贝类粗多糖中蛋白质的发酵脱除方法与流程

本发明涉及海洋贝类粗多糖中蛋白的脱除方法，具体的说涉及一种海洋贝类粗多糖中蛋白的微生物发酵脱除方法。

背景技术：

海洋贝类多糖是存在于海洋贝类体内的一种生物活性物质，海洋环境的特殊性赋予海洋多糖不同于陆地多糖的独特的合成途径，使其具有新颖的结构和功能，其主要成分是酸性黏多糖，基本单元由葡萄糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸4种成分组成，因其成分复杂，结构多变，导致其生物学活性存在差异。海洋贝类多糖具有抗衰老、抗肿瘤、抗病毒和提高免疫力，降低血糖、血脂、血压等多种生物学活性，有很高的药用价值和保健价值。然而其制备工艺多停留在实验室研究阶段，不如植物多糖的研究成熟，这主要是因为海洋贝类多糖大多与蛋白质结合成大分子的蛋白聚糖，造成提取的粗多糖纯度较低。因此，海洋贝类多糖加工利用的关键点在于蛋白质的去除和多糖活性的保持。

目前，粗多糖中蛋白质的脱除方法有三氯乙酸沉淀法及sevage法等化学方法。sevage法采用氯仿及戊醇等有机试剂使蛋白变性、沉淀，其处理条件温和，能较好地避免多糖降解，但处理效率低，常需要反复脱除，多糖损失严重。利用三氯乙酸沉淀蛋白，多糖提取率较高，但常伴有糖链降解。这些经典的蛋白质脱除方法适用于以科学研究为目的获得高纯度的多糖，但作为保健食品的活性多糖不推荐这类使用有毒有机试剂的方法，这在一定程度上制约了海洋贝类多糖的精深加工与应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种海洋贝类粗多糖中蛋白质的发酵脱除方法，方法不使用有机试剂，安全无毒。本发明所述的贝类粗多糖中蛋白质的发酵脱除方法包括以贝类粗多糖为唯一氮源进行微生物发酵的步骤，所述的微生物为酿酒酵母。

本发明成功地筛选出可用于海洋贝类粗多糖生物法除蛋白工艺的微生物，并基于此建立发酵脱除海洋贝类粗多糖中蛋白质的方法。所选出的微生物不仅可以有效去除海洋贝类粗多糖中的蛋白，并且为可食用益生菌，生物安全性高。本发明的方法去除海洋贝类粗多糖中蛋白质的同时保留多糖原始结构及活性；并且全工艺无有机试剂残留，安全可靠。

附图说明

本发明附图4幅：

图1是高产蛋白酶菌株的筛选实验结果。

图2是发酵菌株在线筛选实验结果。

图3是发酵前后多糖的单糖组成结果，其中图3(a)是发酵前粗多糖的单糖组成，图3(b)是发酵后多糖的单糖组成。

图4是发酵前后多糖的抗氧化活性比较，其中图4(a)是发酵前后多糖的羟基自由基清除率，图4(b)是发酵前后多糖的dpph自由基清除率。

具体实施方式

本发明关于贝类粗多糖中蛋白质的发酵脱除方法，包括以贝类粗多糖为唯一氮源进行微生物发酵的步骤，本发明的特征之处在于：所述的微生物为酿酒酵母。最为优选的是使用酿酒酵母eby100为发酵微生物。

较为具体的实施方式中，本发明所述的贝类粗多糖中蛋白质的发酵脱除方法包括如下步骤：

(1)以贝类粗多糖为氮原配制发酵培养基；

该步骤中所述及的贝类粗多糖优选为海洋贝类粗多糖，原则上通过现有技术中有载的技术方案制得的海洋贝类粗多糖均可以应用于本发明所述及的方案。优选地，所述海洋贝类粗多糖通过下述方法制备：

a.取海洋贝类去壳，清洗并沥干后，加入3倍体积蒸馏水匀浆，匀浆液于90℃水浴提取4h。

b.水提液于9000r/min条件下离心15min，收集上清液。

c.上清液经超滤浓缩后，喷雾干燥制得海洋贝类粗多糖，超滤优选截留分子量为10kda的参数设置。

更加优选地，所述的发酵培养基中含有：贝类粗多糖2-50g/l、葡萄糖2-40g/l、mgso4·7h2o0.1-1.0g/l，cacl20.05-0.2g/l，na2po4·7h2o0.5-2.0g/l，kh2po40.5-2.0g/l，nacl0.05-0.2g/l和nh4cl0.05-0.2g/l；所述的培养基ph值为7.0。

