一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽及其应用的制作方法

本发明涉及水产养殖的技术领域，尤其涉及一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽及其应用。

背景技术：

近年来，随着经济的发展，人们对水产品的需求日益增加，在捕捞量不能满足市场需求的情况下，水产养殖业得到了迅猛的发展。对虾是水产养殖中增长最快的产品之一，我国是养殖对虾年产量最高的国家。然而，与国际对虾养殖业相比，我国、我省对虾养殖业相对效益较低、发展后劲不足，可持续发展前景不容乐观。究其原因，主要与目前我国对虾养殖病害频发和生物安全所致对虾出口屡遭贸易壁垒等有关。

血蓝蛋白又称血蓝素，是一种多功能蛋白，过去被称为呼吸蛋白，它是位于节肢动物和软体动物血淋巴中的含铜呼吸蛋白，是节肢动物和软体动物血淋巴中发现的含铜的蓝绿色高分子量蛋白质，是氧的传递体，并且是已知的能与氧气可逆结合的唯一铜蛋白。

抗菌肽(antibac-terialpeptide)又叫抗微生物肽(antimicrobialpep-tide)、抗生素肽(antibioticspeptide)，是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫、抑杀肿瘤细胞等活性作用的多肽。迄今为止，国内外报道大约有2000多种抗菌肽被鉴定、分离出来，以天然抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽已达数千种。在生物界自然存在的抗菌肽根据其结构的不同可以分为四大类：β折叠型抗菌肽、α螺旋型抗菌肽、延伸结构型多肽和loop结构型多肽。

目前，我国对虾养殖业急需解决的共性关键问题包括：对虾传染性疫病的防控、品种的选育、营养研究、养殖环境控制以及对虾加工技术升级等。而要成功解决这些问题，阐明对虾免疫防御机制是前提和基础。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽及其应用，本案由此产生。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽及其应用，通过凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽b14构效关系的研究，为寻找新的对虾病害防控、良种选育的策略提供思路，促进我国对虾养殖业的健康、持续发展。

为了解决上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽，其氨基酸序列如序列表seqidno:1所示。

作为实施例的优选方式，所述抗菌肽的分子量为1875da。

一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽的应用，在制备治疗或预防革兰氏阴性菌的药物中的应用。

作为实施例的优选方式，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、河弧菌、嗜水气单胞菌及副溶血弧菌。

本发明以凡纳滨对虾血蓝蛋白为研究对象，采用圆二色谱法预测这11种肽段的结构含量，在此基础上，从中选择一种肽段即抗菌肽b14进行抑菌实验验证其抑菌活性，然后采用核磁共振法分析其可能存在的二级结构，最后分析其疏水性，得出抗菌肽b14的结构可能是延伸型结构抗菌肽，推测抗菌肽b14的结构、疏水性氨基酸是影响其抑菌活性的因素。本发明为进一步研究凡纳滨对虾的免疫防御机制提供了基础。

附图说明

图1为本发明预测抗菌肽b14的3d模型；其中，白色箭头所指片段为抗菌肽b14；

图2为本发明抗菌肽b14的化学式；

图3为本发明抗菌肽b14的hmbc谱；其中，横坐标为h谱，纵坐标为c谱；

图4为本发明抗菌肽b14的noesy谱；其中：横纵坐标皆为h谱；

图5为本发明抗菌肽b14可能的空间结构。

具体实施方式

实施例1凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽的预测

首先运用antibpserver、camp、apd2三个在线预测软件，预测凡纳滨对虾血蓝蛋白大、小亚基抗菌肽段，如表1、表2所示，总共预测得到34条可能具有抗菌活性的小分子片段，其中11条多肽序列(黑体加粗表示)可能会形成α螺旋结构，且能与病原菌膜相互作用而发挥抑菌作用，这些预测多肽分子量大小范围为1.5～1.9kda。另外，预测结果显示，在血蓝蛋白n端的α螺旋域、c端的ig-like域以及中间部分的保守铜离子结合域均有活性片段，其中铜离子结合域和ig-like域占主要区域。

