一株吸附铅且耐受重金属的细菌及其应用的制作方法

本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一株对铅具有吸附、去除效果且耐受部分重金属的细菌。

背景技术：

随着工业生产的不断发展，水体重金属污染日趋严重。由于重金属化学行为的特殊性，无法被分解，可以通过食物链积累，引起慢性中毒，还可与环境中其他有机物结合形成毒性更大的有机毒素，对生物体和环境造成很大危害。传统的处理方法有化学沉淀、氧化还原，离子交换，膜处理以及电化学等方法，但是存在费用高，处理不完全，修复效果不佳，容易造成二次污染等情况。利用水体和土壤中能够耐受、钝化或吸附重金属的生物(主要为微生物)所建立的生物修复法，被公认为是一种高效、安全、无污染和廉价的修复方式，同时，因为微生物在环境中的种类丰富多样、分布广泛、适应性强、易驯化易突变等特点，在当前的重金属生物修复中具有较好的优势。

铅进入水体后，一方面可与f^-、cl^-、so4^2-、oh^-、hco^3-等阴离子及溶解性腐殖酸、氨基酸等配位体结合；另一方面能够被粘土矿物、铁锰氧化物等无机矿物及有机大颗粒吸附。水体中的铅可以通过皮肤和消化道等途径进入人体内，并在人体内发生富集。机体内核酸、蛋白质以及激素等都能与铅发生反应，从而使这些物质失去或者改变了原来的生理功能，而使人体发生病变。有研究表明，铅的人体体内的安全浓度范围是0.3～1mg，当人体每天摄取的铅含量超过此范围，铅就能够在血液中积累，导致人体出现贫血和神经炎等。当铅进入人体后，小部分铅由于人体的新陈代谢作用被排除体外，但停留在血液中的铅为很大一部分，血液中的铅对血液合成起到阻碍作用，从而引发多种不适症状。铅中毒会损坏人体的神经系统、造血系统、心血管系统、消化系统、免疫系统、内分泌系统以及生殖系统等，引起人体的消化、呼吸和免疫系统的急性和慢性中毒以及生殖毒性或者致畸形，严重时会发生脑病导致死亡的现象。

因此，本专利以研究降低铅超标水体或土壤中pb²⁺浓度为技术背景，从重金属铅的微生物修复技术出发，通过在重金属濡染场地进行土样采集，筛选出能够对高浓度铅产生抗性和吸附性的微生物为研究目的，从而得到能够应用于处理铅污染废水或土壤的高效功能微生物。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株能耐受包括pb在内的重金属并高效去除重金属pb的微生物，该微生物对铅有非常高的耐受性，受环境ph影响相对较小，特别对于低浓度铅污染修复效率高，而对于高浓度铅污染有持续修复的效果，在铅重金属污染的水体及土壤环境治理、工业场地农药污染的综合治理中具有非常高的应用价值。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供了一株能耐受重金属并吸附重金属铅的细菌，其分类命名为巨大芽胞杆菌z-y3(bacillusmegateriumz-y3)，该菌株已于2017年6月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为cctccno：m2017312。

优选地，上述细菌能够耐受的重金属为cu、mn、ni、cr(ⅵ)、cd。

该菌株的生物学特征主要有：菌落圆形，乳黄色至棕黄色，不透明，成熟菌落直径约为0.6cm，菌落湿润粘稠易挑取。在液体lb培养基摇床恒温37℃振荡培养12h内达到对数生长期，培养24h内达到稳定期，发酵液浑浊，呈乳黄色粘稠状；在固体lb培养基上，该菌菌落大小规则，多为圆形或卵圆形，边缘光滑，成熟菌落颜色转为棕黄色，菌落靠近边缘处或产生褶皱；在含有pb²⁺的lb培养基上培养至成熟后菌落颜色会逐渐加深，最终变为棕黑色。

将该菌的16srdna序列通过pcr扩增，得到1455bp长度的扩增产物，扩增产物经测序公司进行序列测定，其核苷酸序列如seqidno:1所示,将序列与genbank中的序列进行blast比对，结果表明该菌株与bacillussp.同源性很高，相似度超过99％。同时结合生理生化测试和形态结构观察结果分析，该菌株确定为巨大芽胞杆菌bacillusmegaterium，序列号为kt382244。

