一种翻译水平基因表达调控的方法及应用与流程

本发明属于生物医学和分子生物学领域，涉及一种基因表达调控方法，具体涉及一种增强型基因表达调控元件进行翻译水平基因表达调控的方法及应用。
背景技术：
：当前，基因工程技术已经成为生产包括药用蛋白的多种人类所需的药物和活性物质和基因靶向治疗产品的重要方法。在基因工程生产
技术领域：
，基因表达水平是影响目标产物的收率的前期关键因素。高水平的基因表达是基因工程领域人员的重要目标。真核基因表达调控技术多年来已经成为在生物医学研究领域和基因工程领域的重要热门方向。当前基因工程领域的真核基因表达调控，最明显的特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现“预定”的，有序的，不可逆的分化和发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常的生理功能。真核生物基因表达调控据其性质可分为两大类：第一类是瞬时调控或叫可逆调控，相当于原核生物对环境条件变化所做出的反应。瞬时调控包括某种代谢底物浓度或激素水平升降时及细胞周期在不同阶段中酶活性和浓度调节。第二类是发育调节或称不可逆调控，这是真核生物基因表达调控的精髓，因为它决定了真核生物细胞分化，生长，和发育的全过程。据基因调控在同一时间中发生的先后次序，又可将其分为转录水平调控，转录后的水平调控，翻译水平调控及蛋白质加工水平的调控。通常认为基因产物的表达程度是和基因转录的强度成正比，常用的基于慢病毒为载体的转基因表达调节系统方案，大都是通过调节转染基因的转录从而实现对基因表达产物的调节。现有技术对真核基因表达的调控方式主要是组织特异性启动子在不同的细胞中的活性差异，驱动目的基因在靶器官组织中的特异性表达。在相关研究中常常发现，尽管期望的转染基因使用系统的方案实现了成功高效的转录，但并不是所有的基因转录产物都可以高效的表达为作为最终功能执行者的蛋白质。其中有较大的概率出现转录后不翻译或者翻译效率极低的现象，形成限制真核生物基因工程和靶向生物治疗发展的瓶颈。。技术实现要素：本发明的目的是提供一种增强型基因表达调控元件，及其与目标基因的嵌合编码结构和该嵌合编码结构的构建方法，上述结构和方法在上调或激活转录后翻译水平调控基因表达中和在制备真核蛋白或治疗疾病的药物中的应用。具体涉及在目标产物基因起始密码子上游加入本发明提供的增强型基因表达调控元件，从而在翻译水平激活目标产物的方法，解决基因工程领域中目标产物转录后不翻译或翻译水平低下的缺陷。本发明是通过以下技术方案实现的:本发明的第一方面，提供了一种增强型基因表达调控元件。所述增强型基因表达调控元件可将目标基因转录后的翻译水平提高达10倍～20倍，所述增强型基因表达调控元件具有如seqno.1所示或与seqno.1所示序列同源性为65～99％的核苷酸序列。进一步地，本发明的增强型基因表达调控元件(以下简称seqno.1)是与目标产物核苷酸序列连接为嵌合体后，通过病毒转染等手段整合在宿主染色体dna上，进而发挥激活翻译的功能。本发明的第二方面，提供了seqno.1与目标产物的核苷酸嵌合编码结构。其中所述核苷酸嵌合编码结构，包含5’到3’顺次连接的seqno.1和目标产物核苷酸编码序列。seqno.1是在所述目标产物核苷酸序列翻译起始密码子atg的上游，seqno.1的3端与所述目标产物核苷酸翻译起始密码子之间间隔1～20个碱基，优选1～10个碱基，更优选1～5个碱基，最优选0个碱基。本发明的第三方面，提供了包含seqno.1的具有提高表达目标产物转录后翻译水平功能的核苷酸嵌合体的构建方法，包括步骤：(1)所述增强型基因表达调控元件seqno.1序列的设计与合成。(2)引物序列的设计与合成。所述引物序列包含5’引物和3’引物，设计与合成的引物见实施例1。5’引物包含载体的部分核苷酸序列(其含有限制性内切酶位点bamhi)，完整的seqno.1和目标产物编码基因的部分起始序列；3’引物包含目标产物编码基因的部分末端序列及载体的部分核苷酸序列(其含有限制性内切酶位点ecori)。seqno.1序列的设计与合成是与引物的设计与合成同时进行的。(3)利用dna聚合酶链式反应，以目标基因的cdna为模板采用上述合成的引物对，通过克隆pcr合成含有seqno.1的完整目标基因序列(嵌合体结构)。本发明的第四方面，提供了真核蛋白高效表达的方法包括步骤1.目标蛋白编码基因表达调控嵌合体的pcr扩增合成2.目标基因表达质粒构建3.能稳定高效诱导表达目标蛋白编码基因能力的哺乳动物细胞系的构建。4.目标蛋白编码基因的诱导表达。5.诱导表达量的检测在一些实施方式中，步骤2包括(1)重组慢病毒的制备、提纯及浓缩；(2)通过病毒感染和抗性筛选形成稳定表达反式激活因子rtta-advanced的哺乳动物细胞(3)通过病毒感染和puromycin抗性筛选形成稳定表达目标蛋白的哺乳动物细胞在一些实施方式中，目标蛋白编码基因为brafv600e基因。在一些实施方式中，哺乳动物细胞为黑色素瘤细胞。在一些实施方试中，抗性筛选标记为geneticin抗性。在一些实施方试中，抗性筛选标记为puromycin抗性。在一些实施方式中，步骤2构建表达质粒的起始质粒为plvx-tight-puro。本发明的第五方面，提供了包含第一方面所述的增强型基因表达调控元件和第二方面所述的核苷酸嵌合编码结构的遗传功能载体。在一些实施方式中，遗传功能载体为质粒。在一些实施方式中，作为遗传功能载体的质粒包括plvx-tet-onadvancedvector，plvx-tight-puro，pmd2.g，pspax2。本发明的第六方面，提供了第一方面所述的增强型基因表达调控元件在上调或激活转录后翻译水平调控目标蛋白编码基因表达中的用途。