表1凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基抗菌肽段的预测

注：1、加粗多肽序列：根据其理化性质推测可能形成α螺旋结构，且能与病原菌膜相互作用发挥抑菌作用；2、ⅰdomain：α螺旋域；ⅱdomain：铜离子结合域；ⅲdomain：ig-like域。

表2凡纳滨对虾血蓝蛋白小亚基抗菌肽段预测

注：1、加粗多肽序列：根据其理化性质推测可能形成α螺旋结构，且能与病原菌膜相互作用发挥抑菌作用；2、ⅰdomain：α螺旋域；ⅱdomain：铜离子结合域；ⅲdomain：ig-like域。

实施例2采用圆二色谱法分析凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽二级结构含量

将实施1所述的11种(表1和表2中的加粗肽段)可能会形成α螺旋结构，且能与病原菌膜相互作用而发挥抑菌作用的肽段进行圆二色谱扫描,分析其结构含量。

2.1实验器材

2.1.1实验材料

实验用抗菌肽由北京中科亚光生物科技有限公司(scilightbiotechnology，llc)合成，多肽n端乙酰化、c端酰胺化修饰，纯度为﹥95％。

2.1.2实验仪器

紫外分光光度计(uv5200)厂家：上海元析仪器有限公司

圆二色谱仪(jascoj-810)厂家：日本jasco

比色皿：1mm石英比色皿

2.2样品制备

使用紫外分光观光度计扫描抗菌肽的最大吸收波长，为圆二色谱测定抗菌肽的二级结构做前期准备。

利用uvprofessional软件联机紫外分观光度计对11种肽段进行波长扫描，波长扫描范围190nm-400nm，从波长扫描图中找出11种肽段的最大吸收波长，在最大吸收波长下，将11种肽段稀释到适合进行圆二色谱的吸光度，如表3所示。

表311种肽段的最大吸收波长和最适吸光度

2.3样品测试步骤

2.3.1、开启仪器

开启电脑，完全开启氮气瓶总阀，打开减压阀，使表头保持在0.1pa。开启仪器侧面的氮气流量计，是气流保持在3-5l/min。打开仪器电源，仪器开始点灯(约需0.5min)，待仪器面板上“open”灯亮后，双击“spectramanager”图标，在spectramanager对话框中选择所需的测量法“spectrummeasurement”，仪器开始自我检查，约2min后，自检后，出现spectrummeasurement对话框，根据测试要求设置参数。

2.3.2、参数设置

parameters设置参数：

波长范围：190-250nm

数据采集点：0.5nm

scanningspeed：100nm/min

scanningmode：continuous

狭峰宽度：1nm

datamode设置：cd或fdcd(荧光cd)测试方法

option：选择注解有关参数

2.3.3、样品测试

将配制好的样品装进1mm石英比色皿中，放入样品架中，溶液样品架放在靠光圈侧，盖上盖板，点击start开始测试，当波长扫描至400nm一下，开启氮气保护，扫描结束自动生成spectraanalysis对话框。

2.3.4、谱图处理

点击生成的对话框中file菜单，选择saveas将cd谱图保存生成.jws文件。

2.3.5、关机

退出cd程序后关闭仪器主机电源，然后关去氮气瓶总阀，排出残留氮气，最后关闭仪器上的氮气流量计。

2.4数据处理

1、利用cdpro软件，把cd数据降序导出到记事本，另存为.inp格式，将其复制到cdpro文件中，先运行crdata.exe，在运行sellon3.exe执行计算，结果打开sellon3.out查看。

2、计算方法：

α螺旋含量＝h(r)+h(d)；

β折叠＝s(r)+s(d)；

转角＝trn；

无规则＝unrd。

2.5实验数据

表4圆二色谱结果

2.6抗菌肽段选取

本发明从表4的11种肽段选取其中的抗菌肽b14进行进一步的构效关系研究。从表4得知，抗菌肽b14的二级结构含量为：α螺旋含量为28.7％，β折叠含量为8.5％，转角含量为23.4％，无规则含量为41.4％。即抗菌肽b14的15个氨基酸残基中可能有4个氨基酸残基形成α螺旋结构，6个氨基酸残基形成无规则结构。