本发明第二方面提供巨大芽胞杆菌z-y3(bacillusmegateriumz-y3)cctccno：m2017312在水体和土壤重金属污染治理中的应用。

本发明第三方面提供了一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的巨大芽胞杆菌z-y3(bacillusmegateriumz-y3)cctccno：m2017312。

本发明的第四方面提供上述菌剂在水体和土壤重金属污染治理中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明从湖北省武汉市某无线电器材厂周边土壤中筛选得到的保藏号为：cctccno.m2017312的巨大芽孢杆菌z-y3，能在含有1000mg/l铅的固体培养基中良好生长。在液体摇瓶培养条件下，本发明菌株有产碱的能力，在不同ph值，均对铅有较强的去除能力，培养成熟的菌体吸附量可在短时间内达到最大，约20g/l。同时该菌对其他重金属如mn、ni、cu、cr(ⅵ)等重金属有不同程度的耐受性。相对于很多已发现的去除铅的微生物，该发明菌株对铅有非常高的耐受性，受环境ph影响相对较小，特别对于低浓度铅污染修复效率高，而对于高浓度铅污染有持续修复的效果。该菌株去除铅的代谢产物无毒性，环境友好。应用于实际重金属污染的水体或土壤中，亦可在耐受高浓度pb²⁺甚至混合重金属污染的情况下对pb²⁺通过有效钝化或吸附进行一定程度的去除；同时对于低浓度污染的水体或土壤，相对于物理化学修复方法，采用该菌剂不仅能有效快速去除pb²⁺污染，而且绿色环保经济实惠。因此本发明菌株在铅重金属污染的水体及土壤环境治理、工业场地农药污染的综合治理中具有非常高的应用价值。

附图说明

图1为z-y3在固体平板上的生长情况

a、生长前期；b、.生长中后期

图2为z-y3的分子生物学系统发育树

图3为不同初始ph条件下上清液的ph随时间变化及去除率变化情况

a、不同初始ph条件下上清液的ph随时间变化情况；b、不同初始ph条件下上清液中pb²⁺去除情况

图4为z-y3活菌体吸附pb²⁺随时间的变化及动力学拟合

a、z-y3活菌体吸附pb²⁺随时间的变化情况；b、.准一级动力学拟合曲线；c、准二级动力学拟合曲线

图5为z-y3活菌体对pb²⁺吸附的langmuir模型和freundlich模型拟合

a、吸附pb²⁺的langmuir拟合曲线；b、.吸附pb²⁺的freundlich拟合曲线

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

下述实施例中所使用的实验方法入无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

【实施例1】铅耐受菌的筛选及耐受性实验

实验土样取自湖北省武汉市某无线电器材厂周边植物根际与非根际土壤，土样采集后回实验室立即放于-20℃保存，以杀死土壤中的昆虫和植物组织以及一些病毒。处理10小时之后，于4℃解冻，多余的土样置于4℃冰箱保存。取10g土样，加入100ml无菌水振荡2h后，取上清液采用常规梯度稀释平板涂布培养法(培养基含pb²⁺浓度约为100mg/l)，在28℃恒温培养箱中培养24～48h，挑选涨势良好的菌株依次在浓度200、300、400mg/l的选择培养基上进行纯化及复筛。以上筛选的基础培养基采用lb培养基(成分：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物1g/l，nacl1g/l，琼脂20g/l，ph＝7)。

将纯种菌株接种在含有一定浓度梯度的pb²⁺的培养基中，于28℃恒温培养箱中培养观察菌体长势。液体培养环境下，菌株z-y3含pb²⁺1000mg/l的lb培养基中虽相对空白组和低浓度实验组生长稍缓，但仍能生长并达到稳定期；该菌甚至可在含pb²⁺高于1000mg/l的固体培养基中生长，并在生长中后期出现明显颜色变化(见图1)。

将纯种菌株接种在分别含有一定浓度梯度的cu²⁺、mn²⁺、ni²⁺、cr(ⅵ)、cd²⁺的液体和固体培养基中，分别于28℃恒温振荡箱及培养箱中培养观察菌体是否能正常生长及其长势，记录结果见表1。