本发明的第七方面，提供了第一方面所述的增强型基因表达调控元件或第二方面所述的核苷酸嵌合编码结构、第五方面所述的遗传功能载体在制备真核蛋白或治疗疾病的药物中的应用。进一步地，所述疾病包括肿瘤、炎性疾病。进一步的，也可用于在蛋白质制剂生产中提高产量，特别是所生产蛋白质长时间持续表达对宿主细胞产生毒性时，此系统提供的瞬时高产能力可大大降低生产成本。本发明的有益效果：本发明可用于提高转基因表达蛋白质的效率和稳定性解决转基因科研和应用中存在或可能存在的基因高转录,低表达问题，为基因的功能研究以及基因治疗提供更好的技术手段，可以预期，一种即可有效提高目标基因转录产物的翻译水平，又可与诱导表达系统结合，使得在研究特定蛋白质在不同表达强度下的生物功能的技术成为可能进而可促进基因工程产业和生物靶向治疗产业的发展。附图说明图1.将目标基因插入plvx-tight-puro质粒的模式图图2.双酶切的plvx-tight-puro重组质粒胶电泳的凝胶紫外成像其中，泳道0为dnamarker(1kbplusdnaladder)(购自invitrogen)，泳道1和2为实施例plvx-tight-puro重组质粒bamhi内切酶和ecori双酶切后所得片段。图3.本发明实施例1提到的plvx-tight-puro载体图图4.pmd2.g载体图谱(addgene)图5.pspax2载体图谱(addgene)图6.本发明实施例3plvx-tet-onadvanced载体图图7.黑色素瘤细胞系skmel19被分别通过三个不同调控序列构建的brafv600e基因的嵌合编码结构转染后brafv600e的表达产物及活性的免疫印迹法检测图谱。通过perk(磷酸化的erk)的强度来呈现，图片中印迹的面积和灰度与brafv600e表达产物成正比。a.cognate:braf基因自身的编码区上游调控序列b.kozak:科扎克共有序列c.seq.no.1:本发明人研究开发的高效调控序列图8.表达效果的曝光法定量测试结果对比。在给定时间内,图1中印迹图像的曝光强度和蛋白质的表达强度成正比。a.cognate:braf基因自身的编码区上游调控序列b.kozak:科扎克共有序列c..seqno.1:本发明人研究开发的高效调控序列。以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，这些实施例是较典型的例子，本发明不限于这些实施例。具体实施方式为了解决目前真核蛋白基因工程常出现的转录后翻译量少或不翻译为蛋白的问题，本申请的发明人通过对多种高表达各阶段调控序列的分析，比较，比对，通过大量的设计筛选甄别，研究开发出一种新的增强型基因调控元件(如seqno.1所示)，提供了一种增强基因表达调控的方法。seqno.1可以添加到期望表达的目标产物翻译起始密码子的上游构成嵌合编码结构，这样的嵌合编码结构可显著提高目标产物基因的转录后翻译水平。本发明目标基因表达调控嵌合体重组质粒的构建过程中，某些实施方试中，用常规的限制性内切酶分别切除载体和目标基因，过夜连接后回收连接产物的操作；在一些实施方式中，也可以in-fusion克隆(宝生物工程(大连)有限公司)将此嵌合体结构插入到plvx-tight-puro质粒中。使用in-fusionhdcloningplus系统(clontech)，任何寡核苷酸/pcr片段(20bp至15kb)或多个片段可以在单次反应中定向克隆到任何线性化载体中。in-fusion克隆的技术优势如下：1.不需要任何限制性内切酶、连接酶，也不需要磷酸化、末端补平等操作，2.双酶切线性质粒自身不会发生重新联合，所以不会形成不含有目标基因的空质粒；3.同源重组的特异性保证了基因插入的方向，不会发生反向插入，不必要进行传统的通过pcr验证是否成功连接目标基因，以及根据限制性酶切图谱判断目标基因插入方向的检测；4.in-fusion克隆的技术在15分钟内，能将任何pcr产物片段定向克隆到任何载体上。本发明的真核蛋白高效表达方法一些实施方式中，宿主细胞可以是酵母表达系统，哺乳动物细胞表达系统，植物细胞表达系统。在一些实施方式中，宿主细胞为哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主，其优势在于能正确有效地识别真核蛋白的合成、加工和分泌信号，识别和去除基因中的内含子，再经剪切加工成为成熟的mrna，能准确地完成糖基化、磷酸化，形成链内和链间二硫键及蛋白水解等翻译后加工过程，从而保证蛋白的天然活性，哺乳动物细胞易被重组的dna转染，经过筛选可得到转化的细胞，具有遗传稳定性和可重复性。表达的产物分泌到培养基中易于纯化。利用哺乳动物细胞表达蛋白产物已广泛应用于生物制品工业，如病毒疫苗、抗体、干扰素、免疫调节剂、激素、和生长因子等的大量制备。目前如动物细胞已成为表达和生产部分蛋白药物、基因工程抗体等目的蛋白的首选宿主。在一具体实施例中，本发明采用宿主细胞为黑色素瘤细胞系。在一些实施方式中，嵌合体外源基因进入真核细胞中表达的方式可以是瞬时表达，也可以是稳定表达。在一具体实施例中，目标真核蛋白转录后翻译表达调控嵌合体的重组质粒，通过质粒转导和病毒载体的感染转染到哺乳动物细胞细胞系。利用质粒转导获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中。可将目的基因导入哺乳动物细胞表达的病毒载体分为两类：整合型如sv40病毒载体、逆转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。目前常用的可将目的基因导入哺乳动物细胞表达的质粒载体包括plvx-tight-puro，pcdna3.1、psi、pcmv-ha、pbudce4.1和ptre.除了质粒表达载体以外，病毒介导的基因转移也是将外源dna引入不同类型细胞的有效而方便的方法，载体的选择取决于外源基因的导人方式和其调控元件是否有利于转录和翻译。