抗菌多肽EC1‑17KV及其用途的制作方法

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及到一种多肽及其用途，即本发明的多肽具有抗细菌，尤其是耐药细菌感染的用途。

背景技术：

抗生素一直以来是人类对抗细菌感染的首选药物，但近几十年来临床抗生素的滥用导致全世界范围内耐药性细菌的出现。全球每年约有2000万人死于耐药细菌感染，并且感染与死亡人数还有逐年上升的趋势。

阳离子抗菌肽是自然界天然进化而成、具有抗致病微生物感染的生物活性大分子，存在于不同物种的免疫系统内。天然存在的阳离子抗菌肽长度通常在10到80个氨基酸之间。其结构特征为；①携带正电荷，富含碱性氨基酸，如赖氨酸，精氨酸，此特性被认为与抗菌肽结合携带负电荷的细菌膜结构有关。②抗菌肽发挥抗菌活性的二级结构通常为α螺旋。③结构具有两亲性，其二级结构在空间上表现为在α螺旋的轴向两侧，一面为亲水性残基聚集形成的亲水面，另一面为疏水性残基聚集形成的疏水面。亲水面能与细菌生物外膜磷脂双分子层上暴露的极性基团结合，疏水面能与磷脂双分子层疏水性的脂肪酰基链结合，并随着多肽在细菌细胞膜表面的不断聚集，最终在细菌细胞膜上形成孔洞结构，最终导致细菌内容物外泄。由于阳离子抗菌肽对生物被膜具有物理破坏作用，细菌较难通过靶点的突变对抗菌肽产生耐药，因此抗菌肽有望成为临床治疗重症耐药细菌感染的新型抗生素。

eecentrocins1为分离于海胆体腔液的天然结构肽，该结构为异源二聚体，由长30个氨基酸的重链与长13个氨基酸的轻链构成，全长43个氨基酸，据文献《novelantimicrobialpeptideseecentrocins1,2andeestrongylocin2fromtheedibleseaurchinechinusesculentushave6-br-trppost-translationalmodifications》报道，其重链对细菌和真菌具有一定的抗菌效果，mic值在1.5～6.3μm范围内。

技术实现要素：

发明人依据发现于海胆体腔液的异源二聚体蛋白eecentrocins1设计了阳离子抗菌肽ec1-17kv，由17个氨基酸组成，氨基酸序列为gwwrrtvkkvrnavrkv，分子量2139.58。

本发明多肽简称：ec1-17kv，是一种对耐药细菌具有较高抑制活性的阳离子多肽，其通过截取母体结构eecentrocins1重链的前17个氨基酸，并突变其第8位天冬氨酸为赖氨酸、14位甘氨酸为缬氨酸，采用固相合成法获得。ec1-17kv的氨基酸序列如seqidno：1所示。全序列为：甘氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸-精氨酸-苏氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-缬氨酸-精氨酸–天冬酰胺-丙氨酸-缬氨酸-精氨酸-赖氨酸-缬氨酸。

本发明多肽ec1-17kv为单链结构，长度仅为母肽的39.5％，因此能大大降低合成成本。

体外抗菌活性研究表明，本发明多肽ec1-17kv在截取母肽eecentrocins1重链的前17个氨基酸并进行定点突变的条件下，仍对青霉素耐药的革兰氏阳性/阴性菌表现出良好的抗菌效果(mic≤16μg/ml)，其抗菌活性与母肽相当。同时，杀菌曲线结果表明，多肽ec1-17kv对临床耐药细菌表现出良好的杀菌活性，能在8h内杀灭所有受试菌株。所述的临床耐药细菌包括革兰氏阴性菌(大肠埃希菌和铜绿假单胞菌)、革兰氏阳性菌(粪肠球菌和化脓性链球菌)。

体外毒性研究表明，本发明多肽ec1-17kv在1024μg/ml浓度下对绵羊红细胞的溶血率仅为0.5％；对小鼠原代脾细胞的增殖抑制率为32.7％，而在512μg/ml浓度下，抑制率不到15％。说明本发明多肽对哺乳动物细胞的毒性极小。

小鼠腹腔感染细菌构建菌血症模型研究多肽ec1-17kv的体内抗菌活性，结果表明，多肽ec1-17kv能显著提升耐药铜绿假单胞菌腹腔感染小鼠的生存率，降低感染小鼠血液和肺组织的细菌负载量，且对感染小鼠炎症反应和肺组织损伤具有良好的缓解作用。

