化和反硝化的优势，硝化产物直接成为反硝化反应的底物，避免了由于中间产物亚硝酸盐和硝酸盐的积累对硝化反应的抑制，加速了硝化反硝化进程。目前发现的好氧反硝化细菌主要包括假单胞菌属(pseudomonassp.)、产碱杆菌属(alcaligenessp.)、副球菌属(paracoccussp.)、不动杆菌属(acinetobactersp.)以及芽孢杆菌属(bacillussp.)等，这些菌株对于改善水体，降低水体中的氮素含量具有显著效果，对于控制水体富营养化，处理污水和净化水体有着极大的利用价值。

尽管目前已经有许多脱氮微生物被分离和应用，然而各种菌类的脱氮能力各异，其生存能力也不一致。从环境中筛选出自然生长的，脱氮效果更好，环境适应性更强的菌株或者脱氮微生物是人们一直努力的目标。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌属细菌、制剂、其制备方法、优化方法及应用，旨在解决现有技术中水体脱氮的问题。

为了达到上述目的，本发明实施例第一方面提供了一种芽孢杆菌属细菌。该芽孢杆菌属细菌选自如下细菌中的一种：

芽孢杆菌1号，保藏编号为gdmccno.60155；

芽孢杆菌4号，保藏编号为gdmccno.60156；

芽孢杆菌7号，保藏编号为gdmccno.60158；

芽孢杆菌11号，保持编号为gdmccno.60159。

本发明实施例第二方面提供了一种制剂。所述制剂选自如下菌株的细菌制剂中的一种或者多种：

芽孢杆菌1号，保藏编号为gdmccno.60155；

芽孢杆菌4号，保藏编号为gdmccno.60156；

芽孢杆菌7号，保藏编号为gdmccno.60158；

芽孢杆菌11号，保持编号为gdmccno.60159。

可选地，该制剂可以由如下菌株的细菌制剂组成：

芽孢杆菌菌4号，保藏编号为gdmccno.60156；

芽孢杆菌菌7号，保藏编号为gdmccno.60158；

芽孢杆菌菌11号，保持编号为gdmccno.60159。

芽孢杆菌属细菌：

芽孢杆菌菌1号，保藏编号为gdmccno.60155；

芽孢杆菌菌4号，保藏编号为gdmccno.60156；

芽孢杆菌菌11号，保持编号为gdmccno.60159。

本发明实施例第三方面提供了上述制剂在水体脱氮处理中的应用。

本发明实施例第四方面还提供了一种制剂的制备方法。所述制备方法包括如下步骤：

在预设的培养条件下，将单一的菌株加入培养基中进行发酵培养；所述菌株选自如下细菌：芽孢杆菌菌1号，保藏编号为gdmccno.60155；芽孢杆菌菌4号，保藏编号为gdmccno.60156；芽孢杆菌菌7号，保藏编号为gdmccno.60158；芽孢杆菌菌11号，保持编号为gdmccno.60159；

收集所述菌株的发酵产物，制备对应的细菌制剂；

将所述细菌制剂进行复配，制成如权利要求2－4任一所述的制剂。

可选地，所述预设的培养条件包括发酵培养温度、发酵培养时间以及发酵培养方式；

所述发酵培养温度为25－30℃；所述发酵培养时间为24－36小时；所述发酵培养方式为旋转震荡培养，转速为180－200转/分钟。

可选地，所述培养基为lb液体培养基；按1000ml体积计算，所述lb液体培养基的组分为：

本发明实施例第五方面提供了一种制剂组分的优化方法。所述优化方法包括如下步骤：

测试各待检测的制剂组分的脱氮效果；所述制剂组分选自如下细菌制备的细菌制剂：

芽孢杆菌菌1号，保藏编号为gdmccno.60155；

芽孢杆菌菌4号，保藏编号为gdmccno.60156；

芽孢杆菌菌7号，保藏编号为gdmccno.60158；

芽孢杆菌菌11号，保持编号为gdmccno.60159；

在所述制剂组分中，任意抽取两个、三个以及四个制剂组分组成待检测制剂组合；

测试所述制剂组合的的脱氮效果；

通过所述制剂组合和制剂组分的脱氮效果的对比，确定最优的制剂组合。

本发明实施例第六方面提供了一种降硝氮菌株的鉴定方法。所述鉴定方法包括如下步骤：通过pcr扩增方法，扩增待检测菌株的16s－rdna，获得扩增产物；纯化所述扩增产物并进行dna测序；对所述dna测序结果进行序列同源性分析；以及根据所述序列同源性分析结果，确定待检测菌株的分子检测结果。

