本发明属于多肽药物领域，具体涉及一种特立帕肽的制备方法。
背景技术：
特立帕肽(casno：52232-67-4)是一种由美国礼来公司开发的一种合成的多肽激素，主要用于治疗原发性及性腺功能减退性骨质疏松症、绝经后骨质疏松症。特立帕肽的分子式为c181h291n55o51s2，其对应的分子量为4117.75，特立帕肽由34个天然氨基酸组成，其肽序为：h-ser-val-ser-glu-ile-gln-leu-met-his-asn-leu-gly-lys-his-leu-asn-ser-met-glu-arg-val-glu-trp-leu-arg-lys-lys-leu-gln-asp-val-his-asn-phe-oh。礼来公司是采用基因表达得到特立帕肽，例如专利us6590081，然而，基因表达法有着技术门槛，工作复杂，三废严重等缺陷。中国专利cn102731643a公开了以ctcresin为固相载体分为5个片段进行偶联，虽然该方法可以缩短合成周期，但是其总收率仅为32.2％。当下比较流行的合成方法为固相逐步合成法，该方法具有操作简单和设备要求低的优点，但是该方法也因为总收率较低而限制了特立帕肽的生产效率。如专利cn103467595a，其在逐步合成偶联到17位丝氨酸时，以未保护的丝氨酸和16位天冬酰胺羧基进行酯缩合，在获得粗肽后再将酯键转化为酰胺键，其总收率最高为42.1％。专利cn104017064a也公开了一种逐步合成方法，其在合成16-17位氨基酸时采用假脯氨酸二肽，并以特定的裂解液裂解，其总收率最高为38％。专利cn104530218a公开了一种逐步合成方法，以ctcresin或wangresin树脂为固相载体合成，其总收率为34.72％。
l-his易消旋成d-his，因此，导致消旋杂质生成，即：d-his32-特立帕肽。
d-his32-特立帕肽的结构如下：h-ser-val-ser-glu-ile-gln-leu-met-his-asn-leu-gly-lys-his-leu-asn-ser-met-glu-arg-val-glu-trp-leu-arg-lys-lys-leu-gln-asp-val-d-his-asn-phe-oh。该杂质的存在严重影响特立帕肽的含量以及使用安全。因此需要找到有效的方法将其去除并使其达到优质标准级别0.1％以下。现有的合成方法，制备特立帕肽发现现有技术存在的技术问题是：合成纯度偏低、成本高，特别是杂质d-his32-特立帕肽含量较大，不适合规模化生产的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种收率高、杂质d-his32-特立帕肽含量小的特立帕肽的制备方法。
一种特立帕肽的固相合成方法，其特征在于：
所述特立帕肽的氨基酸序列为：
h-ser-val-ser-glu-ile-gln-leu-met-his-asn-leu-gly-lys-his-leu-asn-ser-met-glu-arg-val-glu-trp-leu-arg-lys-lys-leu-gln-asp-val-l-his-asn-phe-oh；其编号如下：
包括如下步骤：
(1)在活化剂的存在下，树脂固相载体和fmoc-phe-oh偶联反应，得到fmoc-phe-树脂；
(2)通过固相合成法，在缩合剂存下在，按特立帕肽主链肽序依次偶联具有n端fmoc保护的氨基酸得到全肽树脂，且每偶联上一个具有n端fmoc保护的氨基酸后，采用脱保护剂脱除fmoc基团，再偶联下一个具有n端fmoc保护的氨基酸；
其中，在连接第32号氨基酸(即第2个组氨酸his)时，氨基酸缩合的缩合剂为comu，其余的缩合剂为dic/cl-hobt、tbtu/hobt/diea、tbtu/cl-hobt/diea组合中的一种或多种；
所述的脱保护剂为哌啶/cl-hobt的dmf溶液或者哌啶的dmf溶液；
(3)采用含有phsme/phoh/edt体系的裂解液裂解2小时，将肽链从肽树脂上脱下，经过初步纯化、精制即得特立帕肽。
进一步地，所述步骤(2)包括如下步骤：
a.将fmoc-phe-树脂在脱保护剂中反应30min，脱除fmoc基团，得到h-phe-树脂；
b.在缩合剂存在下，h-phe-树脂与fmoc-asn(trt)-oh反应2h，偶联得到fmoc-asn(trt)-phe-树脂；
