一株中度嗜盐芳香族污染物降解菌及其应用的制作方法

【技术领域】

本发明涉及菌种技术领域，具体地说，是一株中度嗜盐多环芳烃降解菌及其应用。

背景技术：

多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons,pahs)是指两个或两个以上苯环以线状、角状、簇状排列组成的碳氢化合物，其主要来源于化石燃料的不完全燃烧和石油产品的泄漏等，森林火灾、火山爆发等自然过程也会排放pahs，且它们能够在环境中逐渐积累。大部分pahs具有共轭双键π电子，可以吸收紫外光，发射荧光，是最早被发现的具有“三致作用”(致癌、致畸、致突变)的环境污染物之一，并被证实还具有环境激素的作用。因此多环芳烃在环境中的分布及其对人体健康潜在的威胁已引起世界各国的高度重视。许多国家都将一系列多环芳烃列入优先检测污染物。1976年美国环保局(environmentalprotectionagency,epa)将苊、苊烯、芴、萘、菲、蒽等16种pahs确定为必须要首先控制的污染物，并作为环境污染的检测参数。1992年,国家环保总局公布了水中优先控制污染物黑名共68种，其中有7种pahs。

生物修复是去除多环芳烃污染的有效途径。然而，石油开采时的突发石油泄漏事故、落地油及含油污水排放等对当地土壤造成严重污染，其污染土壤通常含油和含盐量都较高。我国许多油田位于干旱或半干旱地区，油田土壤常具有高盐特征，如中原油田、辽河油田和胜利油田的土壤含盐量分别为7、9和15g·kg^-1。目前已有报道许多细菌、真菌及藻类等都具有降解pahs的能力，但研究发现将非嗜盐pahs的高效降解微生物接入到高盐环境中，对pahs的去除效果较差，利用嗜盐微生物降解高盐环境的pahs可能是有效的途径，近年来备受关注。

中度嗜盐菌是指能够在盐度为3～15％的条件下有最佳生长能力的极端微生物类群。中度嗜盐菌在高盐浓度下能够降解苯酚、多环芳烃等有毒有害有机污染物，近年来利用中度嗜盐菌耐盐的优势来修复污染环境备受关注。污染环境通常多种污染物并存，能够降解多种污染物且降低污染物的生态风险的高效降解菌株是实现污染环境高效、稳定和安全生物修复的关键。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种中度嗜盐多环芳烃降解菌及其应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种中度嗜盐多环芳烃降解菌，其在中国典型培养物保藏中心cctcc保藏，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏时间为2011年6月26日，编号为cctccno：m2011218，名称为中度嗜盐多环芳烃降解菌，martelellasp.ad-3；多环芳烃为萘，菲，蒽，芘等。该菌株16srdna的genbank登录号为gu086202，基于菌株ad-3和亲缘关系相近菌株的16srdna序列系统发育树如图1所示。

一种中度嗜盐多环芳烃降解菌在降解多环芳烃中的应用方法，其具体步骤为：

(1)配置无机盐培养基

无机盐培养基的ph为6.5～10；无机盐培养基的含盐度为0.1～15％；

配制含盐度为15％的无机盐培养基母液：

1l培养基：nacl119.17g，mgcl2·6h2o10.35g，mgso4·7h2o15.67g，cacl21.12g，kcl3.15g，nahco30.15g，nabr0.375g，k2hpo40.72g,微量元素1ml，调节ph。

微量元素溶液：1l溶液中含有ca(no3)2·4h2o800mg，feso4·7h2o400mg，cuso4·5h2o80mg，znso4·7h2o40mg，mnso4·4h2o40mg，namo4·2h2o8mg，hbo36mg。其它盐度的培养基可按此比例进行配制.

