基因CKX2和CKX3在提高植物抗寒能力中的应用的制作方法

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及基因ckx2和ckx3在提高植物抗寒能力中的应用。

背景技术：

在自然和农业生产条件下，植物不断遭受各种来自生物与非生物胁迫。人们已掌握的科学技术手段能够有效克服，如土壤营养缺乏，缺氧，病原菌侵染和杂草竞争等一些逆境环境因素。近年来随着全球气候异常，极端温度对植物的不利影响日渐凸显。2008年我国南方经历了一场历史罕见的低温冰冻灾害，连续的冰冻天气给农业生产造成了巨大的影响。全国受灾面积达1.5万hm²，直接经济损失大1590亿元，远超同年由干旱，洪涝及风雹等灾害造成的危害。

由于灾害的无法预知性和较高的防护成本，目前在实际生产中还没有有效的科学技术手段应用于预防极端温度对作物的危害，因此获得抵御灾害环境胁迫能力的优良农艺性状作物品种，在农业生产中有重要的实际应用价值。为此，人们一直致力于研究植物耐受低温的分子机制，旨在为作物抗逆工程、培育作物抗冷抗旱品种提供重要的理论依据。在逆境条件下，植物激素能够调控植物生长发育，影响多种代谢途径及逆境响应基因的应答过程，使植物从形态、生化及细胞水平来适应不断变化的外界环境。细胞分裂素是在植物根部产生的异戊烯腺嘌呤类物质，与生长素协同作用共同调控着植物组织和器官的生长和分化。长久以来人们利用细胞分裂素来促进植物细胞增多，延缓植物的衰老及诱导愈伤组织的分化。近年来由研究发现，细胞分裂素在植物对逆境的响应过程同样具有重要的生理功能。

拟南芥中存在一条不可逆的细胞分裂素代谢途径。这条途径由细胞分裂素氧化酶(cytokininoxidase/dehydrogenase,ckx)参与，能够将有活性的细胞分裂素降解。拟南芥中发现7个编码细胞分裂素氧化酶的基因atckx1-7。过量表达ckx基因的转基因植物种子明显增大。在水稻中，一个主要qtl基因osckx2对水稻的产量具有重要的作用。而在转基因烟草和拟南芥的根中特异过量表达ckx基因，能显著促进根系生长发育和抗旱能力。2007年研究人员发现，外源施加细胞分裂素能够大大提高向日葵的抗旱能力；同时，过表达atckx能够促进拟南芥根系的生长同样能提高植物对干旱逆境的耐受能力。2010年研究发现，拟南芥中细胞分裂素受体ahk2,3的单突和多突变体表现出很强的对低温耐受能力，说明在植物响应低温逆境的过程中，细胞分裂素的信号途径具有负调控作用。尽管ckx基因已经成为作物分子遗传改良的重要靶点，但是其在植株响应低温逆境过程中的作用目前还未见报道和应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供基因ckx2和ckx3在提高植物抗寒能力中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的基因ckx2和ckx3在提高植物抗寒能力中的应用，所述基因ckx2cdna的核苷酸序列为：

i)seqidno:1所示的核苷酸序列；或

ii)seqidno:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与seqidno:1所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

所述基因ckx3cdna的核苷酸序列为：

i′)seqidno:2所示的核苷酸序列；或

ii′)seqidno:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或

iii′)在严格条件下与seqidno:2所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv′)与i′)、ii′)或iii′)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

ckx2和ckx3基因来源于哥伦比亚生态型拟南芥，它们编码植物内源细胞分裂素合成与代谢的关键酶，在拟南芥基因组数据库中对应的编号分别为at2g19500和at5g56970。由ckx2和ckx3基因编码的氨基酸序列分别如seqidno.3和4所示。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。

应理解，考虑到密码子的简并性及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明还提供含有植物耐低温的ckx2和/或ckx3基因序列或其片段的克隆载体或各类表达载体，含有所述载体的宿主细胞，含有所述基因序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。

本发明所述植物包括单子叶植物和双子叶植物，例如拟南芥等。将植物耐低温ckx2和/或ckx3基因在植物中过表达，包括利用任一种可以引导外源基因在植物中过表达的载体进行。

