本发明涉及一种产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其应用，属于发酵工程
技术领域：
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背景技术：
：“曲是酒之骨”，大曲在白酒生产中起到至关重要的作用。其制备目的为：多功能菌系、多酶体系以及多种生香物质的形成。在大曲生产工艺中，细菌和酵母菌首先发酵，使曲心温度升高，热量外散形成适宜霉菌生长的表层；而后，随着水分的散发，霉菌内生，曲面逐渐干燥，形成封闭层，大曲内部多菌系发酵所产生的生物热散发受阻，形成较高的“顶火温度”，香气成分也是在这时开始产生的。为了达到以上目的，传统工艺巧妙地采取了压曲、微生物富集、并房与收堆等策略，在自然富集的基础上，通过逐渐增加曲块的空间密度提高曲温，达到了菌系与酶系的自然纯化，以及曲制风味物质的形成。近年来的研究表明，白酒中的多种类化合物具有健康功能性，特别是存在于白酒中的含氮化合物-四甲基吡嗪类化合物；在传统制曲工艺中，该类物质需要在高温条件下(﹥60℃)合成。但是，鉴于较高的曲房温度、较大的翻曲劳动强度，以及复杂的工艺调节致使产品品质较难控制，致使高温大曲中四甲基吡嗪的合成效果并不理想。近年来，在大曲制备工艺中，从原料粉碎到压曲已实现机械化，但是后续工艺仍停留在传统手工操作水平。所以，如何在降低制曲温度、减少劳动强度的前提下，生产高四甲基吡嗪含量的大曲，成为行业研究的重点课题。此前，发明人利用地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、解脂肪芽孢杆菌四种菌，分别采取单独和混合菌株培养模式进行产四甲基吡嗪实验，结果显示，虽然这些菌株实验室四甲基吡嗪的产量较高，但在高温大曲培养模式中，四甲基吡嗪含量仅为中温架式大曲培养模式的1/10到1/5水平，远不能满足工业生产功能大曲的需求。因此，筛选一株能够采用中温架式生产高四甲基吡嗪含量大曲的地衣芽孢杆菌十分有必要。技术实现要素：为了降低制曲温度和劳动强度，提高大曲四甲基吡嗪含量，本发明旨在提供一种产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌及其应用。本发明将筛选得到的具有高四甲基吡嗪合成能力的地衣芽孢杆菌经过初期培养后，应用到优化后的架式大曲培养工艺中。由于在发酵过程中前期保持适宜的制曲温度，使功能微生物合成较多的四甲基吡嗪前体物，经28d中温(﹤50℃)制曲工序，四甲基吡嗪含量达到达到400mg/kg。本发明产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌，分类命名为地衣芽孢杆菌gjbl055(bacilluslicheniformisgjbl055)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年4月24日，保藏编号为cctccno：m2017204，保藏地址为中国武汉武汉大学。本发明产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的应用，是将产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌应用到中温架式大曲培养工艺中，生产高四甲基吡嗪含量的大曲。本发明产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌的应用，包括如下步骤：步骤1：功能菌培养液的制备用接种环挑取1-2环保存于斜面的地衣芽孢杆菌gjbl055菌株于300-400ml液体培养基中，37℃下120rpm摇床培养24h，获得一级种子液；将一级种子液按10％的接种量接种于发酵罐中，37℃下80rpm培养24h，获得二级种子液；再将二级种子液按10％的接种量接种于发酵罐中，37℃下80rpm培养24h，获得三级种子液，即为功能菌培养液；10％的接种量是指一级或二级种子液的体积占发酵罐体积的比例。所述液体培养基按质量浓度构成如下：葡萄糖1wt％，酵母浸膏1wt％(购自安琪酵母股份有限公司)，氯化钠0.5wt％，溶剂为水。步骤2：功能菌培养液的加入将步骤1获得的功能菌培养液加入制曲专用贮水箱中，混匀后加入制曲物料全麦粉并搅拌均匀，通过踩制使物料充分混合并控制含水率为36-37％，获得曲坯，每块曲坯的厚度控制在6.9-7.1cm(仅需要控制厚度即可，长宽的尺寸对于最终结果并没有影响)；功能菌培养液的添加量为每房进曲总质量的0.5％(即全麦粉总质量的0.5％)。