本发明属于低聚糖制备方法领域，具体涉及一种采用木瓜蛋白酶冷冻干燥制备壳寡糖的方法。
背景技术：
：壳聚糖是一种天然高分子聚合物，属于氨基多糖，被誉为继蛋白质、脂肪、糖类、维生素和无机盐之后的第六生命要素。壳聚糖又称脱乙酰甲壳素，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-b-d-葡萄糖，是由2-乙酰氨基葡萄糖和2-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的，因原料不同和制备方法不同，相对分子质量也从数千至数百万不等。近年来，研究者发现壳聚糖在调节血压血脂、平衡血液胆固醇含量、减肥等方面具有独特的效果，壳聚糖是一种天然脂肪吸附剂，比其他减肥降脂活性物质的疗效更好，且更安全，因此壳聚糖成为一种新型的减肥降脂食品与药物。1811年法国学者布拉克诺首先发现了甲壳素，而后，1823年由欧吉尔从甲壳动物的外壳中提取出甲壳素。甲壳素脱乙酰基至一定程度后的产物就是壳聚糖。1859年，法国人rouget首先制得了壳聚糖，壳聚糖这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、金属提取、化妆品、水处理及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。研究表明，壳聚糖的功效性质与其分子量密切相关。如不同相对分子质量的壳聚糖对果蔬的保鲜效果不同。而壳聚糖降解至一定程度后，即可得壳寡糖。壳寡糖因其分子量小，结构较简单，较壳聚糖容易被机体吸收，是甲壳素、壳聚糖产品的升级产品，具有壳聚糖不可比拟的优越性。因此，壳聚糖降解为壳寡糖的研究成为壳聚糖研究和应用领域中的一个十分重要的基础工作。目前，主要是通过对壳聚糖的降解来获得壳寡糖。壳聚糖降解的方法主要包括酶降解法、化学降解法和物理降解法。酶法结合化学法制备甲壳素，反应条件温和，对甲壳素的主链结构影响比较小，且酶解液中钙和蛋白质等有效成分可回收利用；但该法耗时长，脱蛋白质效果不及化学法，商业化酶比较贵，工业化生产的成本高于酸碱提取，最近有学者提出采用木瓜蛋白酶制备壳寡糖，例如苏畅等人研究发现木瓜蛋白酶能作用于氨基葡糖与n-乙酰氨基葡糖之间和两个氨基葡糖之间的糖苷键，使之断裂，但是，lin等的研究发现木瓜蛋白酶主要作用于数均分子量为5～20万的脱乙酰度较低的壳聚糖。化学降解法包括酸解法、过氧化氢及过硼酸钠氧化降解法等。采用化学降解法制备壳寡糖方面的研究已经取得了较大的进展，但步骤较为复杂，且化学降解法需要用大量的化学试剂，对环境的污染较大，而且反应不容易控制。中国专利申请cn105884932a公开了一种低分子量壳聚糖的制备方法，包括：步骤一：将壳聚糖与金属离子配位使其转化为壳聚糖金属配合物，步骤二：壳聚糖金属配合物的氧化降解，步骤三：将步骤二中得到的产物分离提纯，该方法制备得到的壳寡糖分子量较低，但是，制备步骤较为复杂。物理法是通过将壳聚糖分子内的化学键在辐射过程中发生断裂而降解，有微波辐射、电磁波辐射、超声波辐射等降解方法，其中研究比较多的是超声波降解法。李军立等以天然大分子量壳聚糖为原料，利用超声波降解法制备低聚壳聚糖，并通过单因素实验研究盐酸质量分数、降解温度、超声功率和超声时间对超声波降解壳聚糖的影响，采用正交试验设计确定制备分子量小于1万的低聚壳聚糖的最佳降解条件。超声波降解法操作简单，但95％的超声能量用于体系加热作用而非产物降解作用，因此降解效率较低，同时具有产物分子量分布较广，分子量较高的问题。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种采用木瓜蛋白酶冷冻干燥制备壳寡糖的方法。本发明提供的采用木瓜蛋白酶冷冻干燥制备壳寡糖的方法简便、快速、高效，制备得到的壳寡糖分子量分布均匀，产量高。