配置含盐度为10％的无机盐培养基，是由15％的无机盐培养基母液用去了离子水稀释1.5倍获得。

配置含盐度为5％的无机盐培养基，是由15％的无机盐培养基母液用去了离子水稀释3倍获得。

配置含盐度为3％的无机盐培养基，是由15％的无机盐培养基母液用去了离子水稀释5倍获得。

配置含盐度为1％的无机盐培养基，是由15％的无机盐培养基母液用去了离子水稀释15倍获得。

配置含盐度为0.1％的无机盐培养基，是由1％的无机盐培养基母液用去了离子水稀释10倍获得。

(2)挑取中度嗜盐多环芳烃降解菌ad-3至盐度为3％的含100mg·l^-1菲，或25mg·l^-1蒽的无机盐培养基中，培养时间为2天后，12,000×g离心5min后收集菌体，并用无机盐培养基洗涤菌体；

(3)二氯乙烷溶解芴、苯并[a]蒽等多环芳烃分别配成母液，过滤除菌后加入锥形瓶，待二氯乙烷挥发后再加入含盐度为0.1～15％的多环芳烃的无机培养基，接入ad-3菌浓度约为10⁷cfu，于30℃，150r·min^-1避光振荡培养进行降解，每隔24h检测多环芳烃的残留；cfu是指样品中每毫升菌液含有的细菌群落总数；

(4)向经过降解后的培养基中加入等体积的乙酸乙酯，剧烈振荡萃取,静置分层后取上层有机相；重复萃取一次，合并有机相，取10ml在40℃氮吹干燥，用10ml色谱级甲醇溶解残留物并过滤后，再进行hplc分析；

分析条件是：shimadzulc-20a高效液相色谱仪，spd-m20a紫外检测器、cto-20a柱温箱、lc-20ad泵、shimadzuvp-ods色谱柱(150mm×4.6mmi.d.,50μm)，lc-solution色谱工作站，检测波长为254nm，流动相为甲醇∶水＝80:20，流速为1ml·min^-1，柱温为40℃，进样量为10μl。

中度嗜盐菌株martelellasp.ad-3在0.5～15％的盐度，ph6.5～10.0范围内均能够降解菲，在最优降解条件下盐度3％，ph9.0在6天内对200mg·l^-1菲的可实现完全降解，其代谢途径主要是经过水杨酸-龙胆酸途径，降解后生态毒性明显降低。

中度嗜盐菌株martelellasp.ad-3在0.1～10％的盐度，ph6.0～10.0范围内均能够降解蒽，在最优降解条件下对25mg·l^-1蒽的降解率可达94.6％。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

本发明的中度嗜盐菌株martelellasp.ad-3能够降解多种有毒有害芳香族化合物和多环芳烃污染物，降解速率高，且降解后不仅实现了目标污染物的浓度降低，同时污染物的生态毒性显著减小。

本发明的中度嗜盐菌株martelellasp.ad-3能够在0.1～15％的盐度，ph6.0～10.0的范围内降解多环芳烃，使其能够在pahs污染的盐碱性土壤的生物修复过程中发挥作用和具有潜在应用价值。

【附图说明】

图1基于菌株ad-3和亲缘关系相近菌株的16srdna序列系统发育树；

图2菲浓度对ad-3菌株降解菲的影响；

图3盐度对ad-3菌株降解菲的影响；

图4ph对ad-3菌株降解菲的影响；

图5在优化条件下ad-3菌株以菲为碳源的生长和降解；

图6ad-3菌对菲的代谢途径。

【具体实施方式】

以下提供本发明一株中度嗜盐多环芳烃降解菌及其应用的具体实施方式。

实施例1

一种中度嗜盐多环芳烃降解菌，其在中国典型培养物保藏中心cctcc保藏，保藏时间为2011年6月30日，编号为cctccno：m2011218，名称为中度嗜盐多环芳烃降解菌，martelellasp.ad-3。

