本发明属于生物工程领域，特别涉及由鲤疱疹病毒3型1301株截短orf132基因重组表达蛋白、由orf132重组表达蛋白制备的多克隆抗体及其应用。
背景技术：
鲤疱疹病毒3型(cyprinidherpesvirus3，cyhv-3)，又称为锦鲤疱疹病毒(koiherpesvirus，khv)，锦鲤疱疹病毒病(koiherpesvirusdisease，khvd)是由锦鲤疱疹病毒引起的一种传染性疾病，毒性极强，锦鲤疱疹病毒的宿主范围十分狭窄，仅感染锦鲤、鲤鱼及其普通变种，但是我国的鲤鱼养殖面积和产量所占比重较大，锦鲤又是我国观赏鱼的主要品种，因此一旦暴发锦鲤疱疹病毒，将给我国渔业产业带来巨大的损失。khvd被世界动物卫生组织(oie)列为必须申报的疾病，我国将其列为二类疫病。自1996年在英国首次发现锦鲤疱疹病毒病以来，多个国家和地区都报道了由该疾病引起的鲤鱼或锦鲤暴发性死亡现象，给鲤鱼及锦鲤养殖产业带来了严重的经济损失。cyhv-3属于疱疹病毒目，异疱疹病毒科，鲤疱疹病毒属，是具有囊膜的双链dna病毒，病毒颗粒直径为167～200nm，基因组全长295kbp，两端为22kbp的正向重复序列，共编码164个开放阅读框(openreadingframe,orf)，包括8个重复orf，是已知基因组最大的疱疹病毒。
目前，运用质谱学的方法已鉴定到46种病毒结构蛋白。其中，michel等运用液相串联色谱技术在khv-fl株中鉴定到13种囊膜蛋白、3种核衣壳蛋白、2种皮层蛋白和22种未知蛋白共40种结构蛋白。随后，yi等通过对亚洲型khv-gz10和欧洲型khv-gz11进行质谱鉴定，将鉴定的结构蛋白增加至46种。虽然通过蛋白质质谱鉴定对cyhv-3病毒蛋白有了一定的认识，但大部分蛋白的精确定位和功能研究仍处于空白，只有少数蛋白进行了较深入的鉴定，其中，orf81编码蛋白是研究较多的结构蛋白之一。另外，fuchs等还对部分囊膜蛋白orf25、orf65、orf99、orf136、orf149和主要衣壳蛋白orf92进行了初步鉴定。
本发明选择的orf132完整开放阅读框长度分别为513bp，虽然蛋白质谱分析显示orf132编码蛋白为结构蛋白，但未见具体的验证，且根据orf132基因编码蛋白第1～170位核苷酸区域进行pcr扩增，构建原核表达载体并尝试表达，结果并未表达成功，选取orf132基因编码蛋白第95-170位对应核苷酸区域进行pcr扩增并成功表达蛋白并制备抗体，但其深入的功能定位还不清楚，更多相关研究仍有待开展。
虽然目前已有很多cyhv-3的检测诊断方法，但在实际广泛应用中主要还是基于分子的检测技术，因为khv的细胞分离存在一定难度，不利于病毒大量扩增和病毒抗体制备，导致血清学检测方法缺乏，但pcr检测存在漏检和假阳性问题，且大多只作为病毒定性检测。为了从病毒含量和抗体效价两个角度定性定量了解khvd情况，迫切需要有能特异性识别khv的抗体，为该病的流行病学调查提供技术手段。
技术实现要素：
本发明的目的在于公开了鲤疱疹病毒截短orf132基因重组表达蛋白、抗体的及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种orf132基因重组表达蛋白多克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤：选择截短的鲤疱疹病毒orf132基因序列特异性扩增，进行蛋白表达，纯化后，将表达的蛋白进行皮下多点注射免疫制备多克隆抗体。
优选的，截短的鲤疱疹病毒orf132基因序列为鲤疱疹病毒orf132基因的第283～513位碱基序列。
优选的，表达的蛋白序列为：
hrrrisrhfrklrprkwirddaetgsvidaatryndngydnpafveedddrcidtraasivgvvtnknqnrlkglr(seqidno:5)。
进一步优选的，扩增目的基因序列片段的引物序列是：
f:ccggaattccacagacgccgtatatcgaggc(seqidno:3)，
r:ccgctcgagttatcatcttagaccttttagacgattttg(seqidno:4)。
优选的，蛋白表达采用的表达载体是pgex-4t-orf132。
优选的，蛋白表达后的纯化方法是ni-凝胶纯化。
优选的，制备多克隆抗体的方法是：将纯化的重组表达蛋白对兔子进行皮下多点注射免疫，免疫66天后，进行颈动脉采血；将血液于37℃静置1h后，3000rpm/min离心10min，收集血清，用亲和纯化的方式对抗血清进行纯化，得到多克隆抗体。
优选的，皮下多点注射免疫的方法是：首次免疫采用弗氏完全佐剂，后三次免疫采用弗氏不完全佐剂，佐剂和重组表达蛋白体积比为1:1。
本发明的有益效果是：本发明采取截短了orf132基因序列，并进行重组表达，制备抗体的办法，克服了orf132完整的基因序列无法正常表达的缺点，并且利用截短后的表达蛋白制备的多抗对完整的蛋白依然具有比较好的效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例
1)表达片段特异性扩增