本发明的技术方案是：一种采用木瓜蛋白酶冷冻干燥制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：s1取壳聚糖干燥至恒重，溶解于乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，放置24h完全溶解，配成质量浓度为1.0％的壳聚糖溶液；s2向步骤s1所得壳聚糖溶液中加入质量浓度为1.0％的木瓜蛋白酶溶液，使酶底质量比为5％，在45℃的水浴环境中酶解，酶解时间为2h，2h后取出，沸水浴10min灭活，流动水冷却至室温后用质量浓度为5％的naoh溶液调整ph至6～7，过滤，弃去滤渣，得滤液；s3将步骤s2所得滤液用再生纤维素透析袋透析24h，每8h换一次透析液，收集透析液，将收集后的透析液加热浓缩，得浓缩液，将上述浓缩液放入冷冻干燥机中进行冷肼冷冻12h后再进行抽真空升华，12h后冻干升华完成，采用密封塑料袋收集干粉。进一步地，所述步骤s1所述乙酸-乙酸钠缓冲溶液为ph值4.5的0.2mol/l乙酸-乙酸钠缓冲溶液。进一步地，所述步骤s2所述木瓜蛋白酶溶液由ph值4.5的0.2mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制而成。进一步地，所述步骤s3所述再生纤维素透析袋的截留分子量为3000da。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明创造性地将木瓜蛋白酶和冷冻干燥法结合制备得到的壳寡糖分子量分布均匀，产量高。(2)本发明提供的采用木瓜蛋白酶冷冻干燥制备壳寡糖的方法简便、快速、高效、安全，适合产业化生产，具有良好的工业推广实用性和价值。(3)本发明结合木瓜蛋白酶和冷冻干燥法制备得到的壳寡糖水分少，能够更好的保持壳寡糖的物理性状，便于其运用于药业生产，便于药品保存以及进一步的加工使用。(4)本发明提供的采用木瓜蛋白酶冷冻干燥制备壳寡糖的方法有利于壳寡糖生理活性的保持。(5)本发明的发明人对木瓜蛋白酶酶解壳聚糖的酶底质量比、底物(壳聚糖)浓度、酶解时间等具体的工艺条件进行探索和优化，提高酶解效率，并结合冷冻干燥法，进行了一系列的试验研究和筛选，从而提高制备得到的壳寡糖产率，为木瓜蛋白酶结合冷冻干燥法制备壳寡糖的生产提供依据。附图说明图1盐酸-氨基葡萄糖光谱扫描图谱；图2盐酸氨基葡萄糖标准曲线；图3底物浓度对壳寡糖含量的影响；图4酶解时间对壳寡糖含量的影响；图5酶底质量比对壳寡糖含量的影响；图6载液厚度与冻干时间的关系。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。壳聚糖(批号：121211a，脱乙酰度95％，山东奥康生物科技有限公司)，木瓜蛋白酶(分析纯，美国西格玛奥德里奇公司)，再生纤维素透析袋(截留分子量3000da，上海安谱实验科技股份有限公司)。冷冻干燥机为四环冷冻干燥机，所述四环冷冻干燥机的基本参数如下：冷阱温度(空载)：≤-62℃，极限真空度(空载)：≤10pa，最大捕水量：6kg，搁板温度控制范围：-40℃～+45℃，搁板控温误差：±1℃，干燥室尺寸，即有机玻璃罩内尺寸(内径×深)(mm)：标准型：236×290(托盘内径180mm，层间距45mm，带四层加热搁板，冻干面积0.1m2，可散装物料，也可用安培瓶装物料)。实施例1、壳寡糖的制备和还原糖含量测定实验1.木瓜蛋白酶酶解制备壳寡糖向25毫升比色管中加入10mlph4.5的质量浓度为1.0％的壳聚糖溶液，加入质量浓度为1.0％的木瓜蛋白酶溶液，使酶底质量比为5％，在45℃的水浴环境中，水浴2h，2h后取出沸水浴10min灭活，流动水冷却至室温并且过滤，弃去滤渣，取0.5ml滤液(或者更少，根据吸光度确定)于10ml比色管中，加蒸馏水至1ml，再加入1.0mldns试剂，沸水浴5min显色，取出后流动水冷却至室温，定容至10ml，以空白管为参比，于最大吸收波长处测定吸光度值。再将吸光度代入标准曲线中，计算出壳寡糖含量的值。2.还原糖含量测定实验(1)盐酸-氨基葡萄糖标准系列最大吸收波长的选择为了对酶解后还原性糖进行定量，需要做氨基葡萄糖的标准曲线，分别加入0.00ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml质量浓度为0.1％氨基葡萄糖溶液于10ml比色管中，再分别加入1.00ml、0.80ml、0.60ml、0.40ml、0.20ml、0.00ml的蒸馏水，随后加入1.0ml的dns试剂，沸水浴5min显色，取出后流动水冷却至室温，定容到10ml，先采用紫外光度计进行光谱扫描得到最大的吸收峰，然后采用该波长为测定的吸收波长。