c.重复a、b步骤，按照特立帕肽主链肽序依次偶联具有n端fmoc保护的氨基酸。
进一步地，步骤(1)所述的树脂固相载体为wang树脂或者2-ctc树脂。
进一步地，步骤(1)中所述的树脂固相载体是替代度为1.0～1.4mmol/g的树脂。
进一步地，步骤(1)所述的树脂固相载体为替代度为1.0～1.4mmol/g的ctcresin树脂。
进一步地，步骤(1)中所述的活化剂为diea、tea或者dbu，活化剂与fmoc-phe-oh的摩尔比范围为(4～8):1，优选为6:1。
进一步地，步骤(1)中树脂固相载体与fmoc-phe-oh的摩尔比为(1～4)：1，优选为2.8:1。
进一步地，步骤(2)中，所述缩合剂为tbtu/hobt/diea或tbtu/cl-hobt/diea，缩合剂中三种化合物的摩尔比为1:1:1。
进一步地，步骤(2)中，缩合剂中cl-hobt或hobt或comu与步骤(1)中树脂固相载体的摩尔比为(1～4):1；每个具有n端fmoc保护的氨基酸与步骤(1)中树脂固相载体的摩尔比为1：(1～4)。
进一步地，步骤(2)中所述的哌啶、cl-hobt、dmf体积比为1:1:8；所述哌啶与dmf的体积比为1:4；所述脱保护剂与树脂固相载体的体积摩尔比为100ml：(5～20)mmol，优选为100ml：7mmol。
进一步地，步骤(3)中所述的裂解液为体积比为phsme：phoh：edt：溶剂＝5:3:2:95的溶液；和/或，所述溶剂选自tfa、苯甲硫醚、苯酚、乙二硫醇、三异丙基硅烷、二甲硫醚一种或多种。
进一步地，步骤(3)中所述的纯化为采用c18反向色谱柱；和/或，所述的精制为用凝胶色谱法精制，填料为葡聚糖凝胶g-25。
本发明人研究发现，在32号氨基酸偶联使用新型偶联剂comu,并在每步脱保护液中加入cl-hobt可有效的减少d-his32-特立帕肽的生成，提高了粗肽的收率,降低了hplc纯化难度。经过hplc纯化后，杂质d-his32-特立帕肽含量降低到0.1％以下。
本发明人对特立帕肽的制备方法进行了研究，提供了一种纯度高、成本低、适合规模化生产的特立帕肽制备工艺，此工艺既有效控制了工艺杂质又明显的提高了特立帕肽的总收率。
术语解释：
fmoc：芴甲氧羰基
fmoc-aa:芴甲氧羰基保护的氨基酸
tbtu:2-(1h-苯并三偶氮l-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯
hobt:1-羟基苯并三唑
diea:n,n-二异丙基乙胺
comu:(2-肟基-氰基乙酸乙酯)-n,n-二甲基-吗啉基脲六氟磷酸酯cas:1075198-30-9
cl-hobt:6-氯-1-羟基苯并三氮唑
ac2o:乙酸酐
tbu:叔丁基
trt:三苯甲基
boc:叔丁氧羰基
pbf:2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
phe:苯丙氨酸
his:组氨酸
val:缬氨酸
asp:天冬氨酸
gln:谷氨酰胺
leu:亮氨酸
lys:赖氨酸
arg:精氨酸
trp:色氨酸
glu:谷氨酸
met:甲硫氨酸
ser:丝氨酸
gly:甘氨酸
ile:异亮氨酸
dmf:n,n-二甲基甲酰胺
meoh:甲醇
dcm:二氯甲烷
tfa:三氟乙酸
phsme:苯甲硫醚
phoh:苯酚
edt:乙二硫醇
mtbe:甲基叔丁基醚
acn:乙腈
2-ctcresin树脂：氯代(邻氯苯基)二苯基甲烷
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1特立帕肽的合成工艺路线
具体实施方式
实施例1
(1)fmoc-phe-ctcresin树脂的制备
将20g(28mmol)替代度为1.4mmol/g的ctcresin树脂加入到玻璃反应柱中，向其中加入200ml的dcm溶20min,抽干，重复3次；同时称取10mmol的fmoc-phe-oh和60mmol的diea，将这两种物质用200ml的dcm溶解，搅拌均匀后倒入玻璃反应柱中，搅拌反应1小时。其后抽除液体，用dcm进行洗涤，洗涤6次，每次用量200ml，再用dmf进行洗涤，洗涤6次，每次用量200ml；即得到fmoc-phe-ctcresin树脂45.1g，替代度为0.4mmol/g。
