一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法与流程

本发明涉及一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

制浆造纸工业是国家支柱性产业之一，但传统的制浆造纸工业也是污染大户。造纸行业的污染主要是在制浆生产过程中产生，目前，传统的制浆方法主要采用化学制浆法，而化学制浆法在制浆过程中产生大量含残余木素和化学物质的废液，正是污染的罪魁祸首。因此，彻底解决制浆造纸工业的废水污染，研制开发无污染或低污染制浆造纸的技术已经迫在眉睫。

现代制浆造纸工业的发展及其出现的一系列问题，使其与生物技术特别是微生物工程的联系日趋紧密。近十几年来，人们对生物技术在制浆造纸工业中的应用进行了大量的研究，其研究内容几乎涉及了制浆造纸工业的各个方面。生物制浆，其原理是利用具有木素降解能力的微生物(主要是白腐菌类)选择性地分解植物纤维原料中的木素。但由于木素不能做为碳源支持微生物的生长而需利用半纤维素和纤维素的分解以获得能量，因此选择无纤维素酶活的菌株就显得非常重要。同时,由于利用白腐菌处理原料的周期太长，难以满足大规模生产的要求，因而有的研究者倾向于“酶法制浆”。利用降解木素酶，在常温和常压条件下可使木片中木素去除率达到75％～80％，纸浆得率高达60％，从而降低纤维原料用量和废水污染负荷，松木和杨木木片都能用于生物制浆，尤其是阔叶材中木素通常易于被酶降解。但由于目前酶的价格昂贵，加上处理时间又长，要利用酶工程的纯生物制浆，尚难以短期内在工业生产上应用。

地衣芽孢杆菌在自然界中分布广泛，较其它木质纤维素降解微生物具有繁殖快、适应性好、木质纤维素降解能力强等特点，在天然木质纤维素降解过程中也发挥重要的作用，但由于天然地衣芽孢杆菌具有较强的纤维素降解能力，因此直接应用在制浆过程中会损伤纤维素组分，降低纤维素回收率，地衣芽孢杆菌基因组中含有十种纤维素降解相关酶，完全敲除该菌纤维素酶基因难以操作，同时考虑到不同酶系之间存在协同降解作用，纤维素酶活性完全丧失会明显抑制该菌对半纤维素和木质素的降解效果。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法。

本发明技术方案如下：

一种低产纤维素酶地衣芽孢杆菌，将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中的编码内切纤维素酶基因celB失活后获得；

所述celB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述编码内切纤维素酶基因celB失活为通过基因敲除、基因增补、基因替换或基因突变引起编码内切纤维素酶基因celB的启动子、终止子或编码区的变化导致编码内切纤维素酶基因celB无法表达。

上述低产纤维素酶地衣芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)提取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)20085菌体的DNA，以DNA为模板，使用引物F₁和R₁进行PCR扩增，得到用于celB基因敲除的同源臂celB1；

所述的PCR引物序列如下：

F1:CGGGATCCCGCTTCTAAAACACCCGTTG

R1:AAGGCCAGCAAAAGTACATGACATTGCCGTCT

(2)提取穿梭质粒PHT01的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到Cm^r片段；

所述的PCR引物序列如下：

F₂:ATGTCATGTACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA

R₂:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT

(3)将步骤(i)制得的celB1片段与步骤(ii)制得的Cm^r片段进行重叠PCR，制得celB1-Cm^r片段；

(4)将敲除载体用限制性内切酶BamH I酶切，并利用电转化仪转化至地衣芽孢杆菌感受态细胞，经复苏后，涂在含氯霉素的培养基上，在35～38℃培养1～2天，筛选具有氯霉素抗性的转化子，制得低产纤维素酶地衣芽孢杆菌。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 20085。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增体系如下：

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下：

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，重叠PCR的初次扩增体系为：

所述的重叠PCR的补充扩增体系为：

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，地衣芽孢杆菌感受态细胞的制备方法如下：

挑取新鲜的Bacillus licheniformis 20085单菌落，培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.7～0.9，置于冰上冷却，冷却后离心，然后用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体后分装至预冷的无菌的EP管，制得Bacillus licheniformis 20085电感受态细胞。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，含氯霉素的培养基为含有氯霉素浓度为20～30μmol/mL的L B固体培养基。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，电转化的条件为电压1500～2000V，电击时间4～5ms。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，复苏为在35～38℃条件下于液体复苏培养基中培养3～4h，所述液体复苏培养基每升组分如下：