实施例3采用平板计数法验证抗菌肽b14的抑菌活性

3.1操作步骤

实验用抗菌肽由北京中科亚光生物科技有限公司(scilightbiotechnology，llc)合成，多肽n端乙酰化、c端酰胺化修饰，纯度为﹥95％。

对虾血蓝蛋白化学合成抗菌肽段抑菌活性分析采用以下方法进行，具体流程如下：

(1)先将-80℃保存的水产实验致病菌(副溶血弧菌、乙型链球菌、大肠杆菌、溶藻酸弧菌、嗜水气单胞菌、河弧菌)进行小量活化(1ml肉汤液体培养基+50μl菌种)，37℃恒温摇床培养6-12h至对数生长期(或28℃下培养24h左右)。

(2)根据菌液原浓度，用无菌milli-q水稀释菌液至菌浓度为10⁶-10⁷cfu/ml，取稀释后的菌液10μl与1.0mg/ml不同组分多肽样液10μl混匀，置于30℃恒温水浴锅中孵育2h，取10μl混合液涂平板，每组2个平行，37℃倒置培养12-24h后计数菌落并拍照。对照组为无菌milli-q水。

(3)计算抑菌率(％)＝(阴性对照菌落数-实验组菌落数)/阴性对照菌落数×100。

3.2结果分析

采取平板菌落计数法分析抗菌肽b14对副溶血弧菌、乙型链球菌、大肠杆菌、溶藻酸弧菌、嗜水气单胞菌、河弧菌的抑菌活性，结果如表5所示。

表5抗菌肽b14对六种菌的抑菌率(％)

在实验所用的六种水产致病菌中，属于革兰氏阴性菌的有大肠杆菌、副溶血弧菌、河弧菌、溶藻酸弧菌、嗜水气弧菌，属于革兰氏阳性菌的有乙型链球菌。由表5得出，抗菌肽b14对大肠杆菌，河弧菌，嗜水气单胞菌，副溶血弧菌具有抑菌活性，抗菌肽b14对溶藻酸弧菌，乙型链球菌不具有抑菌活性。由此可以推断出，抗菌肽b14对革兰氏阴性菌具有抑菌活性。

实施例4采用核磁共振法研究抗菌肽b14二级结构

抗菌肽b14的二级结构解析主要分析nmr谱图中的hmbc谱和noesy谱。

4.1操作步骤

实验用抗菌肽由北京中科亚光生物科技有限公司(scilightbiotechnology，llc)合成，多肽n端乙酰化、c端酰胺化修饰，纯度为﹥95％。

将抗菌肽样品送于上海中科新生命生物科技有限公司进行核磁共振(nmr)谱图扫描得到抗菌肽b14的c谱，h谱，hmbc谱，noesy谱。

4.1.1预测抗菌肽b14的3d模型

预测网站：swiss-model/workspare(http://swissmodel.expasy.org/)

在预测网站对抗菌肽b14进行三维结构预测，选择相似度较高的三维结构图，下载.pdb文件，在pymol软件中打开进行查看与编辑。

4.1.2抗菌肽b14的nmr谱图解析

在chemdraw软件中画抗菌肽b14的化学结构式，再导入mestrenova中进行归属。

在mestrenova软件中打开抗菌肽b14的c谱，h谱，hmbc谱和noesy谱，将h谱作为hmbc谱的横坐标，c谱作为hmbc谱的纵坐标，h谱作为noesy谱的横纵坐标，导入化学式进行归属，在hmbc谱上分析h与远程c的可能相关关系，在noesy谱上分析h与远程h的可能相关关系。

4.2抗菌肽b14的3d模型

如图1所示，为预测抗菌肽b14的3d模型；其中，白色箭头所指片段为抗菌肽b14；由图1得出，抗菌肽b14可能是一段loop结构型抗菌肽的一段抗菌肽段，所以抗菌肽b14有可能是一段线状结构的抗菌肽。

4.3抗菌肽b14的nmr解谱结果

4.3.1抗菌肽b14的化学式

抗菌肽b14的肽段序列：grwnaieldkfwvkl，翻译成三字符号：gly-arg-trp-asn-ala-ile-glu-leu-asp-lys-phe-trp-val-lys-leu。图2为抗菌肽b14的化学结构。