(2)全肽树脂的合成
向步骤1)生成的fmoc-phe-ctcresin树脂中加400ml配置好的体积浓度为20％的哌啶的dmf溶液，搅拌使其反应30min，之后抽除液体，用dmf洗涤产物6次，每次用量200ml,将洗涤液dmf抽干，其后称取10mmol的fmoc-asn(trt)-oh、10mmol的tbtu和10mmol的hobt，将这三种物质用200ml的dmf:dcm＝1:1混合溶剂溶解，溶解完全后向其中加入10mmol的diea形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，其后抽除液体，用dmf对产物洗涤6次，每次用量200ml，抽干即得到fmoc-asn(trt)-phe-ctcresin树脂，此后用脱保护剂(体积百分比浓度为1:1:8哌啶/cl-hobt/dmf溶液)脱除树脂上的fmoc保护基，分别加入10mmol的fmoc-his(trt)-oh、10mmol的comu和10mmol的diea，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时。用脱保护剂为体积百分比浓度为1:1:8哌啶/cl-hobt/dmf溶液脱除树脂上的fmoc保护基，将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂约66.2g。
(3)全肽树脂的切割
裂解液的配制:
取2000ml的圆底烧瓶，向其中加入950ml的tfa，50ml的phsme，30ml的phoh，20ml的edt，并搅拌混匀得到裂解液。
裂解：
向裂解液中加入全肽树脂66g，搅拌反应2小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用300ml的tfa洗涤，重复过滤与洗涤两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积约为原始体积的1/10左右，然后将其加入到体积为浓缩液10倍的预冷的甲基叔丁基醚中，沉降过夜并析出白色固体。缓慢倒出上清液体，并离心5次，每次用甲基叔丁基醚1000ml，得到白色固体粉末，真空干燥10小时，取出称重，即得到粗品肽50.5g(hplc纯度：61.2％，收率58.1％)。
(4)特立帕肽粗肽的初步纯化
使用反相高效液相色谱法对粗肽进行初步纯化，使用的反相高效液相色谱的组成为：极性流动相：a相：体积百分比浓度为0.1％的三氟乙酸(tfa)溶液；b相：乙腈；
色谱柱：10μm的c18反相色谱柱；
检测波长：220nm
流速：80ml/min(色谱柱放大的情况下，流速可相应的增加)
先以流动相a平衡柱子，然后取粗肽(含肽约21g)4l进样，先用流动相a冲洗20min，然后采用梯度洗脱：洗脱剂为a相与b相的混合，其中b相的体积百分比在45min内由15％上升至40％，密切观察主峰的出现，主峰出现时开始收集，主峰峰顶前、峰顶附近、峰顶后分段收集，无杂峰出现时收集结束。将峰顶出现前、峰顶出现后收集到的液体进行适当浓缩，再加入色谱柱中进行相同的流动相a冲洗与洗脱剂的梯度洗脱，同样收集三段产物，以此重复多次后合并每次收集到的峰顶附近的液体，将其适度地旋转蒸发浓缩，即制得纯化肽的溶液4551ml(含量：3.2mg/ml,hplc纯度：97.4％)，可将其冷冻暂存。
(5)特立帕肽粗肽的精制及除盐
使用凝胶色谱法对纯化肽进行精制与除盐，使用的凝胶液相色谱的流动相为：极性流动相：流动相a：水；流动相b:乙腈
色谱填料：葡聚糖凝胶g-25
检测波长：220nm
流速：80ml/min(色谱柱放大的情况下，流速可相应的增加)
先在室温下，将葡聚糖凝胶干粉分别用乙醇、无盐水、盐酸浸泡后用水洗至中性，并将溶胀好的凝胶根据装柱要求一次性置入柱内；然后取纯化肽的溶液4551ml进样，上样控制在1～4％的柱体积，脱盐时高径比为5:1；然后流动相a与流动相b等度洗脱，以时间为节点收集，对于中间时间段的产物合并收集，将其适度地旋转浓缩，即得到所述无盐形式的特立帕肽精制液800ml(含量15.3mg/ml,hplc纯度：99.3％)，可冷冻暂存。
(6)冻干、包装