真核生物基因高表达载体必须具有如下调控元件：①原核dna序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便于筛选的抗生素抗性基因，以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。②启动子和增强子；③剪接信号；④终止信号和polya加尾信号。为了将含目的基因的载体导入哺乳动物细胞，还必须加入选择标记。常用的标记基因有共表达的荧光蛋白，新霉素(neo)抗性基因、氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因、嘌呤霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、青霉素抗性基因等。动物细胞培养中，抗性筛选重组子的需要的抗性标记可通过病毒转染获得。病毒转染是通过细胞表面受体介导的，所以提高病毒与转染细胞接触是转染的关键，慢病毒载体可以转导广泛的细胞类型，并且在分裂细胞和不分裂细胞中整合到宿主基因组中，从而在体外和体内长期表达转染基因。通常病毒转染中，质粒转导会采用化学法和物理法。化学法包括脂质体转导技术、deae葡聚糖法、磷酸钙共沉淀法，物理法包括电穿孔法和显微注射法。优选化学法，更有优选脂质体转导法。在一实施方试中，本发明的嵌合体是通过第二代慢病毒三质粒包装系统转染到宿主细胞。在一非限制性具体实施例中，病毒包装系统为pmd2.g质粒，pspax2质粒和plvx-tet-onadvanced构成慢病毒包装系统。pmd2.g质粒是用于慢病毒生产的信封质粒。由巨细胞病毒(cmv)启动子驱动的水泡性口炎印第安纳病毒蛋白g(vsv-g)的哺乳动物表达。它在细菌中含有氨苄青霉素抗性。pspax2质粒是用于产生人源免疫缺陷病毒1(hiv-1)衍生的慢病毒的第二代包装质粒，其编码源自hiv-1的gag/pro/pol基因。启动子是鸡β肌动蛋白启动子，多聚腺苷酸化信号是兔β球蛋白polya。plvx-tet-onadvanced载体组成型表达在cmv启动子控制下的四环素控制的反式激活因子rtta-advanced。除了慢病毒元素外，该载体含有用于选择稳定转导子的遗传霉素抗性基因。载体还含有puc复制起点和用于细菌繁殖和选择的大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因(ampr)。哺乳动物细胞对培养环境十分敏感，营养和生长因子缺乏、缺氧、病毒感染、毒性代谢物的积累、机械搅动以及培养压力的增加等很多固素都可诱导细胞凋亡。为获得产物的大量有效表达，必须控制细胞在达到最适表达产物期停止增殖。本发明采用高效、无毒、具有严密开关功能(trtswitch)的可诱导性基因表达系统，仅受诱导物初浓度的影响，终产物中诱导物自发降解，有利于下游的纯化过程。常用于真核蛋白表达的诱导物包括目前比较成熟的诱导表达系统主要有4种:四环素诱导表达系统,蜕皮激素(ecdysone)诱导表达系统,他克莫司(tacrolimus,fk506)/雷帕霉素(rapamycin)诱导系统和ru486诱导系统(参见此文献https://wenku.baidu.com/view/2720a13143323968011c92d3.html)在本发明的一具体实施例中，目标蛋白基因为brafv600e基因。brafv600e基因置于一个受到诱导调控的启动子下，其表达受到启动子的严格限制。rtta-advanced蛋白质在没有盐酸多西霉素的条件下是不能结合到启动子上从而启动brafv600e的转录，当盐酸多西霉素和rtta-advanced蛋白结合，rtta-advanced蛋白发生构像变化，此时其结合到启动子上并激活brafv600e的转录。为了实现brafv600e的可诱导表达，先要将表达rtta-advanced蛋白的基因用慢病毒插入skmel19细胞中，从而形成持续表达rtta-advanced蛋白的skmel19细胞，并且于此同时传入了遗传霉素抗性，使得不能表达rtta-advanced蛋白的skmel19细胞可以通过添加遗传霉素杀灭。接着在表达rtta-advanced的skmel19细胞引入brafv600e基因，与此同时也引入了嘌呤霉素抗性，通过嘌呤霉素筛选可将不含有brafv600e基因但表达rtta-advanced蛋白的skmel19细胞消除。本发明可用于解决转基因科研和应用中存在或可能存在的基因高转录,低表达问题。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法实施例1原癌基因brafv600e表达调控嵌合体的和含嵌合体的表达质粒的构建1.携带真核基因增强表达调控序列ctcccaga(seq.no.1)和原癌基因brafv600e(seqno.2)的表达调控嵌合体的制备原癌基因brafv600e表达调控嵌合体的结构ctcccagacatggcggcgctgagcggt…tcctgtccactga波浪线下划线的字体为seq.no.1所示的增强型表达调控序列，双划线部分为brafv600e基因编码区，加粗标记为编码区起始翻译密码子atg，二者共同构成嵌合体。为实现此嵌合体结构以及便于将此嵌和体结构插入plvx-tight-puro质粒中，需要设计引物对序列)，其包含部分plvx-tight-puro质粒(clontechlaboratories)序列，完整的seq.no.1序列和部分brafv600e基因序列(seqno.2)的起始序列，再利用dna聚合酶链式反应，以brafv600e基因的cdna为模板合成出上述嵌合体结构。