本发明实施例提供的芽孢杆菌属细菌属于好氧反硝化菌，能够降低水体中的硝氮值，具有生长速度快，容易培养的优点。并且，菌株来源于自然环境，不会对生态环境造成二次污染。而基于提供的芽孢杆菌属细菌制备的制剂具有特定组合方式，可以取得更优的降氮效果。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制

图1为本发明具体实施例的bacillussp.cmj1-14，xzx-1的菌落形态图。

图2为本发明具体实施例的bacillussp.zsaxzx-4的菌落形态图。

图3为本发明具体实施例的bacillusamloliquefaciensxzx-7的菌落形态图。

图4为本发明具体实施例的bacillussubtillisxzx-11的菌落形态图。

图5为本发明具体实施例的标准曲线。

图6为本发明具体实施例的单一制剂的硝氮值测定值的曲线图。

图7为本发明具体实施例的复合制剂的硝氮值测定值的曲线图。

生物保藏信息：

bacillussp.cmj1-14，xzx-1，保藏机构为广东省微生物菌种保藏中心(机构简称gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼；保藏编号为：gdmccno.60155；

bacillussp.zsaxzx-4保藏机构为广东省微生物菌种保藏中心(机构简称gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼；保藏编号为：gdmccno.60156；

bacillusamloliquefaciensxzx-7，保藏机构为广东省微生物菌种保藏中心(机构简称gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼；保藏编号为：gdmccno.60158；

bacillussubtillisxzx-11，保藏机构为广东省微生物菌种保藏中心(机构简称gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼；保藏编号为：gdmccno.60159。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例中揭露的数值及其数值范围是近似值，而并非确定值。在误差或者实验条件允许的情况下，可以包括在误差范围内的所有值。本发明实施例中提供的数值范围用于表示在混合物中的组分的相对量以及其他方法实施例中列举的温度或者其他参数的范围。

本发明实施例中表述的术语“选自”包括了：单一菌株以及包含至少两种菌株的混合物。在包含至少两种菌株的混合物中，混合物中不同菌株之间的比例可以相同，例如在包含两种菌株的混合物中，菌株的比例均为50％。在一些实施例中，这些菌株的比例也可以是根据实际情况，在合适的范围内进行调整后的比例。

本发明实施例中表述的术语“制剂”、“制剂组分”、“细菌制剂”“制剂组分”、“制剂组合”是指包含具备活性代谢、生长、繁殖潜力的细菌细胞的纯培养物、培养物浓缩物或者经过任何处理方式处理后形成的制备物。其具有相应的生物活性功能或者实现某项生物活性功能的潜力，具体可以以任何合适的形态存在，例如干粉状、固体块状或者液体状等。在一些实施例中，其还可以附着或者承载于任何合适的载体上，用以实现相应的生物活性功能。

本申请人在研究过程中发现，如下的芽孢杆菌属细菌属于好氧反硝化菌，具备较好的生物活性功能，可以应用于水体的脱氮处理中，有效的降低水体中的硝氮值，从而减轻水体营养化现象等：

bacillussp.cmj1-14，xzx-1，保藏机构为广东省微生物菌种保藏中心(机构简称gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼；保藏编号为：gdmccno.60155；为陈述简便，以下简称为“芽孢杆菌1号”；

bacillussp.zsaxzx-4保藏机构为广东省微生物菌种保藏中心(机构简称gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼；保藏编号为：gdmccno.60156；为陈述简便，以下简称为“芽孢杆菌4号”；

bacillusamloliquefaciensxzx-7，保藏机构为广东省微生物菌种保藏中心(机构简称gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼；保藏编号为：gdmccno.60158；为陈述简便，以下简称为“芽孢杆菌7号”；

bacillussubtillisxzx-11，保藏机构为广东省微生物菌种保藏中心(机构简称gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号，广东省微生物研究所，59号楼5楼；保藏编号为：gdmccno.60159；为陈述简便，以下简称为“芽孢杆菌11号”。