取特立帕肽的精制液800ml，以0.22μm的滤膜进行过滤，将滤得的固体分装于适当容器中进行冻干，冻干粉用洁净的容器密封包装，经检测合格后入库，即制得特立帕肽成品9.2g(hplc纯度99.87％，收率45.1％，d-his32-特立帕肽含量为0.01％)
实施例2
1)取3.3g取代度为0.3mmol/gfmoc-phe-wang-resin树脂中加20ml配置好的体积浓度为20％的哌啶的dmf溶液，搅拌使其反应30min，之后抽除液体，用dmf洗涤产物6次，每次用量20ml,将洗涤液dmf抽干，其后称取1mmol的fmoc-asn(trt)-oh、1mmol的tbtu和1mmol的hobt，将这三种物质用20ml的dmf:dcm＝1:1混合溶剂溶解，溶解完全后向其中加入10mmol的diea形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，其后抽除液体，用dmf对产物洗涤6次，每次用量20ml，抽干即得到5.1gfmoc-asn(trt)-phe-wangresin树脂。
2)将上述树脂取一半，加入体积比为1:4哌啶/dmf溶液脱除树脂上的fmoc保护基，反应30min，加入1mmol的fmoc-his(trt)-oh、1mmol的comu和1mmol的diea，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时此后加入体积比为1:4哌啶/dmf溶液脱除树脂上的fmoc保护基，反应时间为30min，将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂。
3)全肽树脂加入裂解液，搅拌反应2小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用30ml的tfa洗涤，重复过滤与洗涤两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积约为原始体积的1/10左右，然后将其加入到体积为浓缩液10倍的预冷的甲基叔丁基醚中，沉降过夜并析出白色固体。缓慢倒出上清液体，并离心5次，每次用甲基叔丁基醚100ml，得到白色固体粉末，真空干燥10小时，取出称重。
实验结果：特立帕肽粗肽2.3g，hplc纯度为58.1％，粗肽纯化、除盐、冻干后分别得特立帕肽精肽0.65g,hplc纯度为99.62％，d-his32-特立帕肽含量为0.03％，总收率为38％。
实施例3
1)取3.3g取代度为0.3mmol/gfmoc-phe-wang-resin树脂中加20ml配置好的体积浓度为20％的哌啶的dmf溶液，搅拌使其反应30min，之后抽除液体，用dmf洗涤产物6次，每次用量20ml,将洗涤液dmf抽干，其后称取1mmol的fmoc-asn(trt)-oh、1mmol的tbtu和1mmol的hobt，将这三种物质用20ml的dmf:dcm＝1:1混合溶剂溶解，溶解完全后向其中加入10mmol的diea形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，其后抽除液体，用dmf对产物洗涤6次，每次用量20ml，抽干即得到5.1gfmoc-asn(trt)-phe-wang-resin树脂。
2)将上述树脂取一半，用脱保护剂为体积百分比浓度为1:1:8哌啶/cl-hobt/dmf溶液脱除树脂上的fmoc保护基，分别加入1mmol的fmoc-his(trt)-oh、1mmol的comu和1mmol的diea，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，用脱保护剂为体积百分比浓度为1:1:8哌啶/cl-hobt/dmf溶液脱除树脂上的fmoc保护基，将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂。脂。
3)全肽树脂加入裂解液，搅拌反应2小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用30ml的tfa洗涤，重复过滤与洗涤两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积约为原始体积的1/10左右，然后将其加入到体积为浓缩液10倍的预冷的甲基叔丁基醚中，沉降过夜并析出白色固体。缓慢倒出上清液体，并离心5次，每次用甲基叔丁基醚100ml，得到白色固体粉末，真空干燥10小时，取出称重。