(1)引物设计：模板brafv600ecdna来源于sebastianhaferkamp实验室,(维尔茨堡,德国)1.2seq.no.1所示的增强型表达调控序列和brafv600e基因嵌合体制备：(1)引物设计5′端引物gcctggagaaggatccctcccagacatggcggcgctgagcggt(如seqno.3所示)，3′端引物ctacccggtagaattctcagtggacaggaaacgcacc(seqno.4所示)引物合成由biomers.net公司完成。(2)表达调控嵌合体的制备和提纯：以brafv600e的cdna为模板进行克隆pcr扩增，反应体系如表1所示。表1:本发明的seq.no.1序列所示的增强型调控元件和brafv600e基因嵌合体的克隆pcr反应物配比brafv600ecdnas来自sebastianhaferkamp(würzburg，germany)反应程序为：pcr反应步骤如下2.携带步骤1所得的表达调控嵌合体的重组plvx-tight-puro质粒的制备重组plvx-tight-puro质粒的制备是利用in-fusion克隆技术将此嵌合体结构插入到plvx-tight-puro质粒(clontechlaboratories)(如图3所示)中。(1)plvx-tight-puro质粒的双酶切为将1所得的嵌合体插入plvx-tight-puro质粒(clontechlaboratories,inc.)，需要对plvx-tight-puro质粒实施双酶切，双酶切反应体系如表2所示:表2对plvx-tight-puro质粒实施5′--bamhi和3′--ecori双酶切反应物配比为反应混合物用量plvx-tight-puro质粒1.5微克(μg)bamhi内切酶2微升(μl)ecori内切酶1微升(μl)10xtango缓冲液4微升(μl)h2o调至总体积20微升(μl)酶切反应：将此混合何物在37℃反应2小时。(2)双酶切后的plvx-tight-puro质粒通过糖琼脂凝胶电泳分离，结果如图2所示。(3)割胶，提纯双酶切后的plvx-tight-puro质粒在长波紫外灯下观察，用清洁的刀片在目的片段前切下与目的片段同长，宽度适当(一般2cm左右)的胶块。置于新的灭菌的1.5mlependorf管中，用qiagengelextractionkit(qiagen,hilden)提取bamhi和ecori内切酶双酶切后的plvx-tight-puro质粒，提纯操作及条件参见qiagengelextractionkit的产品说明书(5)携带本发明的增强型表达调控序列和brafv600e基因的嵌合体的重组质粒载体形成利用in-fusion克隆试剂盒(clontechlaboratories,inc.)将步骤1所得的表达调控嵌合体和双酶切后的plvx-tight-puro载体进行融合反应。融合反应按照in-fusioncloning制造商说明书的方案进行。实施例2.稳定高效诱导表达brafv600e基因编码的蛋白产物1.利用lenti-xtmtet-advanced系统(clontechlaboratories,inc)建立能稳定高效诱导表达brafv600e基因的黑色素瘤细胞系skmel19。1.1重组慢病毒的制备、提纯及浓缩按以下步骤分别制备携带反式激活因子rtta-advanced基因的重组慢病毒和携带brafv600e基因的重组慢病毒通过磷酸钙转导方法分别将携带反式激活因子rtta-advanced和brafv600e基因的质粒和病毒包装质粒转导入293t细胞中，进行慢病毒包装和制备。携带brafv600e基因的慢病毒制备具体操为：(1)将13×106个293t(来自美国模式培养物保藏所(atcc))细胞接种在t175培养盒(corningincorporated,货号:431080)中。将3.5μl编码慢病毒的蛋白质外壳的质粒pmd2.g(addgeneplasmid#12259)，6.5μg编码慢病毒包装结构蛋白的质粒pspax2(addgeneplasmid#12260)和10μg携带brafv600e基因的表达质粒(重组plvx-tight-puro，制备方法同实施例1携带嵌合体的重组plvx-tight-puro的制备)分别加入到15ml试管中的5mlh2o中，然后加入500μl2mcacl2溶液并很好地混合，接着用移液管(corningincorporated,货号4011)将550μl2×bbs溶液(sigmaaldrichchemiegmbh,taufkirchen)加入到上述混合物中，在加入时使用10ml电子移液管(corningincorporated)将空气吹入混合物，之后将混合物在室温(rt)下静置30分钟，使得形成的晶体细小而且均匀，晶体中包裹着转导的质粒，然后向t175培养盒(corningincorporated,货号:431080)中的细胞滴加，4小时后，换新的培养基。(2)转染后，分别在第2和第3天收集含有慢病毒(美国genecopoeia)的细胞培养液于50ml试管中，并以2000rpm离心10分钟(megafuge1.0r)以沉淀细胞碎片。将去除细胞残渣的上清液移入超速离心机试管(guidechem)中，并以17000rpm(zk401)和4℃的条件下，离心2小时。移去上清液，并尽量不要扰动附着于试管壁上的病毒沉淀。最后将半透明的病毒沉淀用500μldmem培养液(sigmaaldrichchemiegmbh,taufkirchen)重新溶解，并分装为20μl为一份的病毒溶液，将其储存在-80℃冰箱(hfu586(heraeus))中。除了表达质粒为携带反式激活因子的重组plvx-tight-puro，携带brafv600e基因的的慢病毒制备方法同携带反式激活因rtta-advanced的慢病毒。