一株防治白术根腐病的菌株BZJN1及其制备方法和应用与流程

本发明涉及菌株领域，具体涉及一株防治白术根腐病的菌株bzjn1及其制备方法和应用。

背景技术：

白术(atractylodesmacrocephala)属于菊科、苍术属多年生草本植物，具有健脾益气，燥湿利水等功效，有重要的药用价值，是多种处方的原料药。目前白术亩产值约5000元，纯利润可达3000元，白术产业对于稳步推进贫困山区经济发展、社会稳定有重大的作用和意义。白术根腐病一直困扰白术产业的进一步壮大和发展。白术根腐病广泛分布于湖南、湖北、贵州、重庆等白术出产区，集中发生在5-8月，染病后根部变褐，后期黑色，腐烂，最终植株彻底死亡，根腐病导致白术平均减产15％以上，有些田块的损失超过40％，最高发病率达到70-90％，该病具有很强的传染性，可伴随农事操作、雨水、染病种根等方式传染。游景茂通过试验证明造成白术根腐病的主要致病菌为角担菌(ceratobasidiumsp.)，这是在国内首次报道该致病菌可以导致白术根腐病。目前针对白术角担菌防治的研究较少，国内外鲜有报道。因为缺乏有效的防治措施和科学的指导，白术种植户滥用乱用各种化学药剂，一方面增加了病原菌的抗药性，杀灭大量有益微生物，同时增加了白术农药残留，污染了土壤、水等生态环境。因此利用生物防治的方法防治白术根腐病具有很好的推广价值和生态效益。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一株防治白术根腐病的菌株bzjn1及其制备方法和应用。

为实现上述目的，发明人从健康的白术茎内分离得到一株防治白术根腐病的菌株bzjn1，通过鉴定证明其为枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)，其16srrna在ncbi的登录号为mf357899，于2017年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：cctccm2017518。；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。本发明的菌株bzjn1为需氧菌，单个菌体直径为0.5～0.7×2～3微米。无荚膜，周生鞭毛。革兰氏阳性，芽孢0.7～0.9×1.1～1.4微米，椭圆型。菌落表面粗糙不透明，白色或微黄色，在马铃薯葡萄糖液体培养基中摇菌培养72h后呈微黄色。

所述菌株bzjn1的16srdna序列如seqidno：1所示。

本发明还提供了上述一株防治白术根腐病的菌株bzjn1的制备方法，包括如下步骤：

s1、将内生细菌bzjn1用接种环取一环后涂布于pda培养基上，30℃培养72h；

s2、将步骤1活化好的bzjn1单菌落移入100mlpdb液体培养基的250ml锥形瓶中，200转/min、28℃下培养72h，获得发酵种子液；

s3、将步骤2中发酵种子液接种量按照1∶150(v∶v)的比例接种于含有100mlpdb的锥形瓶，然后置于振荡器中，30℃，200转/min，发酵72小时，保证活菌体浓度达到1×10¹¹cfu/ml以上即可。

其中，所述步骤s1中pda固体培养基通过以下步骤制备所得：取马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂10g混合搅拌均匀后，补充蒸馏水至1000ml，调节ph至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min，即得。

其中，所述步骤s2中pda固体培养基通过以下步骤制备所得：取马铃薯200g、葡萄糖20g混合均匀后，补充蒸馏水至1000ml，调节ph至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min，即得。

上述的一株防治白术根腐病的菌株bzjn1可用于防治白术根腐病，经验证，所述菌株bzjn1对白术角担菌具有明显的抑制作用，可以导致白术角担菌菌丝膨大畸形，匮竭和原生质泄露。当所述菌株bzjn1的浓度达到1×10⁹cfu/ml时，防治效果达75.27％，和化学药剂相当。

本发明的生防细菌bzjn1来源于白术体内，和白术自身循环系统具有良好的兼容性；制作简单且成本低，无毒、无害、及无环境污染，有利于安全有效的控制白术根腐病，同时有利于白术的绿色栽培，保护农田生态系统，实施白术产业的可持续发展。该菌剂有利于改良白术种植土壤，增加土壤中的微生物多样性。通过平板拮抗实验及不同浓度发酵上清液拮抗试验，表明：生防菌bzjn1菌剂对白术角担菌具有明显的抑制作用，可以导致白术角担菌菌丝膨大畸形，匮竭和原生质泄露。田间防治实验证明，bzjn1生防菌剂在菌体浓度达到1×10⁹cfu/ml防治效果达75.27％，和化学药剂相当，可以使白术的产量增加约14.1％，株高比清水对照高11.9％。