实验结果：得到特立帕肽粗肽2.0g，hplc纯度分别为63.2％，；粗肽纯化、除盐、冻干后得特立帕肽精肽0.70g,hplc纯度为99.68％，d-his32-特立帕肽含量分别为0.15％，总收率为34％。
实施例4
步骤1和3同实施例3，仅将步骤2改为以下操作：
将上述树脂取一半，用脱保护剂为体积百分比浓度为1:4哌啶/dmf溶液脱除树脂上的fmoc保护基保护基反应30min，分别加入1mmol的fmoc-his(trt)-oh、1mmol的comu和1mmol的diea，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，用脱保护剂为体积百分比浓度为1：4哌啶/dmf溶液脱除树脂上的fmoc保护基将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树。
实验结果：分别得到特立帕肽粗肽2.2g，hplc纯度分别为60.1％；粗肽纯化、除盐、冻干后得特立帕肽精肽0.69g,hplc纯度为99.62％，d-his32-特立帕肽含量为0.03％，总收率为38％。
实施例5
1)取3.3g取代度为0.3mmol/gfmoc-phe-ctc-resin树脂中加20ml配置好的体积浓度为20％的哌啶的dmf溶液，搅拌使其反应30min，之后抽除液体，用dmf洗涤产物6次，每次用量20ml,将洗涤液dmf抽干，其后称取1mmol的fmoc-asn(trt)-oh、1mmol的tbtu和1mmol的hobt，将这三种物质用20ml的dmf:dcm＝1:1混合溶剂溶解，溶解完全后向其中加入10mmol的diea形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，其后抽除液体，用dmf对产物洗涤6次，每次用量20ml，抽干即得到5.1gfmoc-asn(trt)-phe-ctcresin树脂。
2)将上述树脂取一半，加入体积比为1:4哌啶/dmf溶液脱除树脂上的fmoc保护基反应30min,加入1mmol的fmoc-his(trt)-oh、1mmol的comu和1mmol的diea，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时此后加入百分比浓度为1:4哌啶/dmf溶液脱除树脂上的fmoc保护基反应30min，将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂。
3)全肽树脂加入裂解液，搅拌反应2小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用30ml的tfa洗涤，重复过滤与洗涤两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积约为原始体积的1/10左右，然后将其加入到体积为浓缩液10倍的预冷的甲基叔丁基醚中，沉降过夜并析出白色固体。缓慢倒出上清液体，并离心5次，每次用甲基叔丁基醚100ml，得到白色固体粉末，真空干燥10小时，取出称重。
实验结果：得到特立帕肽粗肽2.3g，hplc纯度为68.1％；粗肽纯化、除盐、冻干后得特立帕肽精肽0.65g,hplc纯度为99.72％，d-his32-特立帕肽含量别为0.02％，总收率为37％。
实施例6
1)取3.3g取代度为0.3mmol/gfmoc-phe-ctc-resin树脂中加20ml配置好的体积浓度为20％的哌啶的dmf溶液，搅拌使其反应30min，之后抽除液体，用dmf洗涤产物6次，每次用量20ml,将洗涤液dmf抽干，其后称取1mmol的fmoc-asn(trt)-oh、1mmol的tbtu和1mmol的hobt，将这三种物质用20ml的dmf:dcm＝1:1混合溶剂溶解，溶解完全后向其中加入10mmol的diea形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，其后抽除液体，用dmf对产物洗涤6次，每次用量20ml，抽干即得到5.1gfmoc-asn(trt)-phe-ctcresin树脂。