1.2通过病毒感染形成稳定表达反式激活因子rtta-advanced的黑色素瘤细胞将5x105个黑色素瘤细胞系skmel19(meenhardherlyn,wistarinstitut,philadelphia,usa)种植于t25细胞培养盒(corningincorporated，货号:431080)中，第二天，将50μl含有rtta-advanced基因的慢病毒与2μl聚凝胺(sigmaaldrichchemiegmbh)(4μg/μl)混合并静置5分钟。将靶细胞置于室温并吸出培养基，并将1ml新鲜dmem培养基(sigmaaldrichchemiegmbh,taufkirchen)与病毒载体混合，完全转移到细胞中，并在5％co2，37℃的条件下，在培养箱中培养过夜。在第二天，移除含有病毒细胞的培养液，并用5ml的pbs清洗一遍，然后将5ml新鲜培养液加入细胞中，继续培养48小时。含有rtta-advanced基因的慢病毒感染的黑色素瘤细胞系skmel19具有遗传霉素抗性。为了将未被转染的细胞杀死，细胞培养液中添加500μg/ml遗传霉素(gibco,schwerte),直至未转导的细胞被完全杀死，从而形成稳定表达rtta-advanced的skmel19细胞系。1.3用携带brafv600e基因的重组病毒转染稳定表达反式激活因子rtta-advanced的黑色素瘤细胞skmel19，形成能够诱导表达brafv600e基因的黑色素瘤细胞skmel19。将5x105个含反式激活因子rtta-advanced的黑色素瘤细胞skmel19种植于t25细胞培养盒中，第二天取50微升高滴度包含brafv600e基因的慢病毒与2微升的聚凝胺(4μg/μl)(sigmaaldrichchemiegmbh,taufkirchen)混合并静置5分钟，然后将其与1ml细胞培养液混合备用。取出前一天种植的细胞，吸去培养液，用5ml的pbs清洗一遍；将1ml的配置好的、含有重组病毒的培养液加入细胞培养盒中，并在5％co2，37℃的条件下，在培养箱中培养过夜，然后吸去含有重组病毒的培养液，并用pbs清洗细胞，然后添加5ml新鲜细胞培养液于细胞培养盒中，继续将稳定表达反式激活因子rtta-advanced的黑色素瘤细胞与包含有brafv600e基因的慢病毒共培养48小时。含有brafv600e基因的慢病毒感染的黑色素瘤细胞系skmel19具有嘌呤霉素抗性。为了将未被转染的细胞杀死，细胞培养液中添加10μg/ml的嘌呤霉素，直至未转导的细胞被完全杀死，从而形成可诱导表达brafv600e的skmel19细胞系。2.brafv600e基因的诱导表达将细胞种植在六孔细胞培养板(美国康宁)上，每孔0.5x106个细胞，并在每孔添加2ml细胞培养液rpmi1640(包含10％fbs,1％青霉素和链霉素)(gibco,schwerte)，并置于heracell240co2incubatorbbd6220细胞培养箱(heraeus)5％co2，37℃过夜。第二天吸除细胞培养液，添加2毫升含有2微克/毫升盐酸多西霉素(sigmaaldrichchemiegmbh,taufkirchen)于细胞培养液中，并培养24小时。吸除培养液，用1mlpbs(sigmaaldrichchemiegmbh,taufkirchen)清洗细胞，然后收集并用200μl细胞裂解液(cellsignaling)裂解细胞用于蛋白质表达分析。实施例3.免疫印迹法检测鉴定经诱导后brafv600e基因在黑色素瘤细胞系skmel19的表达水平1.分别以cognate(braf基因自身的编码区上游调控序列)；kozak(科扎克共有序列)和本发明人研究开发的高效调控序列seqno.1作为brafv600e基因编码序列的调控序列，与brafv600e基因构成嵌合体，构建重组质粒(构建步骤与实施例1相同),制备重组慢病毒载体，转染，步骤同实施例1和2。2.粘附细胞的裂解：将细胞用1ml预冷的pbs(sigmaaldrichchemiegmbh)洗涤一次。将适200μl预冷的裂解液加入到细胞中。用细胞刮刀刮下细胞。将细胞裂解物收集在1.5ml试管中，并短暂超声处理，然后在冷却的微型离心机(biofugepico)中以14,000重力(g)旋转10分钟。收集上清液使用。3.蛋白质浓度测定将bio-rad溶液(bio-radlaboratories，货号500-0001)用蒸馏水1:5稀释。将2μl样品加入到96孔板中的198μl制备的bio-rad溶液(bio-radlaboratories)中，使用酶标仪(berthold)在595nm测量。为了计算样品的蛋白质浓度，使用一系列在水中稀释至最终浓度为0(blank和mackensen)，156.25,312.5,625,1250和2500μg/ml的蛋白质标准品(牛血清白蛋白bsa)(货号:pc0001-14.品牌:solarbio)产生标准曲线。15～30μg蛋白质用于免疫印迹。4.蛋白质凝胶电泳4.1sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳制胶按表3加样制成胶块，在mini-protean(bio-rad))电泳槽进行sds凝胶电泳。电泳前，将蛋白质样品与laemmli加样缓冲液(2×)合并，并在95℃加热5分钟，冷却，每道泳道加载15-30μg蛋白质到制备的凝胶上。凝胶在70伏电压下运行10分钟，然后在120伏电压下，继续运行90分钟。表3.