编码鲤疱疹病毒3型1301株orf132基因重组表达蛋白的核苷酸，其全长核苷酸碱基序列是：
atgacgggttccaagattagcccgggcctgcttgcggcggcgacgtccctaacgacgatcggagacgccgtcgctcaatccctcaccgacctcacggaaggactcgcggtccccactctaccgcccgacttcgccaacagttttctgtactggttcaaccccgccaactttgacaagtgcgccccggcgcagaacccctactgcgtgtcgggccccatcgtcttcggcctgctgctgctcctcggagtgggcctgctcgccttcctctgctgctgctgctgtcacagacgccgtatatcgaggcacttcagaaaactcagacccagaaaatggatccgggacgacgccgaaacgggatccgtgatcgacgccgccacccgctacaacgacaacggctacgacaacccagcgttcgtggaggaggacgacgacagatgcatcgacaccagagcggcttctatagtgggcgtcgtcaccaacaaaaaccaaaatcgtctaaaaggtctaagatga(seqidno:1)。
其氨基酸序列是：
mtgskispgllaaatslttigdavaqsltdlteglavptlppdfansflywfnpanfdkcapaqnpycvsgpivfglllllgvgllaflccccchrrrisrhfrklrprkwirddaetgsvidaatryndngydnpafveedddrcidtraasivgvvtnknqnrlkglr(seqidno:2)。
设计引物f:ccggaattccacagacgccgtatatcgaggc(seqidno:3)，
r:ccgctcgagttatcatcttagaccttttagacgattttg(seqidno:4)。
pcr反应体系：12.5μlrtaqmix、引物各1μl(10umol/l)和1μldna模板，补灭菌水至25μl。
反应程序如下：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，30个循环；72℃，7min。
以f/r为引物，针对orf132基因编码蛋白第283～513位核苷酸区域，即第95～170位氨基酸区域，以鲤疱疹病毒3型1301株为模板进行pcr扩增，1.5％的琼脂糖电泳分析显示获得一条与预期大小相符的条带，片段大小为228bp。
2)重组原核表达载体pgex-4t-orf132的构建
对步骤一扩增的重组克隆载体pmd18-t-orf132、原核表达载体pgex-4t-1分别进行双酶切，并将重组克隆载体插入片段和双酶切后的原核表达载体进行连接，得到重组原核表达载体。实验条件如下：
酶切体系为：10×buffer2μl，ecori和xhoi各1μl，质粒1ug，补ddh2o水至20μl。37℃水浴酶切2h。酶切后，电泳鉴定酶切效果，并对重组克隆中载体插入片段0rf132和双酶切后的原核表达载体pgex-4t-1进行割胶回收。
连接体系：t4ligase1.5μl，10×t4ligasebuffer1.5μl，pgex-4t-13μl，酶切后的片段9μl。16℃连接，过夜。
将连接产物转化至dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液pcr。
将构建的重组原核表达载体pgex-4t-orf132进行双酶切鉴定，获得与预期大小相符的两条条带，表明重组原核表达载体构建成功。
3)蛋白表达
将鉴定正确的重组原核表达载体pgex-4t-orf132转化至大肠杆菌rosetta(de3)中，筛选阳性克隆，接种于含有氨苄的lb培养基中，在37℃下摇床培养至od600为0.4，加入终浓度为0.8mm的iptg进行表达诱导，4h后10000rpm/min离心5min收集菌体，进行少量表达鉴定。
将收集的菌体用pbs清洗2次后，重悬，在冰上超声波破碎，10000rpm/min离心5min，分别收集上清和包涵体沉淀，运用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)进行鉴定。
sds-page分析，结果显示获得与目的大小相符的蛋白条带，大小约为36kda(载体约为27kda，orf132第95～170位氨基酸预测蛋白分子量约为10kda)，且目的蛋白主要分布在包涵体中。
参照ni-凝胶纯化的方法对包涵体蛋白进行纯化，得到纯化的重组表达蛋白，其氨基酸序列是：
hrrrisrhfrklrprkwirddaetgsvidaatryndngydnpafveedddrcidtraasivgvvtnknqnrlkglr(seqidno:5)。
4)多克隆抗体制备与纯化
将纯化的重组表达蛋白对兔子进行皮下多点注射免疫(首次免疫采用弗氏完全佐剂，后三次免疫采用弗氏不完全佐剂，佐剂和重组表达蛋白体积比为1:1)，免疫66天后，进行颈动脉采血。将血液于37℃静置1h后，3000rpm/min离心10min，收集血清，用亲和纯化的方式对抗血清进行纯化，得到多克隆抗体，于-20℃下保存。