附图说明

图1为菌株bzjn1以及对照组对白术角担菌生长的影响；

图中：1-菌株bzin1和角担菌对峙图；2-对照组。

图2为共培养中菌株bzjn1对角担菌菌丝的影响。

图中：a为对照；b为共培养时，对峙区域角担菌菌丝形态；b中1为菌丝顶端膨大畸形，2为菌丝匮竭。

图3为不同浓度的bzjn1发酵滤液对角担菌菌丝生长的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

生防菌bzjn1的分离、筛选和鉴定

生防菌bzjn1分离于湖北省恩施市白术茎内，取健康白术茎，剪成5cm长度后用75％酒精消毒1min，用无菌水冲洗3次，无菌条件下风干，去除表皮后兑无菌水水研磨，吸取混合液稀释后涂布于pda平板上，30℃，培养72小时，挑取单菌落纯化培养。

将白术根腐病致病菌角担菌放置于pda平板中央，在距离角担菌3cm处，按照十字交叉法放置分离得到的白术内生细菌，3天后待对照长满皿，测量细菌菌落外缘到角担菌菌丝的距离，重复3次，选择距离最小的细菌作为后期研究使用。

生防菌bzjn1单个菌体0.5～0.7×2～3微米。无荚膜，周生鞭毛。革兰氏阳性，芽孢0.7～0.9×1.1～1.4微米，椭圆型。菌落表面粗糙不透明，白色或微黄色，在马铃薯葡萄糖液体培养基中摇菌培养72h后曾微黄色。需氧菌。

利用细菌dna提取试剂盒g1n9602-1kt(sigma)提取生防菌bzjn1的dna，采用27f和1492r两个引物扩增其16srdna序列，进行测序，其16srdna序列详见seqidno.1，序列在ncbi中的比对结果显示与枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的同源性达到100％。

实施例2

生防菌bzjn1菌剂的制备

s1、将内生细菌bzjn1用接种环取一环后涂布于pda培养基上，30℃培养72h。pda固体培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，补充蒸馏水至1000ml，调ph至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min。

s2、将步骤s1活化好的bzjn1单菌落移入100mlpdb液体培养基的250ml锥形瓶中，200rmp、28℃下培养72小时，获得发酵种子液。pdb液体培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，补充蒸馏水至1000ml，调ph至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min。

s3、将步骤s2中发酵种子液接种量按照1∶150(v∶v)的比例接种于含有100mlpdb的锥形瓶，然后置于振荡器中，30℃，200rmp，发酵72h，保证活菌体浓度达到1×10¹¹cfu/ml以上即可，然后生产后的菌剂置于4℃冰箱保存。

平板对峙拮抗试验

按照方中达《植病研究方法》中的平板对峙培养试验方法，对生防菌bzjn1对白术角担病菌的抑制效果进行评价，同时灭菌蒸馏水对照处理组病菌菌丝长满平板时统计，抑菌率(％)＝(对照组致病菌菌落直径一处理组致病菌菌落直径)/对照组致病菌菌落直径×100％。结果证明生防菌bzjn1对白术角担菌生长抑制率为73.75％(如图1所示)。

对峙区白术角担菌菌丝显微观察

在生防菌bzjn1和白术角担菌对峙区域，用显微镜(尼康e100生物显微镜)观察角担菌菌丝形态。结果显示对峙区域白术角担菌菌丝膨大畸形，匮竭和原生质泄露(如图2所示)。