步骤3：功能性架式大曲的排布将曲坯呈直线形摆制在曲架上，每个曲架放置五层曲坯(即五层架子五层曲)，每个曲架摆放32-34块曲坯，每个曲架间距5-8cm，每房曲架摆放成3排10列。步骤4：架式大曲的培养经步骤3排布好的架式大曲的培养包括以下六个阶段：卧曲收汗期、发酵期、低温培菌期、缓升期、高温增香期以及回火排潮期，得到高四甲基吡嗪含量的大曲。4a、卧曲收汗期：进曲之前在曲房内均匀地撒水使曲房内湿度≥80％，湿度有利于制曲功能微生物的富集，卧完曲后控制曲坯品温与曲房温度保持相同，卧完曲后曲坯表面不粘手，微显白色。卧曲收汗期关闭门窗，控制曲房温度≥15℃，上限为环境温度；曲房湿度≥80％。卧曲收汗期的时间为1.5-2.5天。4b、发酵期：卧曲收汗期结束后进入发酵期，发酵期为5-7天，发酵期曲坯品温的升温速度控制在4-6℃/天；当上层曲坯的品温达到43-46℃，在该温度下保持12-20小时后进行第一次翻曲。所述翻曲是指进行下层与上层曲坯、中部与外部曲坯位置的交换。在发酵期内，当曲坯表面发粘，并且曲房内微有甜酸味的时候，应进行排潮(所谓排潮即是降低曲房内的湿度)，排潮过程中控制曲房内湿度≥80％，温度下降≤5℃，以防止曲坯“干扒皮、开裂”和“感冒”等现象。4c、低温培菌期：低温培菌期的时间为6-7天，低温培菌期的温度控制在28-35℃，并且每天的温度波动范围≤3℃；在低温培菌期的第6天或第7天，曲坯品温达到35-38℃时，进行第二次翻曲。第二次翻曲结束即代表低温培菌期的结束。4d、缓升期：低温培菌期结束后进入缓升期，缓升期曲坯品温的升温速率控制在3-5℃/天，直至曲坯品温升温至46-50℃并保持1-2天，缓升期内曲房湿度控制在60-80％。当曲坯成熟度达到80-85％，曲心大潮已排出，手感松散，曲心达到鸡蛋黄大小，缓升期结束，开始拾摞子，进入高温增香期。4e、高温增香期：拾摞子时撤掉曲架，将曲坯摆放成直线型或者品字形或者直线型与品字形混合摆放，以增加曲坯之间的紧密度，有利于曲坯温度的进一步升高与维持；拾摞子的当天，10、11月份曲坯品温控制在45-50℃，3-9月份曲坯品温控制在47-52℃(其他月份温度较低，不适合制曲)，并保持72小时以上。4f、回火排潮期：高温增香期结束后，曲坯品温自然从50℃以上自然降低至室温，曲坯含水率≤15％，即得高四甲基吡嗪含量的大曲。本发明的有益效果体现在：1、本发明自行筛选得到四甲基吡嗪高产菌株地衣芽孢杆菌，该菌株在实验室优化条件下产四甲基吡嗪浓度达到800mg/kg以上。2、本发明首次将四甲基吡嗪高产菌与架式大曲培养模式相结合，通过对接种量及架子曲架式模型的优化，发现架子曲的培养模式，更有利于地衣芽孢杆菌的细胞生长，及四甲基吡嗪前体物的合成。3、本发明首次构建了功能性大曲架式中温培养控制模式，明确的几阶段的培养温度，为实现最优的大曲菌系、酶系、风味物质系统奠定了基础。通过28d中温(﹤50℃)制曲，最终大曲中四甲基吡嗪含量提高到400mg/kg以上。本发明将现代生物技术与传统大曲生产技术相结合，将具有独立知识产权的地衣芽孢杆菌应用到优化后的架式中温大曲制造工艺中，生产具有高温曲风格的富含四甲基吡嗪的大曲，为进一步提高白酒健康活性物质，也为大曲生产的机械化、自动化、智能化奠定了基础，对实现传统产业的改造升级及生态制造都有深远的社会和经济意义。附图说明图1是地衣芽孢杆菌gjbl055菌株在不同温度下的生长情况。由图1可以看出本发明地衣芽孢杆菌gjbl055菌株在55℃时仍能正常生长，温度到达60℃时，菌体已不能正常生长，所以发酵期温度不能高于55℃。具体实施方式实施例1：地衣芽孢杆菌功能菌培养液的制备用接种环挑取1-2环保存于斜面的地衣芽孢杆菌gjbl055菌株于300-400ml液体培养基中，37℃下120rpm摇床培养24h，获得一级种子液；将一级种子液按10％的接种量接种于发酵罐中，37℃下80rpm培养24h，获得二级种子液；再将二级种子液按10％的接种量接种于发酵罐中，37℃下80rpm培养24h，获得三级种子液，即为功能菌培养液；10％的接种量是指一级或二级种子液的体积占发酵罐体积的比例。所述液体培养基按质量浓度构成如下：葡萄糖1wt％，酵母浸膏1wt％(购自安琪酵母股份有限公司)，氯化钠0.5wt％，溶剂为水。实施例2：地衣芽孢杆菌功能菌培养液添加量的优化将实施例1获得的功能菌培养液以每房进曲质量0.1％、0.5％、1％的添加比例添加至贮水箱中，混匀后加入制曲物料全麦粉，混匀，按架式大曲的培养方式进行培养。