本发明实施例提供的上述四个菌株可以通过如下的菌种筛选方法筛选获得。该筛选方法包括如下步骤：

1、分离培养：

采集样本(池塘底泥样品)无菌保存带回实验室后，取1g泥样加入无菌水100ml，充分震荡混匀，静置片刻后取上清进行倍比稀释。然后，将稀释液无菌涂布于新配置的lb固体培养基中，于30℃恒温培养箱中培养24－48h，挑出形态明显的单克隆菌体，接种于新配置的液体lb培养基中。

2、降氮菌株的筛选：

将挑取的单克隆菌体进行培养，至菌浓度达到od600＝0.6－0.8时，加入到生活污水(来自深圳市西丽水库废水处理厂)中，接种量5％(即100ml污水中加入上述单克隆菌液5ml)。在摇床上进行培养，每隔1天测定硝态氮含量，连续监测6天。与不加入菌液的对照组进行对比，将实验终点与实验起点的硝态氮值进行比较，降低程度在两倍以上的判别为阳性菌株，挑取其中效果最好的菌株进行鉴定。

具体的，降氮菌株的筛选方法具体可以包括如下步骤：

2.1、废水样品的预处理：

将采回的废水样品先使用0.45μm大孔水相滤膜过滤一次，除掉颗粒和部分微生物。然后，再使用0.22μm水相滤膜过滤一次，进一步除去微小细菌。最后，将过滤后的城市生活污水分装至50ml的灭菌培养管中待用，每个管的装液量为30ml。

2.2、降氮菌株的准备：

将菌株进行试管培养(50ml总体积，装液量20ml)。培养期间使用多功能酶标仪(infinitem200pro)检测四株菌株的od600值，当菌株od600值达到0.6－0.8时，该菌株可用于后续实验。

将0.5ml菌液装至2ml的离心管中，13000g离心3分钟，去上清。然后再加入1.5ml灭菌的去离子水，震荡摇匀后再次离心，洗涤两次后收集菌泥。然后，在离心管中加入步骤2.1中处理过的1ml废水，轻轻混匀，用移液器将混合液转移至50ml的培养管中(装液量30ml)，进行降氮试验，平行试验3次。

2.3、no3^－的测定方法：

量取5ml污废水于falcon流式小管中，使用间断化学分析仪dechem－tech(德国，cleverchem380)制作no3^－标准曲线(如图5所示)，用于对空白组、对照组样品中硝氮值进行测试。每隔1天对各组进行硝态氮含量的测定，连续监测6天，观察各组的硝氮值变化情况。

上述间断化学分析仪dechem－tech测量硝氮值方法原理为：硝酸根离子在ph为7.80－7.85的环境中被镉柱还原成亚硝酸根离子，在酸性条件下与对氨基苯磺酰胺发生重氮耦合反应生成重氮盐，再与n－(1－萘基)－乙二胺二盐酸盐(c12h14n2.2hcl)偶联，生成粉红色的络合物，在550nm波长下有最大吸收，可用于比色测定。