本发明还提供一种提高植物抗寒能力的方法，通过在植物中过表达基因ckx2和/或ckx3，从而提高植物对低温的耐受性；

本发明还提供一种构建耐低温的转基因拟南芥的方法，所述方法具体为：提取拟南芥总rna，反转录获得cdna，以cdna为模板，f和r为引物，扩增ckx2或ckx3基因，将扩增产物分别构建到植物表达载体上，然后用获得的重组表达载体分别转化农杆菌，接着用转化的农杆菌分别侵染拟南芥花序，筛选阳性转基因植株，分别获得耐低温的转基因拟南芥；

其中，用于扩增ckx2基因的引物序列如seqidno.5和6所示；

用于扩增ckx3基因的引物序列如seqidno.7和8所示。

本发明使用的植物表达载体为具有35s启动子的表达载体，例如载体pbinhygtx。

前述的方法，优选所述农杆菌为gv3101。

前述方法中，所述拟南芥优选为野生型拟南芥植株，即具有纯合基因型的拟南芥植株。

将本发明的ckx2和ckx3基因过表达后，拟南芥表现为耐低温的表型。为了便于对转基因拟南芥植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物等。

本发明通过对编码拟南芥细胞分裂素代谢途径关键酶(细胞分裂素氧化酶)的基因研究，发现过表达相关基因的转基因植株能够产生新的抗低温逆境相关性状，说明这些基因能够通过改变植物体内源细胞分裂素的含量和稳态，参与调控植物对低温逆境的耐受能力。本发明提供的ckx2和ckx3基因为培育耐低温植物新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值，为研究植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中ckx2、ckx3连入过表达载体的酶切胶图；其中，1为dnamarker；2为ckx2片段；3为ckx3片段。

图2为本发明实施例2中半定量rt-pcr检测转基因植株中的目的基因表达；其中，a为ckx2基因表达水平检测；b为ckx3基因表达水平检测。

图3为本发明实施例3中在非冷驯化和冷驯化条件下，ckx2或ckx3的转基因植株的抗低温表型分析(a)及存活率统计(b)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如分子克隆实验方法，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中pbinhygtx克隆载体为常用的克隆载体，可市购；拟南芥品种为哥伦比亚生态型；农杆菌gv3101菌株常用的克隆载体。

以下实施例中的主要试剂为：分子克隆相关实验产品均购自invitrogen公司；taqdna聚合酶、t4连接酶、pyrobesttaq酶、kod、购自neb、toyobo等生物公司；dntps购自genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自axygen公司；ms培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素(amp)、卡那霉素(kan)、硫酸庆大霉素(gen)、利福平(rif)等抗生素以及蔗糖(glucose)、牛血清白蛋白(bsa)、硝酸纤维素膜、lb培养基等购自sigma、bio-rad等公司；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。

实施例中所使用的引物由六合华大公司合成，并进行相关测序。

实施例1ckx2或ckx3基因过表达载体的构建

为了解细胞分裂素含量对植物抗冻能力的影响，我们将目标锁定能够参与调控植物抗干旱和高盐逆境响应的细胞分裂素代谢途径的氧化酶ckx2和ckx3。从拟南芥(arabidopsisthaliana)基因组中克隆了ckx2和ckx3基因。根据编码区序列分析，设计引物1～4，将基因ckx2和ckx3的编码区扩增出来，分别连接到过表达载体pbinhygtx上。

引物1：ckx2-f:5’-gtcgacgttgtaattctcttcttcaaaaa-3’(seqidno：5)

引物2：ckx2-r:5’-ggtacctcaaaagatgtcttgccctgg-3’(seqidno：6)

引物3：ckx3-f:5’-gtcgacaagaatcaagctattcataa-3’(seqidno：7)引物4：ckx3-r:5’-ggtaccctaactcgagtttatttttt-3’(seqidno：8)

构建35s:ckx2/3的具体方法为:将ckx2或ckx3基因5'和3'分别加上sali或kpni限制性位点进行扩增，回收pcr产物(分别为3,104bp，3,397bp)，连接到克隆载体puc19上。得到通过抗性筛选后的阳性克隆菌斑，试剂盒小量提取质粒并送测序，测序正确表明puc19载体中已分别连入ckx2或ckx3基因。再在将ckx2，ckx3片段进行酶切回收，连入过表达载体35s启动子驱动的pbinhygtx上，得到通过抗性筛选后的阳性克隆菌斑，提取质粒进行酶切胶图见图1。