图1为盐酸-氨基葡萄糖光谱扫描图谱，曲线由下到上依次为0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml盐酸-氨基葡萄糖标液dns法的光谱曲线。该图横坐标为扫描波长，纵坐标为吸光度值。由图1可知，盐酸-氨基葡萄糖标准系列在485nm处有最大的吸收峰。故选择485nm为吸收波长进行吸光度测量从而进行壳寡糖的定量分析。(2)盐酸-氨基葡萄糖标准曲线绘制以0号管为参比，于最大吸收波长处测定吸光度值，平行试验3次，取平均值。以吸光度值为纵坐标，氨基葡萄糖加入量为横坐标，作壳寡糖含量吸光度标准曲线。图2为盐酸氨基葡萄糖标准曲线。由图2可知，在相同的测定条件下，一定的范围内溶液的吸光度值随水溶性低聚糖含量的升高而升高。以还原糖浓度(mg/ml)为横坐标，吸光度值(均值)为纵坐标，作回归曲线，得回归方程y＝0.9944x—0.0164，r2＝0.9990，线性良好。根据此标准曲线，采用酶解液中还原糖的含量来表示壳寡糖含量，从而计算酶解溶液中的壳寡糖含量。实施例2、木瓜蛋白酶酶解制备壳寡糖条件优化实验1.底物浓度单因素实验在固定酶底质量比为5％，酶解时间为2h，ph4.5的条件下，选取底物浓度(壳聚糖质量浓度)分别为0、0.2％、0.5％、0.8％、1.0％、1.2％、1.5％，通过测定反应后壳寡糖含量为评价指标，考察壳聚糖浓度对壳寡糖含量的影响。壳聚糖浓度对壳寡糖含量的影响的实验结果如图3所示。由图3可知，在相同的酶解条件下，酶底质量比为5％，酶解时间为2h，ph4.5，壳寡糖含量先随着底物(壳聚糖)的浓度增大而增大，在壳聚糖浓度为1.0％处有最大值，后随着壳聚糖浓度升高壳寡糖含量下降，故最佳壳聚糖浓度为1.0％。在综合分析的基础上，经过不断实验，确定了壳聚糖质量浓度0.8％、1.0％和1.2％作为正交实验的三个水平。2.酶解时间单因素实验在固定壳聚糖质量浓度为1.0％，酶底质量比为5％，ph4.5的条件下，选取酶解时间分别为1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、12h时，通过测定反应后壳寡糖含量为评价指标，考察酶解时间对壳寡糖含量的影响。酶解时间对壳寡糖含量的影响的实验结果如图4所示。由图4可知，其他酶解条件不变，壳聚糖质量浓度为1.0％，酶底质量比为5％，ph4.5的条件下酶解2h时壳寡糖含量最大，随后随着酶解时间的增长，壳寡糖含量下降后又趋于平稳。根据单因素实验结果分析后，选择反应时间1h、2h和3h作为正交实验的三个水平来考察酶解时间对壳寡糖含量的影响。3.酶底质量比单因素实验在固定壳聚糖质量浓度为1.0％，ph4.5，酶解时间2h的条件下，选取酶底质量比分别为1％、3％、5％、7％、9％、10％时，通过测定反应后壳寡糖含量为评价指标，考察酶底质量比对壳寡糖含量的影响。酶底质量比对壳寡糖含量的影响的实验结果如图5所示。由图5可知，其他酶解条件不变，质量浓度为1.0％的壳聚糖溶液在ph4.5的条件下酶解2h，随着酶底质量比的提高，壳寡糖含量增大。在综合分析的基础上，经过不断实验，确定了酶底质量比1.0％、2.5％和5.0％作为正交实验的三个水平。4.正交试验优选处方根据单因素实验，在综合分析的基础上，选取对壳寡糖含量影响较大的因素进行正交实验，以壳寡糖含量作为指标优化处方，正交试验结果如表1所示。表1：正交试验极差分析注：k1、k2、k3分别为每次实验各因素的水平的实验结果之和；r1、r2、r3分别为各因素各水平结果的平均值。由表1可知，正交试验极差分析结果显示，极差最大值对应的因素即影响壳寡糖含量的最主要因素，即为底物(壳聚糖)浓度，其次是酶底质量比，影响最小的是酶解时间。最优方案为a2b3c2，即壳聚糖质量浓度为1.0％、酶底质量比为5％和酶解时间为2h。