(2)接种酿酒酵母eby100，进行发酵培养；

该步骤中，酿酒酵母eby100的接种密度最优选为1％(v/v)。

发酵培养的条件可根据酵母菌培养特性设定，优选的条件包括：培养温度25-40℃，振荡频率100-200rpm，培养时间12-72h。优选30℃下振荡培养48小时。

(3)发酵结束后去除菌体并浓缩上清液；

该步骤中，去除菌体的方法可以选用离心或超滤的方法；所述浓缩上清液的方法为超滤或减压蒸馏，所述的超滤截留分子量为10-100kda。

(4)所得浓缩液经过干燥获得贝类粗多糖的脱蛋白产物。

该步骤中所述的干燥是喷雾干燥、冷冻干燥或是加热烘干，烘干温度可采用40-100℃。

本发明的海洋贝类粗多糖中蛋白质的发酵脱除方法，其实质是利用一种可以产生胞外蛋白酶但是不产生胞外糖苷酶的微生物，在以粗多糖中的蛋白质为唯一氮源的培养基中进行发酵，特异性消耗粗多糖中的蛋白质转化为菌体蛋白，并通过离心使菌体沉淀达到去除蛋白质的目的。该方法的适用对象为海洋贝类多糖粗提物。与现有的蛋白脱除方法相比，本发明的方法不使用有机试剂，去除海洋贝类粗多糖中蛋白质的同时保留多糖原始结构及活性，并且所用微生物为可食用益生菌，生物安全性高。

本发明中对方案结果进行表征，如无特殊说明，所采用了的检测方法包括：

1、贝类粗多糖的蛋白脱除率：

蛋白脱除率(％)＝(x1-x2)/x1×100％

上式中：x1发酵前粗多糖中蛋白质含量；x2发酵后多糖中蛋白质含量。

2、脱除蛋白后产品的单糖组成：精确称取多糖样品2mg放入10ml水解管中，垂直加入1ml2mol/l的三氟乙酸溶液，完全溶解后，自下而上向水解管中充氮气1-2min，封口后于110℃水解8h。取出冷却至室温，于50℃水浴锅中氮气吹干三氟乙酸。以0.3mol/l氢氧化钠溶液(约50ul)缓慢调节溶液ph，利用玻璃点样毛细管吸取少量液体于ph试纸测定至中性，利用超纯水定容至1ml。水解后的衍生及色谱条件参见chenj的方法(chenj,yangf,guoh,etal.optimizedhydrolysisandanalysisofradixasparagipolysaccharidemonosaccharidecompositionbycapillaryzoneelectrophoresis[j].journalofseparationscience,2015,38(13):2327-2331.)。

3、脱除蛋白后产品的分子量：多糖分子量的测定参见曹倩倩(曹倩倩.扇贝糖原硫酸酯的制备及生物活性研究[d].大连工业大学,2011.)的方法，采用sepharosecx-6b及sepharoseql-4b凝胶柱(800mm×10mm)层析，0.9％的nacl水溶液洗脱，流速0.18ml/min，分部收集，苯酚-硫酸法测多糖含量，将标准相对分子质量葡聚糖(5.0×10³、1.2×10⁴、8.0×10⁴、2.7×10⁵、4.1×10⁵、6.7×10⁵)，分别溶于双蒸水中，配制成1mg/ml的溶液，按分子量由小到大顺序分别进样，490nm下检测，记录吸光度值最大的管数，绘制lgmr-ve标准曲线。将样品分别溶于双蒸水中制成2mg/ml的溶液，于相同条件下进样分析，测算样品的相对分子量。

4、脱除蛋白后产品的抗氧化活性：

(1)羟基自由基(·oh)清除能力测定：分别吸取不同浓度的多糖溶液1ml，依次加入3ml2mmol/lfeso4，3ml1mmol/lh2o2摇匀后，再加入3ml6mmol/l水杨酸，37℃水浴60min后取出，静置60min，于在510nm处测定吸光度a1；用3ml蒸馏水代替1mmol/lh2o2作为本底，测定吸光度a2；用1ml95％乙醇代替样品液为空白对照并测定吸光度a0。测定时以95％乙醇作为参比，计算清除率。另取vc作为阳性对照组。

·oh清除率(％)＝1-(a1-a2)/a0×100％

上式中：a0空白对照吸光度值；a1样液的吸光度值；a2本底的吸光度值。

(2)dpph·自由基清除能力的测定：分别吸取不同浓度的多糖溶液2ml，加入2mldpph，25℃水浴反应30min，于517nm测定其吸光度值ai；2ml样液，加2ml95％乙醇，25℃水浴30min后，测定吸光度aj，2mldpph溶液加2ml蒸馏水25℃水浴30min后，测定吸光度a0。另取vc作为阳性对照组。

dpph·清除率(％)＝a0-(ai-aj)/a0×100％

上式中：a0空白对照吸光度值；ai样液的吸光度值；aj本底的吸光度值。

下述非限制性实施例用于进一步说明本发明，不应当理解为对本发明任意形式的限定。

实施例1

菌株筛选：本发明结合考虑菌株需无毒无害且具可食用性的特点，选择了细菌和酵母菌等共8个菌株进行筛选。

(1)高产蛋白酶菌株的筛选

本实施例考察参测菌株的胞外蛋白酶活性，具体方法参照中华人民共和国行业标准sb/t10317-1999。

筛选结果显示，参测微生物共8株，包括4株细菌和4株酵母，测定各菌株对数中期发酵上清液中的蛋白酶活性，结果如图1所示，在8株参测微生物中，酿酒酵母atcc9763的胞外蛋白酶活性最高。