对比例
1)表达片段的特异性扩增
特异性引物为：
f:ccggaattcatgacgggttccaagattagcc(seqidno:6)，
r:ccgctcgagttatcatcttagaccttttagacgattttg(seqidno:7)。
pcr反应体系：12.5μlrtaqmix、引物各1μl(10umol/l)和1μldna模板，补灭菌水至25μl。
反应程序如下：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，30个循环；72℃，7min。
以f/r为引物，针对orf132基因全长，以鲤疱疹病毒3型1301株为模板进行pcr扩增，1.5％的琼脂糖电泳分析显示获得一条与预期大小相符的条带，片段大小为510bp。
2)重组原核表达载体pgex-4t-orf132的构建
对步骤一扩增的重组克隆载体pmd18-t-orf132、原核表达载体pgex-4t-1分别进行双酶切(酶为ecori和xhoi酶)，并将重组克隆载体插入片段和双酶切后的原核表达载体进行连接，得到重组原核表达载体。实验条件如下：
酶切体系为：10×buffer2μl，ecori和xhoi各1μl，质粒1ug，补ddh2o水至20μl。37℃水浴酶切2h。酶切后，电泳鉴定酶切效果，并对重组克隆中载体插入片段0rf132和双酶切后的原核表达载体pgex-4t-1进行割胶回收。
连接体系：t4ligase1.5μl，10×t4ligasebuffer1.5μl，pgex-4t-13μl，酶切后的片段9μl。16℃连接，过夜。
将连接产物转化至dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液pcr。
将构建的重组原核表达载体pgex-4t-orf132进行双酶切鉴定，获得与预期大小相符的两条条带，表明重组原核表达载体构建成功。
3)蛋白表达
将鉴定正确的重组原核表达载体pgex-4t-orf132转化至大肠杆菌rosetta(de3)中，筛选阳性克隆，接种于含有氨苄的lb培养基中，在37℃下摇床培养至od600为0.4，加入终浓度为0.8mm的iptg进行表达诱导，4h后10000rpm/min离心5min收集菌体，进行少量表达鉴定。
将收集的菌体用pbs清洗2次后，重悬，在冰上超声波破碎，10000rpm/min离心5min，分别收集上清和包涵体沉淀，运用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)进行鉴定。
sds-page分析，结果显示无蛋白表达。
实验例1
间接免疫荧光试验检测感染细胞
将锦鲤吻端细胞(ks细胞)传代至96孔细胞培养板中，待细胞长至单层铺满80％左右后，感染cyhv-31301株病毒；感染病毒5d后，将细胞培养板中的培养基吸尽，用0.01mol/l的pbs洗涤3次，加入80％的丙酮溶液室温孵育30min，吸去丙酮，室温干燥1h；每孔加100μl1：1000稀释的兔抗orf132蛋白多克隆抗体，37℃孵育1h，pbst洗涤3次，加入1:50稀释的羊抗兔igg-fitc标记的荧光二抗100μl，37℃孵育1h；pbst洗涤3次，最后加入细胞核染料碘化丙啶(pi)作用5min，荧光倒置显微镜(nikon，eclipseti-s)下观察结果。阴性对照为未感染病毒的正常ks细胞。
间接免疫荧光实验的结果显示，制备的截短基因表达多克隆抗体能使感染cyhv-31301毒株的ks细胞能产生特异性的荧光，而在未感染病毒的正常ks细胞中观察不到荧光信号，可以替代全长基因表达的多克隆抗体。
实验例2
利用elisa检测方法确定制备的兔抗orf132蛋白多克隆抗体的效价
将纯化的锦鲤疱疹病毒用包被液(ph8.6)稀释到30μg/ml，包被96孔酶标板，每孔加入100μl，4℃湿盒包被过夜。每孔加入300μl10％的脱脂乳进行封闭，37℃温箱中孵育1h，用pbst洗涤3次，每次3-5min。将制备的兔抗orf132蛋白多克隆抗体进行1：100倍、1：200倍、1：400倍、1：800倍、1：1600倍、1：3200倍梯度稀释，每孔加入100μl，37℃温箱中孵育1h，用pbst洗涤3次，每次3-5min。酶标二抗用pbst(ph7.4)作1:5000稀释，每孔加入100μl，37℃温箱中孵育1h，用pbst洗涤3次，每次3-5min。加入50μl显色底物(tmb)，37℃避光显色10min。用50μl2mol/lh2so4终止反应。测定各孔od450nm值，结果判断：od450nm≥0.20时判定为阳性。检出结果如下表所示：
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120>鲤疱疹病毒截短orf132基因重组表达蛋白、抗体及其应用
<130>
<160>7
<170>patentinversion3.5
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