一种用于检测结合珠蛋白分型的方法与流程

本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种检测结合珠蛋白分型的方法。

背景技术：

目前糖尿病患者人群日益增大，也逐渐趋于年轻化，这些患者有很高的并发心血管疾病的风险，粗略统计约有75％的糖尿病患者死于心血管疾病。为了减轻患者高糖血症的症状，减少微血管和大血管并发症的发生，使患者能够过上正常的生活，采用合适的药物预防心血管并发症尤为重要。由于糖尿病患者并发心血管疾病与体内氧化应激有一定的相关性，因此美国心脏病学会以及国际卫生组织(who)均推荐使用维生素e等抗氧化剂来预防糖尿病患者心血管并发症。

临床发现，不同的糖尿病患者对于维生素e补充所带来的效果差异非常大。有的患者补充维生素e可以明显降低心血管疾病风险；而有些患者却相反，补充维生素e后反而会增加并发心血管疾病的风险，严重时甚至会导致死亡事件。

大量科学研究发现，结合珠蛋白的基因型与糖尿病患者并发心脏病的风险密切相关。其中，携带hp2-2基因型的糖尿病患者罹患心脏病并发症、中风甚至死亡的风险更高，约为携带hp1-1基因型的糖尿病患者的5倍；而携带hp2-1基因型的糖尿病患者的心脏病并发风险介于两者之间。而从补充维生素e后的治疗效果看，对于携带有结合珠蛋白hp2-2基因型的糖尿病患者，经过18个月维生素e治疗后，心脏病和中风发作的几率比未服用维生素e的同类患者少50％，且未出现副作用。而对hp2-1或hp1-1基因型的糖尿病患者，补充维生素e则会反而提高其并发心血管疾病的风险。

结合珠蛋白(haptoglobin，hp)又称触珠蛋白，是血清α2-球蛋白组分中的一种糖蛋白类，是一种能稳定红血球血红蛋白的抗氧化蛋白，可以保护血管壁避免发生炎症。人类结合珠蛋白的基因位于染色体16q22.1，人群中常见的hp有三种基因型，分别是hp1-1，hp2-1和hp2-2，受控于hp座位上的一对等位基因hp1和hp2，呈共显性遗传。不同地区和人种的hp1和hp2基因频率各不相同，西方人群的统计数据显示，hp1-1基因型的概率为16％，hp2-2基因型的概率为36％，而hp2-1基因型的概率则为48％。亚洲人以hp2-2居多，其次为hp2－1，而hp1－1最少，我国汉族人种hp1基因型频率较低，多以hp2为主。

综上所述，携带有结合珠蛋白hp2-2基因型的糖尿病患者并发心血管疾病甚至死亡风险更高，服用维生素e可以降低其风险；携带hp2-1或hp1-1基因型的糖尿病患者虽然并发心血管疾病风险较低，但服用维生素e后其并发风险反而会提高。因此，为了更好地分析判断糖尿病患者心血管疾病的并发风险，合理地进行早期干预，并在临床上给予更可靠准确的用药指导，针对糖尿病患者人群进行结合珠蛋白的基因分型非常必要。

目前检测结合珠蛋白分型的方法多是电泳法，电泳前先使待测样品与血红蛋白形成hp－hb(结合珠蛋白-血红蛋白)复合物。电泳完后可以利用血红蛋白的过氧化物酶活性在过氧化氢存在时使联苯胺氧化成联苯胺蓝，染色普通型可采用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分型。hp亚型则需先纯化样品中的hp，再使hp组分中的α肽链变性，还原后方能采用普通电泳或等电聚焦技术进行分型，操作过于复杂。因hp在血痕中可以保存相当长的时间，在实践中可通过检测血痕中的hp进行分型鉴定，但由于血痕中过多的血红蛋白可掩盖hp泳谱，因而在一定程度上限制了血痕的个体识别能力。

故有待提供一种操作简便快速、准确，又可应用于临床实践的检测结合珠蛋白分型的方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种用于检测结合珠蛋白分型的方法，以至少解决现有技术中检测结合珠蛋白分型方法复杂、准确率低的技术问题。

本发明提供了一种用于检测结合珠蛋白分型的方法，上述方法通过设计特定引物，对包含上述结合珠蛋白基因的待测样本进行基因扩增得扩增产物，通过对上述扩增产物进行电泳检测即可确定上述待测样本的上述结合珠蛋白的基因型,上述特定引物为：