(2)菌株在线测试

配制含有虾夷扇贝粗多糖的培养基(虾夷扇贝购自大连海洋岛水产集团股份有限公司，产地：大连海洋岛东部川蹄沟海域)，其中含有扇贝裙边粗多糖10g/l、葡萄糖5g/l、mgso4·7h2o0.5g/l，cacl20.1g/l，na2po4·7h2o1.0g/l，kh2po41.0g/l，nacl0.5g/l，nh4cl1.0g/l，ph值为7.0；培养基灭菌后接入参测微生物，30℃下振荡培养48小时。所得菌体培养液经离心去除菌体，保留上清液。所得上清液以截留分子量30kda的超滤膜进行超滤浓缩后，喷雾干燥获得不同菌株发酵条件下的扇贝裙边粗多糖的脱蛋白产物。

所述的参测微生物包括：谷氨酸棒杆菌atcc13032、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母eby100、酿酒酵母atcc9763、毕赤酵母、产朊假死酵母。

检测结果如图2所示，可见：在8株参测微生物中，酿酒酵母atcc9763的胞外蛋白酶活性最高，结果如图1所示，但在实际发酵粗多糖实验中，酿酒酵母eby100的蛋白去除率最高，结果如图2所示。酿酒酵母eby100分泌的胞外蛋白酶活性较酿酒酵母atcc9763略低，但对海洋贝类蛋白质的专一性更强，因此，在8株参测微生物中，选择酿酒酵母eby100作为发酵微生物。

实施例2

配制含有虾夷扇贝粗多糖的培养基(虾夷扇贝购自大连海洋岛水产集团股份有限公司，产地：大连海洋岛东部川蹄沟海域)，其中含有虾夷扇贝粗多糖10g/l、葡萄糖5g/l、mgso4·7h2o0.5g/l，cacl20.1g/l，na2po4·7h2o1.0g/l，kh2po41.0g/l，nacl0.5g/l，nh4cl1.0g/l，ph值为7.0；培养基灭菌后接入酿酒酵母，30℃下振荡培养48小时。所得菌体培养液经离心去除菌体，保留上清液。所得上清液以截留分子量30kda的超滤膜进行超滤浓缩后，喷雾干燥获得虾夷扇贝粗多糖的脱蛋白产物。经上述处理，虾夷扇贝粗多糖中蛋白含量由54.23±2.10％降至3.69±0.26％，蛋白脱除率为93.20％。所得虾夷扇贝粗多糖脱蛋白产物的单糖组成、分子量以及抗氧化活性检测结果如表1以及图3和图4所示。

表1

如表1所示，发酵前后多糖分子量分别为1.85×10³kda和1.79×10³kda，经过发酵，多糖分子量略有降低。图3(a)和图3(b)分别为发酵前后多糖的单糖组成，由图可以看出，发酵前后多糖的单糖组成相同，发酵后的多糖单糖组成中，甘露糖和岩藻糖的含量略有降低。图4(a)和图4(b)分别为羟基自由基清除率和dpph自由基清除率，从图中可以看出，发酵前后多糖的抗氧化活性并无显著差异。

实施例3

配制含有菲律宾蛤仔粗多糖的培养基(虾夷扇贝购自大连海洋岛水产集团股份有限公司，产地：大连海洋岛东部领前海域)，其中含有菲律宾蛤仔粗多糖10g/l、葡萄糖5g/l、mgso4·7h2o0.5g/l，cacl20.1g/l，na2po4·7h2o1.0g/l，kh2po41.0g/l，nacl0.5g/l，nh4cl1.0g/l，ph值为7.0；培养基灭菌后接入酿酒酵母，30℃下振荡培养48小时。所得菌体培养液经离心去除菌体，保留上清液。所得上清液以截留分子量30kda的超滤膜进行超滤浓缩后，喷雾干燥获得菲律宾蛤仔粗多糖的脱蛋白产物。经上述处理，菲律宾蛤仔粗多糖中蛋白含量由18.43±1.67％降至2.25±0.43％，蛋白脱除率为87.80％，所得菲律宾蛤仔粗多糖脱蛋白产物的单糖组成、分子量以及抗氧化活性均无显著变化。

除了实施例中说明的虾夷扇贝和菲律宾蛤仔粗多糖外，本法同样适用于牡蛎、鲍鱼以及贻贝的粗多糖；去除菌体的手段可为过滤或离心；浓缩手段可为超滤或减压蒸馏；培养温度可为25-40℃，培养时间可为12-72h；超滤处理的截留分子量可为10-100kda；干燥可为喷雾干燥、冷冻干燥或加热烘干。