本发明诱导细胞表达产物目标brafv600的sds凝胶电泳凝胶体系电泳缓冲液配制laemmli加样溶液(6×)，组成为：10ml1m三羟甲基氨基甲烷tris(ph6.8)30ml甘油(glycerin)12g十二烷基硫酸钠(sds)30μlβ-巯基乙醇50μg溴酚蓝指示剂(sigmaaldrichchemiegmbh,taufkirchen，sigma/amresco货号020-86540309)加ddh2o补足100ml；电泳缓冲液(5×)，组成为：15.1gtris(base)94g、glycin和5gsds；加ddh2o补足1升4.2蛋白质印迹(1)转膜：为便于蛋白质检测，将凝胶内分离开的蛋白质通过电泳转移到由聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(rocheappliedscience，3010040001)上，具体实施如下:pvdf膜先在甲醇泡5min，滤纸(roth,karlsruhe)在转膜缓冲液中泡10分中。凝胶电泳结束后，取出凝胶，上部切除浓缩胶，下部以分子量标准最小分子带下一点全部划去。将含brafv600e基因表达产物蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶直接与一块pvdf和3个滤纸直接接触，然后将其夹在浸在导电溶液中的两个电极之间。在电极中按照以下顺序放置:正电极/滤纸/膜/凝胶/滤纸/负电极，每层去气泡。进行转膜阶段电泳:施加25个电压的电场过夜，使得蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中移出并到达膜的表面，其中蛋白质紧密连接。转膜缓冲液配制方法为：5.8gtris(base)2.9gglycin0.37gsds200mlmethanoladdh2oto1litre(2)阻止膜的剩余表面以防止在随后的步骤中检测抗体的非特异性结合：首先用tbst缓冲液清洁附着检测蛋白的纤维素膜(美国bio-rad公司，货号:162-0115)，为避免抗体蛋白的非特异性结合，纤维素膜(美国bio-rad公司，货号:162-0115)，与含有5％脱脂牛奶(cellsignalingtechnology)的tbst缓冲液在室温下震荡反应1小时，封闭抗体的非特异性结合。同时将perk(cellsignalingtechnology，货号:3179l)的抗体以1:1000的比例稀释在含有5％脱脂牛奶的tbst备用。在封闭后，将纤维素膜(美国bio-rad公司，货号:162-0115)，与抗体溶液在温和搅拌下(rm5，)置于4℃过夜。第二天，用tbst缓冲液冲洗膜三次，每次10分钟。因为在western印迹中识别靶蛋白的一抗不是可直接检测的，所以使用交联了辣根过氧化物酶(hrp)的抗抗体(cellsignaling)进行检测。将抗抗体以1:5000的比例在含有5％脱脂牛奶的tbst中稀释，然后与纤维素膜在室温下柔和震荡反应1小时；随后将膜用tbst缓冲液冲洗三次，每次5分钟。tbst的组成：2.42gtris(base)8g氯化钠1nnaoh调节ph到ph7.6with,rt加ddh2o至补足1升加1mltween20曝光定量法由于二抗被辣根过氧化物酶(hrp)标记，其可与其地物发生反应产生可见光，可见光的强度与被检测蛋白质的表达量成正比。将700毫升反应底物(amershameclprimewesterblottingdetectionreagent，gehealthcarelifescience,schwerte)均匀覆于膜表面，1分钟后排干多余的反应液并将膜塑封，然后将膜与x射线胶片(x-rayfilmkodakx-omat，eastmankodakcompany,rochester)与塑封的膜叠放在暗盒(dr.goos-supremagmbh)中，产生的荧光信号被胶片记录，为避免过度曝光造成曝光强度与蛋白质表达量失去线性相关性，分别对其进行不同时间点的曝光检测并确定其合适的曝光时间，本实施例中选取30秒曝光时长。brafv600e是持续激活的蛋白激酶，其可以引起erk蛋白的磷酸化，并且brafv600e的表达强度和erk蛋白的磷酸化程度在一定范围内成正比，所以通过perk(磷酸化的erk)的磷酸化强度可以来呈现brafv600e的表达强度，如图7所示，图片中印迹的面积和灰度与brafv600e表达产物成正比。胶片中获得的灰度信号是利用网络分析软件scionimage(nihimage,http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)进行的定量分析在指定时间内图像的曝光强度和蛋白质的表达强度成正比，通过计算图8中图像的曝光强度可知以seq.no.1为调控序列所表达的蛋白质强度分别是以cognate和kozak为调控序列的18.85倍和18.75倍。免疫印迹法和曝光定量法的测定结果显示，本发明的seqno.1所示的增强型基因表达调控元件及其构成的嵌合体，可显著提高真核蛋白的翻译后表达量，在真核蛋白表达科研及真核蛋白药物、靶向治疗领域中具有重要的商业前景。以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施。但本发明的保护范围不限于上述实施例。