正向(f):5’-ataatacagttcgcgagcttct-3’；

反向(r):5’-gggcaagatactcaacctgtc-3’。

可选的，上述基因扩增，即聚合酶链反应(pcr)使用的缓冲液的混合溶液的成分包括：

三羟甲基氨基甲烷(tris-hcl)，终浓度为8mmol/l-12mmol/l，ph

为8.0-8.7；

氯化钾(kcl)，终浓度为40mmol/l-60mmol/l；

氯化镁(mgcl2)，终浓度为：1mmol/l-2mmol/l；

taq酶，终浓度为0.5u-2.5u；

脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)，终浓度为100umol/l-250umol/l。

可选的，上述基因扩增，即聚合酶链反应(pcr)使用的缓冲液的混合溶液的成分包括：

三羟甲基氨基甲烷(tris-hcl)，终浓度为10mmol/l，ph为8.3；

氯化钾(kcl)，终浓度为50mmol/l；

氯化镁(mgcl2)，终浓度为：1.5mmol/l；

taq酶，终浓度为2u；

脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)，终浓度为200umol/l。

可选的，上述基因扩增，即聚合酶链反应(pcr)使用的缓冲液的混合溶液的成分包括：

三羟甲基氨基甲烷(tris-hcl)，终浓度为8mmol/l，ph为8.0；

氯化钾(kcl)，终浓度为60mmol/l；

氯化镁(mgcl2)，终浓度为：1.0mmol/l；

taq酶，终浓度为2.5u；

脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)，终浓度为110umol/l。

可选的，上述基因扩增，即聚合酶链反应(pcr)使用的缓冲液的混合溶液的成分包括：

三羟甲基氨基甲烷(tris-hcl)，终浓度为12mmol/l，ph为8.6；

氯化钾(kcl)，终浓度为40mmol/l；

氯化镁(mgcl2)，终浓度为：1.8mmol/l；

taq酶，终浓度为0.8u；

脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)，终浓度为250umol/l。

可选的，上述基因扩增，即聚合酶链反应(pcr)包括如下步骤：在90℃至100℃的温度下预变性3-5分钟；在90℃至100℃的温度下变性30秒至50秒，在55℃至65℃的温度下退火20秒至40秒，在70℃至74℃的温度下延伸40秒至90秒，其中上述变性步骤、上述退火步骤以及上述延伸步骤为25至40个循环；然后在70℃至74℃的温度下终延伸3至10分钟；最后保持温度为3℃至10℃。

可选的，上述基因扩增，即聚合酶链反应(pcr)包括如下步骤：在95℃的温度下预变性4分钟；在95℃的温度下变性40秒，在60℃的温度下退火30秒，在72℃的温度下延伸80秒，其中上述变性步骤、上述退火步骤以及上述延伸步骤为30个循环；然后在72℃的温度下终延伸3分钟；最后保持温度为4℃。

可选的，上述基因扩增，即聚合酶链反应(pcr)包括如下步骤：在98℃的温度下预变性5分钟；在98℃的温度下变性35秒，在63℃的温度下退火22秒，在70℃的温度下延伸60秒，其中上述变性步骤、上述退火步骤以及上述延伸步骤为38个循环；然后在70℃的温度下终延伸8分钟；最后保持温度为3℃。

可选的，上述基因扩增，即聚合酶链反应(pcr)包括如下步骤：在92℃的温度下预变性3分钟；在92℃的温度下变性48秒，在55℃的温度下退火40秒，在74℃的温度下延伸45秒，其中上述变性步骤、上述退火步骤以及上述延伸步骤为26个循环；然后在70℃的温度下终延伸10分钟；最后保持温度为8℃。

上述方法用于检测确定结合珠蛋白的分型为hp1亚型或hp2亚型。

本发明申请建立了一种从基因角度对hp进行分析的方法，该方法通过设计特定引物进行基因扩增，通过对扩增产物电泳检测即可确定hp的基因型，该方法操作简便快速、准确。可应用于临床实践。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的一种电泳后琼脂糖凝胶成像图；