4.3.2抗菌肽b14的nmr谱图

如图3所示，为抗菌肽b14的hmbc谱，从图3可得出以下信息：

a、每个氨基酸r基上的c与αc上的h可能有联系。

b、每个氨基酸上的αc与αc上的h可能有联系。

c、每个氨基酸r基上的c与r基上的h可能有联系。

d、每个氨基酸上的αc与r基上的h可能有联系。

e、羰基上的c与αc上的h可能有联系。

f、羰基上的c与r基上的h可能有联系。

g、第3、11、12个氨基酸r基上的c与第3、4、11、12个氨基酸r基上的h可能有联系。

h、第3、11、12个氨基酸r基上的c与第3、4、10、11、15个氨基酸r基上的h可能有联系。

i、第3、36、8、19、33号的c与第16号的h可能有联系。

j、第3号的c与第39号的h可能有联系。

k、第71、79、88、99、120号的c与第85、126号的h可能有联。

如图4所示，为抗菌肽b14的noesy谱；从图4中可得出以下信息：

a、第51、67、116、134号的h与第16号的h可能有联系。

b、第42、82’、123’号的h与第16号的h可能有联系。

c、第83’、124’号的h与第16号的h可能有联系。

d、第34’号的h与第16号的h可能有联系。

e、第20、100号的h与第16号的h可能有联系。

f、第32、40号的h与第16号的h可能有联系。

g、第51、67、68号的h与第32号的h可能有联系。

h、第134、135号的h与第40号的h可能有联系。

i、第42、83’、123’号的h与第32号的h可能有联系。

j、第20”、100”、125”号的h与第40号的h可能有联系。

k、第1、2、6、13、14个氨基酸αc上的h与第6、8、13、15个氨基酸甲基上的h可能有联系。

l、第2、6、7、8、10、14、15个氨基酸r基上的h与第2、4、9、11、12、15个氨基酸αc上的h可能有联系。

m、第2、6、13、14个氨基酸αc上的h与第2个到第15个氨基酸r基上的h可能有联系。

n、第2、10、14个氨基酸r基上氨基的h、第3、12个氨基酸r基上苯环的h与第2、6、7、8、10、14、15个氨基酸r基上的h可能有联系。

o、第2、10、14个氨基酸r基上氨基的h、第3、12个氨基酸r基上苯环的h与第2个到第15个氨基酸αc上的h可能有联系。

4.3.3抗菌肽b14的nmr分析结果

通过观察分析hmbc谱图和noesy谱图得出的信息，从中分析得到：并未在hmbc谱上找出每个氨基酸主链上的c与远程氨基酸主链上的h的相关点，同时，在noesy谱也没有找出每个氨基酸主链上的h与远程氨基酸主链上的h的相关点，所以抗菌肽b14可能是延伸型结构抗菌肽或者loop结构型抗菌肽，如图5所示。

实施例5抗菌肽b14氨基酸残基的疏水性分析

5.1分析数据

氨基酸的疏水性列表参考biologicalmagneticresonancedatabank(生物核磁共振数据银行http://www.bmrb.wisc.edu/referenc/hydroph.html)，结果如下：

表6抗菌肽b14氨基酸残基物理性质

5.2结果分析

由表6得出：抗菌肽b14由15个氨基酸组成，其中疏水性氨基酸残基有7个，碱性氨基酸残基有3个，亲水性氨基酸残基有2个，酸性氨基酸残基有2个，所以抗菌肽b14富含疏水性和碱性氨基酸残基，其疏水性约为46.7％。

总之，本发明筛选得到的抗菌肽b14对大肠杆菌，河弧菌，嗜水气单胞菌，副溶血弧菌等革兰氏阴性菌具有抑菌作用，其中对大肠杆菌和河弧菌抑菌率最强，分别达到60.15％和67.36％。采用圆二色谱测定抗菌肽b14的α螺旋含量为28.7％，β折叠含量为8.5％，转角含量为23.4％，无规则含量为41.4％。α螺旋、β折叠和转角含量较少，不能形成原有的结构。从抗菌肽b14的3d模型预测抗菌肽b14的二级是线状结构，核磁共振分析抗菌肽b14可能是一段延伸型结构抗菌肽。抗菌肽b14富含疏水性和碱性氨基酸残基，其疏水性约为46.7％。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。