表1不同添加量时，四甲基吡嗪产量功能菌液添加量出房曲中四甲基吡嗪含量ppm0.1％106.30.5％389.41％356.4由表1可知，地衣芽孢杆菌功能菌培养液添加比例为0.5％时，出房曲中四甲基吡嗪含量较高。实施例3：功能性架式大曲的排布将实施例1获得的功能菌培养液以每房进曲质量0.5％的比例添加至贮水箱中，混匀后加入制曲物料全麦粉，通过踩制使物料充分混合并控制含水率为36-37％，获得曲坯，每块曲坯的厚度控制在6.9-7.1cm；将曲坯呈直线形摆放在曲架上，每个架子摆放32-34块曲坯，每个曲架间距5-8公分，共设置三种摆放方案，分别是“五层架子六层曲”、“五层架子五层曲(底层不放置)”、“四层架子五层曲”，每房共摆放3排10列曲架。表2架式大曲不同排布时，出房曲四甲基吡嗪含量三种摆放方案出房曲中四甲基吡嗪含量ppm五层架子六层曲(普通架式大曲排布)276.3五层架子五层曲413.4四层架子五层曲306.4由表2可知，架式大曲的排布为“五层架子五层曲(底层不放置)”时，出房曲中四甲基吡嗪含量较高。实施例4：架式大曲的培养工艺的优化本发明对架式大曲培养工艺的优化主要在发酵期。根据本发明用菌株地衣芽孢杆菌在不同温度下的生长特性，以及在实际生产中不同的发酵期温度出房曲中的四甲基吡嗪含量，确定了最佳的发酵期温度。表3发酵期不同的控温，出房曲中四甲基吡嗪含量发酵期温度出房曲中四甲基吡嗪含量ppm40-45℃246.345-50℃423.450-60℃0.32由表3可以看出发酵期温度控制在45-50℃时，出房曲中四甲基吡嗪含量较高。而温度控制在50-60℃之间时，由于菌体不能正常生长，无法进行四甲基吡嗪的合成。表4不同发酵温度下，曲块中菌落总数。发酵期温度曲块中菌落总数(cfu/g)40-45℃2.5*10845-50℃1.55*10850-60℃4.25*103实施例5：架式大曲的培养经实施例3排布好的架式大曲(五层架子五层曲)的培养包括以下六个阶段：卧曲收汗期、发酵期、低温培菌期、缓升期、高温增香期以及回火排潮期，得到高四甲基吡嗪含量的大曲。4a、卧曲收汗期：进曲之前在曲房内均匀地撒50公斤的净水，使曲房内湿度≥80％，在敞开门窗的情况下边卧曲边晾潮，湿度有利于制曲功能微生物的富集。卧完曲后控制曲坯品温与曲房温度保持相同，但当曲房温度低于15℃时，曲坯品温要求保持在15℃以上。卧完曲后曲坯表面不粘手，微显白色。卧曲收汗期关闭门窗，控制曲房温度≥15℃，上限为环境温度；曲房湿度≥80％。卧曲收汗期可以通过在曲坯四周围草栅、上部盖芦蓆的方式保温保潮，当天气较热室温较高时，上层可不盖芦蓆。4b、发酵期：卧曲收汗期结束后进入发酵期，发酵期为5-7天，发酵期的升温速度控制在5℃/天(在发酵期的前两天(即发酵期的第1、2天)温度逐步提升至22～28℃，第三天温度逐步提升至35～38℃)，可以通过开窗以及揭开芦蓆的方式控制曲坯缓温上升，以防升温过猛或出现红皮现象；在发酵期结束的前两天，要利用门窗严格控制曲坯品温，当上层曲坯的品温达到43-46℃，在该温度下保持12-20小时后进行第一次翻曲，将下层与上层曲坯、中部与外部曲坯的位置进行交换。在发酵期内，当曲坯表面发粘，并且曲房内微有甜酸味的时候，应进行排潮，排潮过程中控制曲房内湿度≥80％，温度下降≤5℃，以防止曲坯“干扒皮、开裂”和“感冒”等现象。4c、低温培菌期：低温培菌期的时间为6-7天，低温培菌期的温度控制在28-35℃，并且每天的温度波动范围≤3℃；在低温培菌期的第6天或第7天，曲坯品温达到35-38℃时，进行第二次翻曲，将下层与上层曲坯、中部与外部曲坯的位置进行交换。4d、缓升期：低温培菌期结束后进入缓升期，缓升期曲坯品温的升温速率控制在3-5℃/天，直至曲坯品温升温至46-50℃并保持1-2天，缓升期内曲房湿度控制在60-80％，可以通过门、窗缝隙进行排潮。在控制温度缓升的过程中，要先利用门、窗和摇头，再利用草栅；当曲坯成熟度达到80-85％，曲心大潮已排出，手感松散，曲心达到鸡蛋黄大小，缓升期结束，开始拾摞子，进入高温增香期。4e、高温增香期：拾摞子时撤掉曲架，将曲坯摆放成直线型或者品字形或者直线型与品字形混合摆放，以增加曲坯之间的紧密度，有利于曲坯温度的进一步升高与维持；摆放曲坯时曲坯上下共摆放6层，下紧上松，空隙呈倒宝塔形，以利于排潮，四周多围草栅保持高温；拾摞子的当天，10、11月份曲坯品温控制在45-50℃，3-9月份曲坯品温控制在47-52℃，并保持72小时以上。4f、回火排潮期：高温增香期结束后，曲坯品温从50℃以上自然下降到室温，曲坯含水率≤15％，即得高四甲基吡嗪含量的大曲。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。当前第1页12