实施例2ckx2或ckx3基因过表达植物的构建和检测

将实施例1所述含有ckx2或ckx3基因的pbinhygtx载体分别转化到农杆菌gv3101菌株中，再分别转入野生型拟南芥植株中，得到拟南芥转基因幼苗。具体方法为：将含有目的载体的农杆菌接种于100mllb三抗液体培养液(卡那霉素50μg/ml，利福平50μg/ml，庆大霉素50μg/ml)中，28℃振荡培养过夜，待od600值为1.0-2.0，以5000rpm，室温离心10min，收集菌体；用200ml转化液(1/2ms，5％蔗糖，40μlsilwetl-77)悬浮菌体；将拟南芥花序浸泡在农杆菌的转化液中1min，套上保鲜袋保湿并置于黑暗处使其温度较低，第二天将植物从保鲜袋中取出，放回光照培养架上正常生长至收种。

pbinhygtx载体所带筛选抗性基因为潮霉素，用潮霉素抗性对拟南芥转基因幼苗进行筛选，获得的t1代具有潮霉素抗性的阳性苗进行单株收种，再对t2代种子进行潮霉素抗性的测试，选择3/4具有抗性而其余1/4没有抗性的株系，说明在该株系中连有目的基因的过表达载体以单拷贝形式插入。将这些株系中具有潮霉素抗性的植株移出，再进行单株收种，用获得的t3代种子再进行潮霉素抗性筛选，如果t4代植株没有分离，说明该转基因株系为纯合体，该纯合体可以用于繁种、低温逆境处理实验。

本实施例中分离得到过表达株系。采用半定量pcr检测转基因植株中的目的基因表达。

1)用trizol法提取转基因植株的rna。

2)反转录合成cdna第一链(25μl体系)

①取总rna1-2μg，加depc水至12μl；②加入2μl(10pm)oligo(dt)15混匀；③70℃，5分钟，然后放在冰上2-3min，然后加入：5×buffer5μl，2.5mmdntp5μl,200u/μl反转录酶h1μl；④反转录反应(cdna第一链合成)在pcr仪上进行，使用如下程序：42℃，60分钟；⑤反应结束后取出，加入10mg/ml1μldnase，然后在37℃放置20分钟，然后65℃10min。

3)半定量rt-pcr扩增。反应体系根据所需按如下pcr扩增体系：10×taq缓冲液1.5μl；dntp混合物各200μmol/l；上、下游引物各10pmol；模板cdna1μg；taqdna聚合酶0.8μl；补ddh2o至15μl。按以下条件扩增：95℃预变性3min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，共20-35个循环；72℃延伸10min，20℃保存。tubulin作为内参基因。目的基因ckx2和ckx3的表达情况见图2。从图2可以看出ckx2和ckx3的过表达株系中相应目的基因均有不同程度的上调。

实施例3过表达ckx2或ckx3基因植株的低温耐受相关表型分析

细胞分裂激素在调控植物生长发育和对环境因素响应过程中起着至关重要的作用。以往的文献报道冷驯化(coldacclimation)过程能够有效提高植物的抗冻能力。其内在机制是一段零上低温的适应过程能够激活植物冷响应基因表达的迅速升高，在胞内积累大量的渗透物质和保护蛋白，使植物更好的适应随后的零下低温。本实施例中冷驯化条件设定为正常光照下4℃生长4天。

首先让过表达ckx2和ckx3的转基因植株的幼苗生长2周，然后对培养板进行低温处理，处理时间为-1℃至-6℃梯度降温，并在-6℃-件下处理1小时。处理后的培养板转移至4℃黑暗条件放置过夜。然后将其在正常光照条件下培养3-4天。低温中受伤的组织会在培养过程中黄化枯死，而能够抵抗低温伤害的组织逐渐变绿并恢复生长(图3a)。处理后的培养板进行存活率统计，依赖标准为生长点能够变绿并长出新叶。图3b显示，在冷响应前过表达ckx2和ckx3的转基因植株在-5℃处理1小时后，存活率为90％，而野生型仅为35％。经过冷响应后的野生型幼苗存活率升高至55％，但仍显著低于转基因植物95％的存活率。由此可得出结论，细胞分裂素代谢途径关键酶的过量表达能够增强植物的抗冻能力。

通过构建过表达载体得到了内源细胞分裂素降低的拟南芥转基因植株。然后通过半定量pcr证明这些转基因植株中目的基因都发生了表达水平的上调。以上实验结果表明，过表达细胞分裂素代谢途径关键酶的转基因植株表现出增强的抗冻能力。以下述实施例说明其获得方法及其功能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>基因ckx2和ckx3在提高植物抗寒能力中的应用

<130>khp171116963.5

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1667

<212>dna

<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)

<400>1

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