蛋白胨8～10g，酵母浸粉3～5g，氯化钠8～10g，山梨醇85～100g，甘露醇60～800g，蒸馏水定容至1000mL。

有益效果

1、本发明构建的低产纤维素酶地衣芽孢杆菌菌株，既克服了纤维素酶过高表达引起纸浆纤维的破坏，同时一定程度低产的纤维素酶能够保障半纤维素酶和木质素酶纸浆处理效果的发挥，具有广泛的应用前景；

2、本发明首次在菌株构建过程中选择性从十种纤维素酶中敲除编码内切纤维素酶基因celB，取得了通过传统发酵条件优化预料不到的技术效果——纤维素酶活性及纤维素水解能力显著下降，仅为原菌株的1/10左右，但半纤维素和木质素水解能力保留85％以上。

附图说明

图1为本发明的celB基因敲除转化子的琼脂糖凝胶电泳图；

图中泳道M为DNA分子量标记(DNA marker)，泳道1-4为转化子条带，大小为1834bp。

图2为本发明构建的低产纤维素酶地衣芽孢杆菌菌株发酵能力的傅里叶红外光谱分析图；

图中，830cm^-1芳香核C-H、1235cm^-1愈创木酚与C＝O伸缩振动、1593cm^-1C-O伸缩振动、是木质素的特征吸收峰；2916cm^-1木聚糖的C-H不对称伸缩振动，是半纤维素的特征吸收峰；3400cm^-1为纤维素的特征吸收峰。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)20085保藏于中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；编号为CICC20085；

穿梭质粒PHT01购自杭州宝赛生物科技有限公司；

L B固体培养基，每升组分如下：

蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0～7.4。

L B培养基，每升组分如下：

蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0～7.4。

实施例1：基因敲除片段构建

1)(i)提取Bacillus licheniformis 20085DNA(采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒)，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到同源臂celB1；

所述的PCR引物序列如下：

F1:CGGGATCCCGCTTCTAAAACACCCGTTG

R1:AAGGCCAGCAAAAGTACATGACATTGCCGTCT

所述的PCR扩增体系为：

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为589bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

(ii)提取穿梭质粒PHT01的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到Cm^r片段；

所述的PCR引物序列如下:

F₂:ATGTCATGTACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA

R₂:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT

所述的PCR扩增体系为：

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为1245bp,使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

(iii)将步骤(i)制得的celB1片段与步骤(ii)制得的Cm^r片段进行重叠PCR，制得celB1-Cm^r片段；

所述的重叠PCR的扩增体系为：

所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为1823bp,使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

实施例2：制备地衣芽孢杆菌感受态

(i)挑取新鲜LB固体培养基表面的Bacillus licheniformis 20085单菌落，接种于10mL GM培养基中，37℃、220r/min，过夜培养；