实施例3

生防菌bzjn1发酵上清液对白术角担菌的影响

取活化好的bzjn-1菌液500μl注入100mlpdb中，28℃，180r/min培养72h，得到发酵原液。取发酵原液12000r/min离心10min，收集上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤得发酵滤液。取滤液和约50℃的pda混合，使滤液的终浓度为3％和6％，待冷却后在平板中央接种角担菌菌丝块(直径0.5cm)，设置空白对照，每个处理三个重复，置于28℃培养箱中培养。待对照长满皿(4天)后测量菌落的直径，计算抑制率。抑制率(％)＝(对照组致病菌菌落直径-处理组致病菌菌落直径)/对照组致病菌菌落直径×100％。结果证明生防菌bzjn1发酵滤液在3％和6％两个浓度下均可显著抑制角担菌的生长，二者的抑制率分别为22.7％和38.7％，二者抑制率之间存在显著性差异(如图3所示)。

实施例4

生防菌bzjn1对白术根腐病田间防效

试验点设于湖北省恩施市三岔乡湖北省农业科学院中药材研究所白术试验田。试验田前茬作物为白术，从上年发生根腐病的白术上分离的致病菌主要为角担菌，种植过程中各项操作均一致，不使用其他化学药剂。种植时间为2013年3月20日，天气晴，选择一年生大小均一的白术根茎移栽，栽前用bzjn1的发酵原液稀释为1×10⁹cfu/ml、1×10⁸cfu/ml和1×10⁷cfu/ml，浸种30min，晾干后种植。试验共设置1个小区，每小区面积为15m²，10株/m²，共150株，设3个重复，以生防药剂25亿芽孢/克坚强芽孢杆菌700倍液体，化学药剂30％苯甲·丙环唑2000倍液为阳性对照，清水为阴性对照。于2013年4月20日按照各药剂推荐浓度灌根，每株约50ml，施用3次，间隔7d，末次药后10d和20d统计发病率及病情指数，每小区5点取样，每点调查10株。分级标准：0级，无病；1级，根茎有少量病斑；3级，根茎病斑较多，维管束褐色，尚未木质化；5级，病根有部分开始腐烂，腐烂部分占根茎体积30％以下；7级，腐烂部分占根茎体积30％以上，地上部植株萎蔫变黄；9级：根茎腐烂，植株枯死。根据分级标准计算各药剂的防效。末次药后30d，调查上述处理对白术生长的影响，每小区五点取样，每点取2株，统计株高和根茎重量，计算平均株高及根茎重，同时观察是否有药害产生。分级标准：0级，无病；1级，根茎有少量病斑；3级，根茎病斑较多，维管束褐色，尚未木质化；5级，病根有部分开始腐烂，腐烂部分占根茎体积30％以下；7级，腐烂部分占根茎体积30％以上，地上部植株萎蔫变黄；9级：根茎腐烂，植株枯死。根据分级标准计算各药剂的防效。病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/(总株数×最高病级代表值)；防效(％)＝100×(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数。实验结果证明，在10d时，生防菌bzjn11×10⁹cfu/ml的防效达到了75.27％，1×10⁸cfu/ml的防效为72.64％，和30％苯甲·丙环唑乳油的防效无差异，在20d时生防菌bzjn11×10⁹cfu/ml防效为72.37％，和30％苯甲·丙环唑乳油的防效无显著差异。在安全性评价方面，所有处理白术平均株高均高于对照，最高的为1×10⁹cfu/ml处理，平均每株株高达到33.25cm，1×10⁸cfu/ml处理的白术平均株高为32.33cm，二者之间无差异，1×10⁷cfu/ml处理的白术平均株高为32.15cm，三个处理中最低。各处理平均根部鲜重均高于对照，最高的为1×10⁹cfu/ml处理，平均每株达到18.37g，比对照多出2.27g，增产达到14.1％；其次为1×10⁸cfu/ml，比对照高1.92g，增产达到11.9％，以上两个处理之间无显著性差异；1×10⁷cfu/ml、25亿芽孢/克坚强芽孢杆菌、30％苯甲·丙环唑和清水对照处理之间无显著性。在药后多次观察发现，内生菌bzjn1所有处理未发现叶片灼伤和急性药害症状，各个处理植株长势正常，处理区域白术枯死时间比对照推迟约7-10天，证明内生细菌bzjn1对白术安全，无危害性。(如表1所示)。

表1不同处理对白术根腐病田间防治效果

表中数据为平均值±标准差。同列中不同小写字母表示差异显著p＜0.05

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。