测定中需要使用的试剂配置如下：

a)试剂r1咪唑缓冲溶液：咪唑30g、2％硫酸铜0.25ml、蒸馏水3000ml

首先，加入500ml蒸馏水溶解30g咪唑。然后加水至2500ml，准确调节ph值至7.80－7.85，并最终定容至3000ml。此溶液可同时作为仪器清洗液(装入5l清洗桶中)，在4℃条件下，可保存4－5个月。

b)试剂r2还原溶液：对氨基苯磺酰胺(nh2c6h4so2nh2)1g、浓盐酸10ml、蒸馏水100ml

称取1g磺胺于水中，加入10ml浓盐酸后，定容至100ml。配置后用玻璃瓶储存并置于4℃冰箱中，可保存2周。

c)试剂r3显色剂：n－(1－萘基)－乙二胺二盐酸盐(c12h14n2.2hcl)0.1g、蒸馏水100ml

加入0.1gn－(1－萘基)－乙二胺二盐酸盐(c12h14n2.2hcl)，用蒸馏水定容至100ml。配置后用棕色瓶包裹于4℃冰箱保存，可保存4－5周。

d)硝酸盐标准溶液：

储备液：100mg/l(以n计)，准确称取0.7218g硝酸钾用蒸馏水溶解，定容至1000ml，此溶液相当于100mg/1n，存放于冰箱中每月更换。亦可从国家标物中心购买。

工作液：根据需要用蒸馏水稀释储备液，存放于4℃冰箱中，可保存2周。

2.4、比色测定过程：

使用酚二磺酸分光光度法测量样品硝氮值，硝酸盐在无水情况下与酚二磺酸反应，生成硝基二磺酸酚，在碱性溶液中，生成黄色化合物，于410nm波长处有最大吸收值，可进行分光光度测定。根据吸光值的数据，对照标准曲线范围，进行硝态氮浓度的换算。

2.5、降氮阳性菌株的判定：

在试验终点(即第6天时)若所述实验组中菌株对降低污废水硝氮值低于所述对照组污废水硝氮值两倍以上，则所述待检测菌为降低污废水硝氮值细菌菌株；反之，则所述待检测菌不判定为降低污废水硝氮值细菌菌株。

3、菌株的鉴定：

在本实施例中，通过步骤二筛选出了4株阳性菌株，分别标记为1#，4#，7#和11#，从形态和16sr－rna序列分析两个方面对该阳性菌株进行鉴定。

3.1形态学鉴定：

将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离得到的菌株进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。

图1－4为本发明实施例的各个菌株对应的菌落形态示意图。其中，如图1所示，菌株1#形态为微小圆球形，菌落呈乳白色，表面湿润、边缘平坦。如图2所示，菌株4#形态为光滑的大圆球形，菌落呈乳白色，表面湿润、中间隆起。如图3所示，菌株7#形态为不规则圆形，外圈有细小绒毛，菌落呈淡黄色，表面干燥，边缘平坦。如图4所示，菌株11#形态为光滑大圆球形，菌落呈淡黄色，表面湿润，边缘平坦。

3.216sr－rna序列分析：

常规方法培养上述步骤一分离得到的菌株1^#，4^#，7^#和11^#，提取菌株的总dna作为基因扩增模板，采用通用引物进行pcr扩增。

其中，正向引物为：27f:5'-agagtttgatcmtggctcag-3'；

反向引物为：1492r:5'-tacggytacctttgttacgactt-3'，

pcr扩增在30μl反应体系中进行，反应体系如下：

反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。

pcr产物用1％凝胶电泳检测，电泳条件：3μl样品+1％琼脂糖凝胶，marker条带组成：100bp；250bp；500bp；750bp；1000bp；2000bp；3000bp；5000bp。750bp条带浓度为20ng/μl,显示为加亮带，其余条带浓度均为10ng/μl。

然后，对pcr产物进行基因测序。其中，菌株1^#的16s-rdna测序结果为seqid1，菌株4^#的16s-rdna测序结果为seqid2，菌株7^#的16s-rdna测序结果为seqid3，菌株11^#的16s-rdna测序结果为seqid4。

最后，将测序结果通过美国国家生物技术信息中心ncbi数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列比对分析。

3.3、鉴定结论：

结合所述形态特征和16srdna序列同源性分析结果，上述四个阳性菌株的鉴定结果为：

菌株1^#的菌种名称为：芽孢杆菌，对应上述的芽孢杆菌1号；菌株4^#的菌种名称为：芽孢杆菌，对应上述的芽孢杆菌4号；菌株7^#的菌种名称为：解淀粉芽孢杆菌，对应上述的芽孢杆菌7号；菌株11^#的菌种名称为：枯草芽孢杆菌，对应上述的芽孢杆菌11号。