实施例3、冷冻干燥工艺优化实验冷冻干燥的液载面积探究，已知托盘的直径是180mm，载液厚度不得超过10mm。配制5％的壳寡糖溶液，分别取一定体积于5个相同的托盘中，使载液厚度分别为1mm、3mm、5mm、7mm、9mm，然后放入冷冻干燥机中进行慢速冷冻来进行冷冻物料，待冷肼温度、物料温度不变，肉眼判断冷肼完成后再进行抽真空升华。载液厚度与冻干时间的关系如图6所示。由图6可得，载液厚度越小，在同样的低温气氛中，温度降低较快，冻干效率越快。综合考虑，使载液厚度为3mm，即将透析液加热浓缩到100ml再进行冷冻干燥。实施例4、按照优化的处方和工艺制备得到的壳寡糖的产率计算及定性鉴别1.采用木瓜蛋白酶冷冻干燥制备壳寡糖的方法，包括以下步骤：s1取壳聚糖干燥至恒重，溶解于ph值4.5的0.2mol/l乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，放置24h完全溶解，配成质量浓度为1.0％的壳聚糖溶液；s2向步骤s1所得壳聚糖溶液中加入质量浓度为1.0％的木瓜蛋白酶溶液，使酶底质量比为5％，在45℃的水浴环境中酶解，酶解时间为2h，2h后取出，沸水浴10min灭活，流动水冷却至室温后用质量浓度为5％的naoh溶液调整ph至6～7，过滤，弃去滤渣，得滤液；s3将步骤s2所得滤液用截留分子量为3000da的再生纤维素透析袋透析24h，每8h换一次透析液，收集透析液，将收集后的透析液加热浓缩，得浓缩液，将上述浓缩液放入冷冻干燥机中进行冷肼冷冻12h后再进行抽真空升华，12h后冻干升华完成，采用密封塑料袋收集干粉。所述步骤s2所述木瓜蛋白酶溶液由ph值4.5的0.2mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制而成。2.壳寡糖的产率计算取1.0g壳聚糖原料药配制成质量浓度为1.0％的壳聚糖溶液，使用木瓜蛋白酶冷冻干燥法制备壳寡糖，平行试验三次，当使用1000da的再生纤维素透析袋时，分别得到0.2987g、0.3054g、0.3121g壳寡糖粉末；当使用3000da的纤维素透析袋时，分别得到0.8123g、0.8049g、0.8312g壳寡糖粉末。分别计算水分、还原糖含量、5％水溶液粘度及其产率，结果如表2所示。计算dns法测得理论还原糖含量，并计算其理论产率，再结合冷冻干燥法制得壳寡糖干粉，计算其冷冻干燥产率。称量恒重后的壳寡糖为ma，除以加入的壳聚糖总量m0，乘以100％，即是冷冻干燥产率。式中：η％：冷冻干燥产率ma：壳聚糖酶解产生的壳寡糖的量(mg)m0：壳聚糖的量(mg)表2：壳聚糖酶解制备壳寡糖含量由表2可知，rsd％都在5％以下，说明结果重复性较好，且由表2可以看出，采用3000da再生纤维素透析袋透析制得的壳寡糖的产率高达71.24％。3.壳寡糖产品的分析鉴定(1)还原糖法测壳寡糖原料药的平均分子量分别取1000分子量和3000分子量的壳寡糖原料药，用还原糖法测定其平均分子量，结果如表3所示。表3：还原糖法测壳寡糖标准品的平均分子量注：cos1000为1000分子量的壳寡糖原料药，cos3000为3000分子量的壳寡糖原料药。由表3可知，使用还原糖法测壳寡糖的平均分子量基本合理，1000分子量的壳寡糖原料药测得平均分子量为999da，3000分子量的壳寡糖原料药测得平均分子量为2998da，rsd均在可接受范围内，故可使用该法测定样品的壳寡糖平均分子量。(2)还原糖法测平均分子量根据样品浓度和聚合程度，以蒸馏水对除酶后壳聚糖降解液稀释的百分浓度为a，dns法操作同上，根据样品吸光度从盐酸-氨基葡萄糖标准曲线中求出该样品吸光度相当的氨基葡萄糖百分浓度为b，据公式求出样品分子量(m样)，结果如表4所示。m样＝215.6×a÷b式中：215.6：氨基葡萄糖单糖的分子量a：蒸馏水对除酶后壳聚糖降解液稀释的百分浓度b：样品吸光度相当的氨基葡萄糖百分浓度表4：降解后壳寡糖测定结果降解酶木瓜蛋白酶平均分子量324.5da由表4可知，根据还原糖法测得木瓜蛋白酶在最佳条件下酶解制备得到的壳寡糖平均分子量为324.5da。当前第1页12