(ii)取1mL上述菌液转接到100mLGM培养基，37℃、220r/min培养至OD₆₀₀＝0.9；

(iii)将菌液转移至100mL离心管，冰浴15-20min，使菌体停止生长；

(iv)冰浴后4℃、5000g、5min离心，收集菌体；

(v)离心后的菌体用预冷的电转缓冲液(ETM)洗涤2-3次；

(vi)洗涤结束后，使用1000μL电转缓冲液重悬菌体；

(vii)将制备好的感受态细胞分装100μL每管，-80℃保存，备用。

其中，GM培养基：LB培养基+0.5M山梨醇

ETM：0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10％甘油

RM培养基：LB培养基+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇

实施例3：celB1-Cm^r片段电转化Bacillus licheniformis 20085

(i)将celB1-Cm^r片段用限制性内切酶BamH I消化；

酶切体系(40μL)如下：

(ii)浓缩纯化酶切产物

(1)加入1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃冰箱20min；

(2)12000r/min，离心5min得沉淀；

(3)300μL体积百分比浓度为75％的乙醇溶液重悬沉淀；

(4)12000r/min，离心5min，除去乙醇，37℃风干30min；

(5)加入15～18μL ddH₂O重悬DNA，并置于-20℃保存。

(iii)电转化

首先利用核酸超微量分光光度计测定celB1-Cm^r片段浓度，达到349.63ng/μL浓度后进行电转化，电转化条件为电压1800V，电击时间5ms，将得到的细胞经液体复苏培养基在37℃复苏培养4h，取100μL涂布在含浓度25μmol/mL氯霉素的LB固体培养基上，在37℃培养1～2天，筛选具有氯霉素抗性的转化子；

所述液体复苏培养基每升组分如下：

蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，山梨醇91g，甘露醇69g，蒸馏水定容至1000mL。

实施例4：阳性重组菌的培养及鉴定

挑取上述阳性重组菌落，接种到含氯霉素抗性的液体LB培养基中37℃培养过夜，培养完成后，使用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取重组菌DNA，并以获得的基因组为模板，F₁和R₂为引物进行PCR扩增，扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行验证；

所述的PCR引物序列如下:

F₁:CGGGATCCCGCTTCTAAAACACCCGTTG

R₂:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT

其中，下划线标识的为酶切位点

所述的PCR扩增体系为20μl：

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存，琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物。

实施例5：低产纤维素酶Bacillus licheniformis工程菌在竹粉制浆预处理过程的应用

(1)菌种在35℃的条件下于活化培养基中活化培养3.5h，然后按体积百分比为1％的比例接种低产纤维素酶地衣芽孢杆菌于装液量为30mL三角瓶，其中抗生素浓度为35mg/mL，培养条件为35℃、220rpm、12h，得到含低产纤维素酶地衣芽孢杆菌的菌液；

活化培养基配方为(g/L)：蛋白胨10、酵母浸粉5、氯化钠10，蒸馏水定容，pH7.0～7.4；121℃灭菌20min；

(2)将(1)中得到低产纤维素酶工程菌的菌液按接种量3％接种于100mL含有抗生素浓度为35mg/mL的发酵培养基中，在37℃、220rpm的条件下于摇瓶发酵培养基中摇瓶发酵4d，得到发酵液；

摇瓶发酵培养基为(g/L)：蛋白胨4、硫酸铵4、磷酸二氢钾1、七水合硫酸镁0.4、氯化钠5，蒸馏水定容；121℃灭菌20min；

(3)发酵液酶活测定

发酵24h、48h、72h、96h时取样，15000g、4℃离心10min，小心吸取上清液于预冷的EP管中，即得发酵粗酶液。

采用DNS法以羧甲基纤维素(CMC)为底物测定酶活的具体方法为：

取750μL粗酶液和750μL的CMC溶液在15mL试管中混合均匀后，于30℃反应60min；之后立刻加入3mL的DNS试剂，并将试管置于沸水浴中煮沸5min，煮沸步骤在使DNS和底物结合显色的同时，也能使酶蛋白失活，终止酶反应。之后将试管冰水混合物中冰浴，待其冷却后从反应体系中取200μL反应液，稀释于2.5mL去离子水中，并测量其OD₅₄₀nm的值。

实验中，以葡萄糖为标准溶液，以每分钟生成1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。得到结果低产纤维素酶工程菌发酵液中内切纤维素酶活较原始菌株Bacillus licheniformis 20085降低了1.36U/mL。

发酵后竹粉残渣利用傅里叶红外光谱技术检测低产纤维素酶Bacillus licheniformis工程菌的能力。其中，830cm^-1芳香核C-H、1235cm^-1愈创木酚与C＝O伸缩振动、1593cm^-1C-O伸缩振动、是木质素的特征吸收峰；2916cm^-1木聚糖的C-H不对称伸缩振动，是半纤维素的特征吸收峰；3400cm^-1为纤维素的特征吸收峰。由图2看出：低产纤维素酶Bacillus licheniformis工程菌纤维素水解能力显著下降，而半纤维素和木质素水解能力保留85％以上。