下面是本发明多肽的部分药效学试验及结果：

一、本发明多肽ec1-17kv的体外抗菌活性测定

(1)多肽ec1-17kv的最低抑菌浓度(mic)和最低杀菌浓度(mbc)

①菌液的制备

将试验所需菌株从-20℃保藏的甘油管中接种至营养琼脂斜面，置于37℃培养箱中培养18h后，用接种针挑取少许接种至2ml营养肉汤培养基中，37℃恒温培养8h，用mh培养基倍比稀释，制备细菌浓度为10⁵cfu/ml左右的菌悬液。

②药物的配制

称取适量的ec1-17kv溶于无菌生理盐水，将其配成浓度为1024μg/ml的多肽母液，经0.22μm滤膜过滤除菌后分装，保存于-20℃备用。

③mic和mbc的测定

采用微量培养基稀释法测定多肽ec1-17kv对细菌的mic值。取100μl菌悬液(10⁵cfu/ml)，接种96孔板。等体积加入经mh倍比稀释的ec1-17kv母液，使药物终浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml。同时，设100μl菌液加入等体积的mh培养基作为只含菌液的阳性对照组，200μl的mh培养基作为不含菌液和药物的空白对照组。将96孔板置于37℃恒温培养18h。酶标仪测定各孔在595nm处的吸光度值并记录，药物能够完全抑制菌液生长的最低浓度被定义为最低抑菌浓度，即mic。

取上述步骤中96孔板，吸取未见浑浊的培养物100μl，加入900μl无菌培养基稀释后，转移至无菌平皿中，加入恒温55℃的营养琼脂培养基约10ml，充分晃匀，待凝固，置于培养箱中过夜培养。18-24h后，观察并记录平板上的菌落数，菌落数小于5个的最低药物浓度，即为mbc。结果见表1：

表1多肽ec1-17kv、粘菌素及青霉素v钾对耐药细菌的mic和mbc值

^a临床耐药菌株

由表1看出，本试验所选耐药菌株对青霉素v钾均表现出耐药性(mic>256μg/ml)，而ec1-17kv对耐药菌株表现出良好的抗菌效果(mic≤16μg/ml)。同时，青霉素v钾在试验浓度内未能杀死耐药细菌，而多肽ec1-17kv对所选试验菌株的mbc≤32μg/ml。

(2)多肽ec1-17kv的杀菌曲线

用营养肉汤培养基将上述制备的细菌悬液重悬，调整细菌浓度为1×10⁵cfu/ml左右，加入多肽ec1-17kv(终浓度为4×mic)，置于37℃恒温培养，在0、1、2、4、8h时，吸取混合培养物100μl进行系列稀释，将稀释液转移至无菌平板中，倒入营养琼脂培养基混匀，每个稀释度均设置三个平行对照。置于37℃恒温培养18h后进行菌落计数，计算平均值。以细菌数量的对数值为纵坐标，药物作用时间为横坐标，绘制杀菌曲线。结果见图1-4：

由图1-4可以看出，ec1-17kv对试验菌株具有良好的杀菌作用，杀菌效果迅速，8h内使大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌和化脓性链球菌下降约5个lgcfu，细菌完全被杀死。由此可见，ec1-17kv对临床青霉素耐药的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌和化脓性链球菌具有良好的杀伤作用。

二、本发明多肽ec1-17kv对真核细胞的毒性

(1)多肽对绵羊红细胞溶血活性的影响

将新鲜的脱纤维绵羊血离心(3000rpm，10min)，弃上清，下层红细胞用pbs洗涤3次，吸取300μl绵羊红细胞重悬于10ml的pbs中，制成体积分数为3％的绵羊红细胞悬液。将绵羊红细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔50μl，再向各孔中分别加入50μl经倍比稀释的多肽，使多肽的终浓度分别为8、16、32、64、128、256、512、1024μg/ml。阳性对照为终浓度1％tritonx-100，阴性对照为pbs。每组设3个复孔。加药后将培养板置于37℃培养30min，离心，取上清液，采用酶标仪测定450nm处波长。以阳性对照组为100％溶血率，阴性对照组为0％溶血率，计算多肽对绵羊红细胞的溶血率。