图2为本发明实施例2提供的一种电泳后琼脂糖凝胶成像图；

图3为本发明实施例3提供的一种电泳后琼脂糖凝胶成像图。

图4为本发明实施例4提供的一种电泳后琼脂糖凝胶成像图。

下面具体实施方式用于进一步说明但不限于本发明，下面实施例仅为本发明一种优选地实施方式。

具体实施方式

下述实施例中的待测样本为同一个体的唾液和外周血样本，对照样本为临床已明确鉴定hp基因型样本。

以下所用taq来自takara，琼脂糖为sunshinebio，引物合成及其余试剂均购自生工生物；pcr仪和核酸电泳仪品牌为bio-rad。

实施例1：

步骤一：唾液样本采集与处理

采样前30分钟漱口以除去食物残渣及残留微生物，漱口之后30分钟内不要进食、饮水、刷牙、吸烟或嚼口香糖；放松脸颊，并轻轻揉搓15-30秒以产生唾液，收集2ml唾液到无菌的采集器中。

步骤二：唾液样本dna(脱氧核糖核酸)提取

(1)取500ul(微升)唾液样本，加入1ml(毫升)缓冲液(100mmol/l(毫摩尔/升)tris-hcl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)，ph8.0,0.5％sds(十二烷基磺酸钠),10mmol/ledta(乙二胺四乙酸))和6ul20mg/ul(毫克/微升)的蛋白酶k，涡旋仪上震荡混匀；

(2)将步骤(1)处理后的唾液进行55℃水浴处理20min；

(3)加入600ul苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，10000rpm(转/分钟)离心5min，取上清；

(4)向步骤(3)的上清液中加入600ul的氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀后10000rpm离心5min，取上清；

(5)向步骤(4)的上清液体中加入等体积的异丙醇，轻轻混匀后14000rpm离心10min，弃上清；

(6)用500ul70％乙醇洗涤上述沉淀一次，14000rpm离心10min，弃上清；

(7)室温晾干dna，用20ul灭菌水溶解。

步骤三：基因pcr(聚合酶链反应)扩增及产物鉴定

(1)pcr扩增：

使用2xmix缓冲液，其成分为包含tris-hcl(终浓度：10mmol/l)，ph为8.3，氯化钾(终浓度：50mmol/l)，氯化镁(终浓度1.5mmol/l)，taq酶(终浓度：2u)，dntp(终浓度：200umol/l)的混合溶液，唾液样本提取得到的dna作为模板进行pcr扩增。

扩增引物如下：

f:5’-ataatacagttcgcgagcttct-3’；

r:5’-gggcaagatactcaacctgtc-3’。

pcr反应程序如下：

95℃4min；95℃40s，60℃30s，72℃80s，30个循环；72℃3min；4℃∝。

即在95℃的温度下预变性4分钟；在95℃的温度下变性40秒，在60℃的温度下退火30秒，在72℃的温度下延伸80秒，其中所述变性步骤、所述退火步骤以及所述延伸步骤为30个循环；然后在72℃的温度下终延伸3分钟；最后保持温度为4℃。

(2)琼脂糖凝胶电泳检测

结果见图1，图1为本发明实施例1提供的一种电泳后琼脂糖凝胶成像图；

其中泳道2～4分别为已知hp基因型的阳性对照样本，泳道5为待测样本；其中泳道2为hp2-2亚型，泳道3为hp2-1亚型，泳道4为hp1-1亚型。其中泳道1为dnamarker(dna标记)(其条带从下到上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1kb、1.5kb、2kb、3kb、5kb)。

步骤四：确定hp的基因型

根据电泳结果确定hp的基因型，理论上hp1-1基因型无条带，hp2-1基因型条带为698bp，hp2-2基因型条带为698bp。可知，本实施例待测样本的hp的基因型为hp2基因型。

本实施例提供的引物所建立的检测结合珠蛋白分型的方法能够较好的区分hp1亚型与hp2亚型，因hp1-1无条带导致hp2-1中的本应存在的两条带中只呈现出1条，所以hp2-1与hp2-2从电泳图中不能鉴定，但本实施例所提供的引物所建立的检测结合珠蛋白分型的方法能较好区分hp1亚型与hp2亚型，而且操作极其简单，检测结果准确，这对于只需要区分出hp1亚型基因型的糖尿病患者而言，就判定不能补充维生素e了，否则会反而提高其并发心血管疾病的风险，所以仅能区分hp1亚型与hp2亚型的引物也具有临床价值。