序列表<110>张宝会，王骏<120>一种翻译水平基因表达调控的方法及应用<130>20171027<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2301<212>dna<213>designed<400>1atggcggcgctgagcggtggcggtggtggcggcgcggagccgggccaggctctgttcaac60ggggacatggagcccgaggccggcgccggcgccggcgccgcggcctcttcggctgcggac120cctgccattccggaggaggtgtggaatatcaaacaaatgattaagttgacacaggaacat180atagaggccctattggacaaatttggtggggagcataatccaccatcaatatatctggag240gcctatgaagaatacaccagcaagctagatgcactccaacaaagagaacaacagttattg300gaatctctggggaacggaactgatttttctgtttctagctctgcatcaatggataccgtt360acatcttcttcctcttctagcctttcagtgctaccttcatctctttcagtttttcaaaat420cccacagatgtggcacggagcaaccccaagtcaccacaaaaacctatcgttagagtcttc480ctgcccaacaaacagaggacagtggtacctgcaaggtgtggagttacagtccgagacagt540ctaaagaaagcactgatgatgagaggtctaatcccagagtgctgtgctgtttacagaatt600caggatggagagaagaaaccaattggttgggacactgatatttcctggcttactggagaa660gaattgcatgtggaagtgttggagaatgttccacttacaacacacaactttgtacgaaaa720acgtttttcaccttagcattttgtgacttttgtcgaaagctgcttttccagggtttccgc780tgtcaaacatgtggttataaatttcaccagcgttgtagtacagaagttccactgatgtgt840gttaattatgaccaacttgatttgctgtttgtctccaagttctttgaacaccacccaata900ccacaggaagaggcgtccttagcagagactgccctaacatctggatcatccccttccgca960cccgcctcggactctattgggccccaaattctcaccagtccgtctccttcaaaatccatt1020ccaattccacagcccttccgaccagcagatgaagatcatcgaaatcaatttgggcaacga1080gaccgatcctcatcagctcccaatgtgcatataaacacaatagaacctgtcaatattgat1140gacttgattagagaccaaggatttcgtggtgatggaggatcaaccacaggtttgtctgct1200accccccctgcctcattacctggctcactaactaacgtgaaagccttacagaaatctcca1260ggacctcagcgagaaaggaagtcatcttcatcctcagaagacaggaatcgaatgaaaaca1320cttggtagacgggactcgagtgatgattgggagattcctgatgggcagattacagtggga1380caaagaattggatctggatcatttggaacagtctacaagggaaagtggcatggtgatgtg1440gcagtgaaaatgttgaatgtgacagcacctacacctcagcagttacaagccttcaaaaat1500gaagtaggagtactcaggaaaacacgacatgtgaatatcctactcttcatgggctattcc1560acaaagccacaactggctattgttacccagtggtgtgagggctccagcttgtatcaccat1620ctccatatcattgagaccaaatttgagatgatcaaacttatagatattgcacgacagact1680gcacagggcatggattacttacacgccaagtcaatcatccacagagacctcaagagtaat1740aatatatttcttcatgaagacctcacagtaaaaataggtgattttggtctagctacagag1800aaatctcgatggagtgggtcccatcagtttgaacagttgtctggatccattttgtggatg1860gcaccagaagtcatcagaatgcaagataaaaatccatacagctttcagtcagatgtatat1920gcatttggaattgttctgtatgaattgatgactggacagttaccttattcaaacatcaac1980aacagggaccagataatttttatggtgggacgaggatacctgtctccagatctcagtaag2040gtacggagtaactgtccaaaagccatgaagagattaatggcagagtgcctcaaaaagaaa2100agagatgagagaccactctttccccaaattctcgcctctattgagctgctggcccgctca2160ttgccaaaaattcaccgcagtgcatcagaaccctccttgaatcgggctggtttccaaaca2220gaggattttagtctatatgcttgtgcttctccaaaaacacccatccaggcagggggatat2280ggtgcgtttcctgtccactga2301<210>2<211>2310<212>dna<213>designed<400>2ctcccagacatggcggcgctgagcggtggcggtggtggcggcgcggagccgggccaggct60ctgttcaacggggacatggagcccgaggccggcgccggcgccggcgccgcggcctcttcg120gctgcggaccctgccattccggaggaggtgtggaatatcaaacaaatgattaagttgaca180caggaacatatagaggccctattggacaaatttggtggggagcataatccaccatcaata240tatctggaggcctatgaagaatacaccagcaagctagatgcactccaacaaagagaacaa300cagttattggaatctctggggaacggaactgatttttctgtttctagctctgcatcaatg360gataccgttacatcttcttcctcttctagcctttcagtgctaccttcatctctttcagtt420tttcaaaatcccacagatgtggcacggagcaaccccaagtcaccacaaaaacctatcgtt480agagtcttcctgcccaacaaacagaggacagtggtacctgcaaggtgtggagttacagtc540cgagacagtctaaagaaagcactgatgatgagaggtctaatcccagagtgctgtgctgtt600tacagaattcaggatggagagaagaaaccaattggttgggacactgatatttcctggctt660actggagaagaattgcatgtggaagtgttggagaatgttccacttacaacacacaacttt720gtacgaaaaacgtttttcaccttagcattttgtgacttttgtcgaaagctgcttttccag780ggtttccgctgtcaaacatgtggttataaatttcaccagcgttgtagtacagaagttcca840ctgatgtgtgttaattatgaccaacttgatttgctgtttgtctccaagttctttgaacac900cacccaataccacaggaagaggcgtccttagcagagactgccctaacatctggatcatcc960ccttccgcacccgcctcggactctattgggccccaaattctcaccagtccgtctccttca1020aaatccattccaattccacagcccttccgaccagcagatgaagatcatcgaaatcaattt1080gggcaacgagaccgatcctcatcagctcccaatgtgcatataaacacaatagaacctgtc1140aatattgatgacttgattagagaccaaggatttcgtggtgatggaggatcaaccacaggt1200ttgtctgctaccccccctgcctcattacctggctcactaactaacgtgaaagccttacag1260aaatctccaggacctcagcgagaaaggaagtcatcttcatcctcagaagacaggaatcga1320atgaaaacacttggtagacgggactcgagtgatgattgggagattcctgatgggcagatt1380acagtgggacaaagaattggatctggatcatttggaacagtctacaagggaaagtggcat1440ggtgatgtggcagtgaaaatgttgaatgtgacagcacctacacctcagcagttacaagcc1500ttcaaaaatgaagtaggagtactcaggaaaacacgacatgtgaatatcctactcttcatg1560ggctattccacaaagccacaactggctattgttacccagtggtgtgagggctccagcttg1620tatcaccatctccatatcattgagaccaaatttgagatgatcaaacttatagatattgca1680cgacagactgcacagggcatggattacttacacgccaagtcaatcatccacagagacctc1740aagagtaataatatatttcttcatgaagacctcacagtaaaaataggtgattttggtcta1800gctacagagaaatctcgatggagtgggtcccatcagtttgaacagttgtctggatccatt1860ttgtggatggcaccagaagtcatcagaatgcaagataaaaatccatacagctttcagtca1920gatgtatatgcatttggaattgttctgtatgaattgatgactggacagttaccttattca1980aacatcaacaacagggaccagataatttttatggtgggacgaggatacctgtctccagat2040ctcagtaaggtacggagtaactgtccaaaagccatgaagagattaatggcagagtgcctc2100aaaaagaaaagagatgagagaccactctttccccaaattctcgcctctattgagctgctg2160gcccgctcattgccaaaaattcaccgcagtgcatcagaaccctccttgaatcgggctggt2220ttccaaacagaggattttagtctatatgcttgtgcttctccaaaaacacccatccaggca2280gggggatatggtgcgtttcctgtccactga2310<210>3<211>43<212>dna<213>designed<400>3gcctggagaaggatccctcccagacatggcggcgctgagcggt43<210>4<211>37<212>dna<213>designed<400>4ctacccggtagaattctcagtggacaggaaacgcacc37当前第1页12