挑取martelellasp.ad-3单菌落，接种在含200mg·l^-1菲无机盐培养基中培养2天。将30ml不同浓度菲(100mg·l^-1，200mg·l^-1，300mg·l^-1，400mg·l^-1)的培养基分别置于100ml的锥形瓶中，按5％接种量(d600＝0.05)，于30℃，150r·min^-1避光振荡培养。定时取样，分别测定d600和菲的残留，并分别改变培养温度，菲的浓度，初始ph值，培养基盐浓度，研究各因素对菲降解效率的影响。以未接菌的含菲无机盐培养基为对照，按照降解率d％＝(cck-cf)/cck×100％的方式计算降解率，式中，cck为空白处理中菲的浓度，cf为培养结束时培养基中菲的浓度。

菲浓度影响实验：选择盐度为5％和ph为7.5的培养基。分别选择菲初始浓度为100、200、300、400mg·l^-1，于30℃摇床中培养，6d后分析测定菲的残留浓度。

盐度影响实验：选择菲初始浓度为200mg·l^-1，ph为7.5的培养基。分别在盐度为0.5～15％的范围内于30℃条件下培养，6d后分析测定菲的残留浓度。

ph值影响实验：选择菲初始浓度为200mg·l^-1，盐度为3％的培养基。分别在ph为6.5～10.0的范围内于30℃条件下培养，6d后分析测定菲的残留浓度。

优化条件下martelellasp.ad-3降解菲的规律和代谢途径。

所述无机盐培养基(seasaltdefinedmedium,ssdm)：1l培养基(10％)nacl79.45g，mgcl2·6h2o6.9g，mgso4·7h2o10.45g，cacl20.75g，kcl2.1g，nahco30.1g，nabr0.25g，k2hpo40.48g,微量元素1ml。以上各成分的含量对应盐度为10％的培养基，其它盐度的培养基可按此比例进行配制；

微量元素溶液：1l溶液中含有ca(no3)2·4h2o800mg，feso4·7h2o400mg，cuso4·5h2o80mg，znso4·7h2o40mg，mnso4·4h2o40mg，namo4·2h2o8mg，hbo36mg。

二氯乙烷溶解菲分别配成50mg·l^-1母液，过滤除菌后加入锥形瓶，待二氯乙烷挥发后再入无机盐培养基。

向经过降解后的培养基中加入等体积的乙酸乙酯，剧烈振荡萃取,静置分层后取上层有机相。重复萃取一次，合并有机相，取10ml在40℃氮吹干燥，用10ml色谱级甲醇溶解残留物并过滤后，再进行hplc分析。分析条件是：shimadzulc-20a高效液相色谱仪，spd-m20a紫外检测器、cto-20a柱温箱、lc-20ad泵、shimadzuvp-ods色谱柱(150mm×4.6mmi.d.,50μm)，lc-solution色谱工作站，检测波长为254nm，流动相为甲醇∶水＝80:20，流速为1ml·min^-1，柱温为40℃，进样量为10μl。

martelellasp.ad-3均能够高效降解不同浓度的菲，100，200，300，400mg·l^-1的降解速率分别为13.7，21.5，14.6，12.9mg·l^-1·d^-1，如图2所示，200mg·l^-1有更高的降解效率。

martelellasp.ad-3均能够在0.5～15％的盐度范围内降解菲，如图3所示，在盐度3％对200mg·l^-1有更高的降解效率，当盐度低于0.5％或高于15％时抑制菲的降解。

martelellasp.ad-3均能够在6.5～10.0的ph范围内降解菲，如图4所示，在ph9.0对200mg·l^-1有更高的降解效率。

在菲初始浓度为200mg·l^-1，ph9.0，盐度3％的优化条件下，如图5所示，martelellasp.ad-3菌在6天的时间内将菲完全降解。ad-3降解菲的途径如图6所示。降解菲通过两种不同的代谢途径，其一为，多环芳烃双加氧酶在c3,4位置开环，经1-羟基-2-萘甲酸、1-萘酚、水杨酸、龙胆酸等途径降解；其二为，形成9,10-菲醌。

200mg·l^-1菲经martelellasp.ad-3菌在6天的时间内将菲完全降解后，经vibriofischeri毒性评价显示，如图6所示，经10天降解后毒性明显降低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。