【实施例2】菌株的鉴定

将纯化的菌株接种于固体lb培养基培养2d后观察菌株在固体平板上的菌落形态特征：菌落圆形，乳黄色至棕黄色，不透明，成熟菌落直径约为0.6cm，菌落湿润粘稠易挑取。将纯化的菌株接种于液体lb培养基后在一定时段内定期取样测定od600，绘制菌株生长曲线。在液体lb培养基摇床恒温37℃振荡培养12h内达到对数生长期，培养24h内达到稳定期，发酵液浑浊，呈乳黄色粘稠状；在固体lb培养基上，该菌菌落大小规则，多为圆形或卵圆形，边缘光滑，成熟菌落颜色转为棕黄色，菌落靠近边缘处或产生褶皱；菌株的理化性质鉴定主要参照伯杰细菌鉴定生理生化测试，通过表格记录结果。

表2细菌z-y3的生理生化检测

注：“+”表示培养5天后检测为阳性结果，“-”表示阴性结果

细菌16srdna测序包括了菌株dna提取、16srdna体外pcr扩增(使用16s通用引物1492r和27f，27f：：5′-agagtttgatcctggctcag-3′)，1492r：5′-taccttgttacgactt-3′)获得1455bp的基因片段。由基因公司测序得到的序列结果如seqidno:1所示，经过软件分析、合并以及带入ncbi的数据库中进行blast基因序列比对，结果使用生物学软件分析，并与数据库中相似菌株的16srdna序列进行比对，建立菌株16srdna系统发育树。如图2所示该菌株与bacillussp.同源性很高，相似度超过99％。同时结合生理生化测试和形态结构观察结果分析，该菌株确定为巨大芽胞杆菌bacillusmegaterium，

序列号为kt382244。

【实施例3】菌株去除pb²⁺特性研究

ph、吸附时间、重金属离子初始浓度对吸附效果的影响实验。于lb培养液中37℃、180rpm对菌株进行扩大培养12h，得到的活化菌株8000rpm，10min离心分离得到的纯菌株用无菌水/稀硝酸洗涤2～3次后制备成浓缩菌液(od＝2.3，约20g/l)备用。使用1mol/l的naoh和hno3对含一定量pb2+的溶液调节ph为3、4、5、6、7；pb²⁺初始浓度为25、50、75、100、150、200mg/l；接种5％(v/v)制备好的浓缩菌液于配置好一定浓度的含pb²⁺中，定期取上清液测定pb²⁺含量。

(1)ph值。由图3中低初始ph实验组的ph随时间变化可知，该菌有产碱作用；结合去除率变化图可知，在中强酸条件下对pb²⁺能保证一定的去除效率及最终去除率，即z-y3受环境ph影响较小，在酸性条件下去除效果比较稳定，应用于酸性环境有一定的优势。

(2)吸附时间。图4显示了活菌体在100mg/l的初始pb²⁺浓度下的动态去除过程，菌体在前10min内去除迅速，随后经过约3h基本达到吸附平衡，很可能是活细胞在快速的细胞表面吸附之后，发生了相对缓慢的胞内积累过程，或者随着细胞微量产碱少量pb²⁺被沉淀。对前5min的去除进行一级反应动力学拟合得到的相关系数，明显低于二级反应动力学(0.99959)，单就作用开始的短时间内(5min左右)符合一级动力学方程，而二级动力学比一级动力学更适合描述整个动态去除过程，以化学作用过程为主。

(3)重金属离子初始浓度。

从拟合结果来看freundlich方程的相关系数r²比langmuir方程的高，如图5所示，说明z-y3活菌对pb²⁺吸附过程是一个异质面的吸附过程，除了表面吸附，还可能有细胞内部积累或其他作用。同时freundlich方程的常数kf

(33.13838)和n(14.76077)表明活z-y3细胞对pb²⁺具有较强的吸附能力。

表3z-y3活菌体吸附pb²⁺的准一级和准二级动力学常数

表4z-y3活菌体等温吸附模型拟合相关参数

序列表

<110>武汉大学

<120>一株吸附铅且耐受重金属的细菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1455

<212>dna

<213>巨大芽胞杆菌(bacillusmegaterium)

<400>1

gggctgcggcgtgctatacatgcagtcgagcgaactgattagaagcttgcttctatgacg60

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