溶血率＝(加药组od450-阴性对照组od450)/(阳性对照组od450-阴性对照组od450)×100％

由附图5可以看出，随着多肽浓度的增加，未观察到明显溶血毒性，溶血率不超过1％。因此，本发明多肽在药物有效作用浓度范围内对红细胞不具有溶血性。

(2)多肽对小鼠原代脾细胞增殖的影响

成年icr小鼠，脱臼处死，用75％酒精浸泡5min除菌，无菌条件下解剖小鼠取其脾脏，生理盐水洗涤后，经200目筛网研磨，重悬于生理盐水，3000rpm离心5min，弃上清，加红细胞裂解液裂解5min，再次离心，生理盐水洗涤3次，收集脾细胞沉淀。用含10％小牛血清的rpmi-1640培养基重悬，计数，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml。将细胞悬液接种至96孔板中，每孔加入100μl，每组设3个复孔。试验组每孔加入100μl用培养基稀释的不同浓度多肽，使终浓度分别为16、32、64、128、256、512、1024μg/ml。试验设置rpmi-1640培养基处理组作为空白对照，1％tritonx-100处理组作为阳性对照。培养板置于37℃5％co2细胞培养箱中培养48h，每孔加入mtt20μl，继续培养4h，离心，弃上清，每孔加入150μldmso，轻轻振荡使甲瓒完全溶解，于490nm波长处用酶标仪测定各孔吸光度值，计算细胞存活率。结果见附图6。

由附图6可以看出，当多肽浓度从16μg/ml增加到1024μg/ml，其对小鼠原代脾细胞的增殖抑制率逐渐升高。当达到最高浓度1024μg/ml时，ec1-17kv对脾细胞增殖的抑制率为32.7％。而在512μg/ml浓度下，抑制率不到15％。因此，ec1-17kv在有效抗菌浓度下(≤32μg/ml)对小鼠原代脾细胞几乎无毒。

三、本发明多肽ec1-17kv对菌血症模型小鼠的保护作用

取体重18～22g的icr小鼠，随机分成6组，每组15只，分别为ec1-17kv高剂量治疗组(10mg/kg)、ec1-17kv中剂量治疗组(5mg/kg)、ec1-17kv低剂量治疗组(2.5mg/kg)、多粘菌素治疗组(2.5mg/kg)、模型组、空白组。用0.5％cmc-na将细菌原液制成浓度为mld的细菌悬液；除空白组外，其余5组小鼠均腹腔注射铜绿假单胞菌悬液进行感染(0.5ml/只)。ec1-17kv治疗组在感染后0.5h和2h分别腹腔给药，多粘菌素治疗组在感染后0.5h尾静脉给药。感染12h后，每组取5只小鼠，眼眶静脉丛取血处死，解剖，取肺左叶和全血进行活菌计数；取肺右叶，采用10％的甲醛溶液固定，he染色观察肺组织的损伤情况。其余小鼠连续观察7天，记录动物死亡情况，并计算多肽对感染小鼠的存活保护率。

结果见附图7-11

由附图7可以看出，小鼠腹腔感染铜绿假单胞菌后，存活率明显降低，感染后24h仅20％小鼠存活，感染后48h小鼠全部死亡。多肽ec1-17kv治疗能明显提高感染小鼠的存活率，其中高剂量治疗组存活率高达70％，中剂量组存活率达40％，低剂量组存活率为30％。且多肽中、高剂量治疗组与模型组比较具有显著性差异(p<0.05和p<0.01)。由此可见，ec1-17kv对耐药细菌感染小鼠具有良好的保护作用，能剂量依赖性地提高感染小鼠的生存率。

由附图8和附图9可以看出，随着多肽剂量的升高，中剂量和高剂量治疗组小鼠血液中细菌数量明显减少，与模型组比较下降约2～3个lgcfu；同时，肺组织匀浆液中细菌负载量也明显减少，其中多肽高剂量组小鼠肺组织的活菌数下降超过4个lgcfu。说明ec1-17kv对进入感染宿主体内的细菌具有强效的清除效率，机体内活菌载量的降低可能与生存率的提高密切相关。

由附图10看出，小鼠在感染耐药铜绿假单胞菌12h后，血清中促炎因子il-6和tnf-α的分泌量明显增加，与未感染小鼠比较具有显著性差异(p<0.001vscontrol组)；多肽ec1-17kv处理会影响感染小鼠血清中炎症因子的含量，其中中、高剂量治疗组，促炎因子il-6和tnf-α的含量明显降低，而抑炎因子il-4和il-10的含量明显升高，说明ec1-17kv可以通过调节细菌感染宿主体内炎症因子的分泌量缓解炎症反应。