本发明实施例还进一步提供了应用上述菌株制备相应的制剂的制备方法以及在制备过程中，对于制剂组分的优化方法。

该制剂可以应用于生活废水或者工业废水的水处理，用以降低废水中的硝氮值含量。其具体制备方法包括如下步骤：

4、单一制剂的制备和降氮活性验证：

将四株细菌(1#、4#、7#、11#)进行单一培养，一段时间后至细菌浓度在od600＝0.6－0.8时，将单一菌株的培养液进行离心，去上清，无菌去离子水洗涤两次后，用过滤好的城市污水对菌泥进行重悬(每30ml城市污水中加入0.5ml细菌培养液的菌泥)。

单一制剂的试验周期为6天，每天取5ml污废水于falcon流式小管中，使用间断化学分析仪dechem－tech对硝氮值进行测定，分析单一制剂对城市污水硝氮值的降解能力。

在本发明实施例中，所述单一制剂的硝氮值测定结果如表格1所示：

表格1

图6为表格1对应的硝氮值测定结果的示意图，根据图6和表格1所示的硝氮值测定结果可以看出：

①、对照组的no3^－值在整个实验周期中维持在0.2mg/l的水平。

②、4种实验菌株对no3^－值的降低都有一定的作用，从第三天起开始快速降低。

③、4#，7#和11#菌株的脱氮能力相似，至终点时no3^－值降低为对照的三分之一。

④、1#菌株的脱氮能力最佳，终点时no3^－值降低为对照的四分之一，残余no3^－仅为0.042mg/l。

5，复合制剂的制备和降氮活性验证：

分别将四株细菌(1#、4#、7#、11#)按照排列组合的方式，抽取其中的两株、三株以及四株细菌，形成如下所示的11种制剂组合：

1#和4#(组合1)、1#和7#(组合2)、1#和11#(组合3)、4#和7#(组合4)、4#和11#(组合5)、7#和11#(组合6)、1#和4#和7#(组合7)、1#和4#和11#(组合8、1#和7#和11#(组合9)、4#和7#和11#(组合10)、1#和4#和7#和11#(组合11)。

制剂组合中加入的菌液浓度与单一制剂的菌液浓度相同，并且在细菌浓度为od600＝0.6－0.8时，采用与步骤四相同的方法，对各个制剂组合的硝氮值进行测定。

在本发明实施例中，所述单一制剂的硝氮值测定结果如表格2所示：

表格2

图7为表格2所示的制剂组合的硝氮值测定结果的示意图。根据图7和表格2所示的硝氮值测定结果可以看出：

①、所有的制剂组合都具有明显的降低硝态氮的效果。

②、制剂组合1#和4#和11#、4#和7#和11#以及1#和4#和7#和11#的效果最优，均能够将硝态氮浓度降低5倍以上，低于0.05mg/l。

综上所述，本发明实施例提供的4个菌株从自然环境中筛选获得，投入使用后不会对生态环境造成二次污染。经过实验验证，4个菌株为好氧反硝化菌，具有适应性强、生长速度快、易培养等优点，能够很好的应用于水体除氮处理。

另外，还通过对比试验，提供了基于上述4个菌株的复合制剂的最优组分比例，获得了比单一制剂更优秀的除氮效果。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<120>芽孢杆菌属细菌、制剂、其制备方法、优化方法及应用

<141>2017-09-05

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1442

<212>dna

<213>bacilus

<400>1

ggttggcggtgctataatgcagtcgagcgaactgattagaagcttgcttctatgacgtta60

gcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagactgggataacttcggga120

aaccgaagctaataccggataggatcttctccttcatgggagatgattgaaagatggttt180

cggctatcacttacagatgggcccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcac240

caaggcaacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacg300

gcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacg360

gagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaaga420

acaagtacgagagtaactgctcgtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaac480

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<212>dna

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<400>2

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