2)将上述树脂取一半，分别加入1mmol的fmoc-his(trt)-oh、1mmol的comu和1mmol的diea，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，用脱保护剂为体积百分比浓度为1:1:8哌啶/cl-hobt/dmf溶液脱除树脂上的fmoc保护基将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂。
3)全肽树脂加入裂解液，搅拌反应2小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用30ml的tfa洗涤，重复过滤与洗涤两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积约为原始体积的1/10左右，然后将其加入到体积为浓缩液10倍的预冷的甲基叔丁基醚中，沉降过夜并析出白色固体。缓慢倒出上清液体，并离心5次，每次用甲基叔丁基醚100ml，得到白色固体粉末，真空干燥10小时，取出称重。
实验结果：得到特立帕肽粗肽2.5g，hplc纯度为73.2％；粗肽纯化、除盐、冻干后得特立帕肽精肽0.91g,hplc纯度为99.88％，d-his32-特立帕肽含量为0.01％，总收率为44％。
实施例7
步骤1和3同实施例8，仅将步骤2改为以下操作：
将上述树脂取一半，分别加入1mmol的fmoc-his(trt)-oh、1mmol的comu和1mmol的diea，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，(条件8)用脱保护剂为体积百分比浓度为2：8哌啶/dmf溶液脱除树脂上的fmoc保护基将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂。
实验结果：得到特立帕肽粗肽2.2g，hplc纯度为68.1％；粗肽纯化、除盐、冻干后得特立帕肽精肽0.69g,hplc纯度为99.52％，d-his32-特立帕肽含量为0.03％，总收率为37％。
试验例1
步骤1和3同实施例2，仅将步骤2改为以下操作：
将上述树脂取一半，加入体积比为1:4哌啶/dmf溶液脱除树脂上的fmoc保护基反应30min，加入1mmol的fmoc-his(trt)-oh、1mmol的tbtu和1mmol的hobt，将这三种物质用20ml的dmf:dcm＝1:1混合溶剂溶解，溶解完全后向其中加入10mmol的diea形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时后加入体积比为1:4哌啶/dmf溶液脱除树脂上的fmoc保护基反应30min，将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂。
实验结果：特立帕肽粗肽2.1g。hplc纯度为61.2％，粗肽纯化、除盐、冻干后分别得特立帕肽精肽0.68g,hplc纯度为99.07％，d-his32-特立帕肽含量为0.15％，总收率分别为34％。
试验例2
步骤1和3同实施例5，仅将步骤2改为以下操作：
将上述树脂取一半，加入体积比为1:4哌啶/dmf溶液脱除树脂上的fmoc保护基反应30min，加入1mmol的fmoc-his(trt)-oh、1mmol的tbtu和1mmol的hobt，将这三种物质用20ml的dmf:dcm＝1:1混合溶剂溶解，溶解完全后向其中加入10mmol的diea形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时此后加入脱保护试剂，将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂。
实验结果：得到特立帕肽粗肽2.1g，hplc纯度为67.2％；粗肽纯化、除盐、冻干后得特立帕肽精肽0.68g,hplc纯度为99.67％，d-his32-特立帕肽含量为0.03％，总收率为35％。
表1.本发明实施例和试验例实验条件和结果对比
从表1数据可以看出，本发明在32号具有n端fmoc保护的氨基酸缩合的缩合剂为comu，制备的特立帕肽中d-his32-特立帕肽含量低，且特立帕肽纯度和收率均较高，特别是进行放大生产时，其收率尤其高，如实施例1。