由附图11看出，由细菌感染造成的小鼠肺间隔毛细血管扩张、充血及间质炎等症状能够不同程度地被多肽ec1-17kv缓解，其中以高剂量治疗组最为明显，说明本发明多肽对细菌感染引起的小鼠肺部损伤具有剂量依赖性的保护作用。这是由于ec1-17kv能够显著减少感染小鼠体内活菌数量，降低血清促炎因子il-6和tnf-α的含量，从而缓解感染诱发的炎症反应。

本发明的多肽可以和药学上可接受的载体一起制备成组合物用于临床。

附图说明

图1是ec1-17kv对青霉素耐药的铜绿假单胞菌的杀菌曲线

图2是ec1-17kv对青霉素耐药的大肠埃希菌的杀菌曲线

图3是ec1-17kv对青霉素耐药的粪肠球菌的杀菌曲线

图4是ec1-17kv对青霉素耐药的化脓性链球菌的杀菌曲线

图5是ec1-17kv对绵羊红细胞的溶血活性

图6是ec1-17kv对小鼠脾细胞的毒性

图7是ec1-17kv对菌血症小鼠的生存保护作用

图8是ec1-17kv对菌血症小鼠血液活菌数的影响

图9是ec1-17kv对菌血症小鼠肺组织活菌数的影响

图10是ec1-17kv对菌血症小鼠血清炎症因子变化的影响

图11是ec1-17kv对菌血症小鼠肺组织损伤的保护

具体实施方式

实施例1

(1)多肽ec1-17kv的合成及纯化

制备的ec1-17kv的氨基酸序列为：甘氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸-精氨酸-苏氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-缬氨酸-精氨酸–天冬酰胺-丙氨酸-缬氨酸-精氨酸-赖氨酸-缬氨酸。

多肽的合成采用fmoc固相合成法从c端到n端逐个进行：称取取代度为0.4mmol/g的2-chlorotritylchlorideresin树脂0.6g，将树脂放入反应管中，加dcm(15ml/g)，振荡30min；通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的氨基酸，再加入10倍摩尔过量的diea，最后加入少量dmf溶解，振荡1h。用dmf和dcm交替清洗6遍。加15ml20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，反应5min，去掉后再加15ml20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，反应15min。抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应。dmf(10ml/g)洗涤两次，甲醇(10ml/g)洗涤两次，dmf(10ml/g)洗涤两次。保护氨基酸(fmoc-l-gly-oh)三倍过量，hbtu三倍过量，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，立刻加入nmm+倍过量.反应30min。dmf(10ml/g)洗涤一次，甲醇(10ml/g)洗涤两次，dmf(10ml/g)洗涤两次。重复(2)至(5)步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。最后一个氨基酸连接后，脱保护，按照下列方法洗树脂。dmf(10ml/g)洗涤两次，甲醇(10ml/g)洗涤两次，dmf(10ml/g)洗涤两次，dcm(10ml/g)洗涤两次，抽干10min。配制切割液；tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％，tis1％。将树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照10ml/g，恒温震荡，时间：120min；将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚层析出来，再用乙醚洗六次，然后常温挥干。即得粗品肽序。

多肽的纯化：称取一定量粗品，加入适量乙腈，超声至澄清用过滤器除去大颗粒杂质。同时过制备型液相色谱仪，分段收取样品。用分析色谱仪做梯度分析，将达到所需纯度样品进行保留。然后进行冷冻干燥处理。

(2)多肽ec1-17kv的纯度测定(hplc法)及质谱结果

ec1-17kv合成后经纯化得到成品，成品经高效液相色谱、质谱进行鉴定。

液相色谱分析条件：welchc18色谱柱：4.6×250mm，5μm；流动相a：含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；流动相b：含0.1％三氟乙酸的纯净水。检测波长为220nm；流速为1.0ml/min；进样量为20μl，进行梯度洗脱。梯度洗脱条件见表2。

表2梯度洗脱条件

本发明多肽氨基酸序列如seqidno：1所示，纯度大于98％。ec1-17kv的分子量为2138.62，与理论值相吻合。

序列表

<110>中国药科大学

江苏美通制药有限公司

<120>抗菌多肽ec1-17kv及其用途

<130>2017

<141>2017-09-25

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17

<212>prt

<213>海胆(cionaintestinalis)

<400>1

glytrptrpargargthrvallyslysvalargasnalavalarglys

151015

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