实施例2：

步骤一：外周血样本处理与dna提取

(1)取含edta抗凝剂的外周血2ml，置于10ml灭菌的离心管中，加入6ml0.1mmedta，处理15分钟以破碎红细胞，3000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀；

(2)向沉淀中加入1ml0.1mmedta，混匀后转移至2ml灭菌的离心管中，5400rpm离心5min，弃上清；

(3)向沉淀中加入1ml缓冲液(100mmol/ltris-hcl，ph8.0,0.5％sds,10mmol/ledta)和6ul20mg/ul的蛋白酶k，涡旋仪上震荡混匀后55℃水浴处理20min；

(4)加入600ul苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，10000rpm离心5min，取上清；

(5)向步骤(4)的上清液中加入600ul的氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀后10000rpm离心5min，取上清；

(6)向步骤(5)的上清液体中加入等体积的异丙醇，轻轻混匀后14000rpm离心10min，弃上清；

(7)用500ul70％乙醇洗涤上述沉淀一次，14000rpm离心10min，弃上清；

(8)室温晾干dna，用30ul灭菌水溶解。

步骤二：基因pcr(聚合酶链反应)扩增及产物鉴定

(1)pcr扩增：

使用10xmix缓冲液，其成分为包含tris-hcl(终浓度：8mmol/l)，ph为8.0，氯化钾(终浓度：60mmol/l)，氯化镁(终浓度1.0mmol/l)，taq酶(终浓度：2.5u)，dntp(终浓度：110umol/l)的混合溶液，唾液样本提取得到的dna作为模板进行pcr扩增。

扩增引物如下：

f:5’-ataatacagttcgcgagcttct-3’；

r:5’-gggcaagatactcaacctgtc-3’。

pcr反应程序如下：

98℃5min；98℃35s，63℃22s，70℃60s，38个循环；70℃8min；3℃∝。

即在98℃的温度下预变性5分钟；在98℃的温度下变性35秒，在63℃的温度下退火22秒，在70℃的温度下延伸60秒，其中所述变性步骤、所述退火步骤以及所述延伸步骤为38个循环；然后在70℃的温度下终延伸8分钟；最后保持温度为3℃。

(2)琼脂糖凝胶电泳检测

结果见图2。图2为本发明实施例2提供的一种电泳后琼脂糖凝胶成像图；

其中泳道1为待测样本，泳道2和3为对照样本，泳道2为hp2-1亚型，泳道3为hp1-1亚型，泳道4为dnamarker(其条带从下到上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1kb、1.5kb)。

步骤三：确定hp的基因型

根据电泳结果确定hp的基因型，理论上hp1-1亚型无条带，hp2-1基因型条带为698bp，hp2-2基因型条带为698bp。可知，本实施例待测样本的hp的基因型为hp2基因型。

本实施例提供的引物所建立的检测结合珠蛋白分型的方法能够较好的区分hp1亚型与hp2亚型，因hp1-1无条带导致hp2-1中的本应存在的两条带中只呈现出1条，所以hp2-1与hp2-2从电泳图中不能鉴定，但本实施例所提供的引物所建立的检测结合珠蛋白分型的方法能较好区分hp1亚型与hp2亚型，而且操作极其简单，检测结果准确，这对于只需要区分出hp1亚型基因型的糖尿病患者而言，就判定不能补充维生素e了，否则会反而提高其并发心血管疾病的风险，所以仅能区分hp1亚型与hp2亚型的引物也具有临床价值。

实施例3：

步骤一：同实施例2步骤一。

步骤二：基因pcr(聚合酶链反应)扩增及产物鉴定

(1)pcr扩增：

使用10xmix缓冲液，其成分为包含tris-hcl(终浓度：12mmol/l)，ph为8.6，氯化钾(终浓度：40mmol/l)，氯化镁(终浓度1.8mmol/l)，taq酶(终浓度：0.8u)，dntp(终浓度：250umol/l)的混合溶液，唾液样本提取得到的dna作为模板进行pcr扩增。扩增引物如下：

f:5’-ataatacagttcgcgagcttct-3’；

r:5’-gggcaagatactcaacctgtc-3’。

pcr反应程序如下：

92℃3min；92℃48s，55℃40s，74℃45s，26个循环；70℃10min；8℃∝。

即在92℃的温度下预变性3分钟；在92℃的温度下变性48秒，在55℃的温度下退火40秒，在74℃的温度下延伸45秒，其中所述变性步骤、所述退火步骤以及所述延伸步骤为26个循环；然后在70℃的温度下终延伸10分钟；最后保持温度为8℃。

(2)琼脂糖凝胶电泳检测

结果见图3。图3为本发明实施例3提供的一种电泳后琼脂糖凝胶成像图；

其中泳道2为待测样本，泳道3为hp2-2亚型对照样本，泳道1为dnamarker(dna标记)(其条带从下到上依次为500bp、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb)。

步骤三：确定hp的基因型

根据电泳结果确定hp的基因型，理论上hp1-1基因型无条带，hp2-1基因型条带为698bp，hp2-2基因型条带为698bp。可知，本实施例待测样本的hp的基因型为hp2基因型。

本实施例提供的引物所建立的检测结合珠蛋白分型的方法能够较好的区分hp1亚型与hp2亚型，因hp1-1无条带导致hp2-1中的本应存在的两条带中只呈现出1条，所以hp2-1与hp2-2从电泳图中不能鉴定，但本实施例所提供的引物所建立的检测结合珠蛋白分型的方法能较好区分hp1亚型与hp2亚型，而且操作极其简单，检测结果准确，这对于只需要区分出hp1亚型基因型的糖尿病患者而言，就判定不能补充维生素e了，否则会反而提高其并发心血管疾病的风险，所以仅能区分hp1亚型与hp2亚型的引物也具有临床价值。

实施例4(对比试验)：

步骤一：同实施例2步骤一。

步骤二：基因pcr(聚合酶链反应)扩增及产物鉴定

(1)pcr扩增：

使用10xmix缓冲液，其成分为包含tris-hcl(终浓度：12mmol/l)，ph为8.6，氯化钾(终浓度：40mmol/l)，氯化镁(终浓度1.8mmol/l)，taq酶(终浓度：0.8u)，dntp(终浓度：250umol/l)的混合溶液，唾液样本提取得到的dna作为模板进行pcr扩增。扩增引物如下：

f:5’-tgcagtggactcaggcaat-3’；

r:5’-tgtcatctgcaaagagagagaag-3’。

pcr反应程序如下：

94℃4min；94℃40s，55℃40s，72℃60s，30个循环；72℃5min；4℃∝。

即在94℃的温度下预变性4分钟；在94℃的温度下变性40秒，在55℃的温度下退火40秒，在72℃的温度下延伸60秒，其中所述变性步骤、所述退火步骤以及所述延伸步骤为30个循环；然后在72℃的温度下终延伸5分钟；最后保持温度为4℃。

(2)琼脂糖凝胶电泳检测

结果见图4。图4为本发明实施例4提供的一种电泳后琼脂糖凝胶成像图；

其中泳道2～4为对照样本，泳道2为hp2-2亚型对照样本，泳道3为hp2-1亚型对照样本，泳道4为hp1-1亚型对照样本，泳道1为dnamarker(其条带从下到上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1kb、1.5kb、2kb、3kb、5kb)。

步骤三：确定hp的基因型

根据电泳结果确定hp的基因型，由图中电泳结果可知hp1-1、hp2-1、hp2-2三种基因型的条带大小均为330bp，由此可见依照本实施例中提供的引物所建立的pcr方法不能区分结合珠蛋白的基因型。

综上，从图1、图2和图3结果可以看出，本发明申请所提供引物能够较好的区分hp1亚型与hp2亚型，因hp1-1无条带导致hp2-1中的本应存在的两条带中只呈现出1条，所以hp2-1与hp2-2从电泳图中不能鉴定。而实施例4提供的引物所建立的pcr方法不能区分结合珠蛋白的基因型，而本发明申请所提供的引物所建立的pcr方法能较好区分hp1亚型与hp2亚型，而且操作极其简单，检测结果准确，这对于只需要区分出hp1亚型基因型的糖尿病患者而言，就判定不能补充维生素e了，否则会反而提高其并发心血管疾病的风险，所以仅能区分hp1亚型与hp2亚型的引物所建立的检测方法也具有临床价值。

本发明实施例1-3建立的一种从基因角度对hp进行分析的方法，上述方法通过设计特定引物进行基因扩增，通过对扩增产物电泳检测即可确定hp的基因型，该方法操作简便快速、准确，可应用于临床实践。