本发明涉及一种植物多糖方法，尤其是一种白术多糖的提取方法。
背景技术：
目前白术多糖的提取方法主要是热水浸提法、酶法、微波辅助提取法、超临界萃取法和超声波辅助提取法。其中应用最多的提取方法是热水浸提法。
袁海梅[1]等采用正交试验优化设计，水提醇沉法提取得到白术粗多糖。
多糖铁配合物一般合成方法是将精制多糖配成一定浓度的水溶液，再加入柠檬酸三钠，混匀后加入三氯化铁，控制ph值8.0左右，反应一段时间后过滤取上清液醇沉，获得醇沉物，流水透析，冻干后即获得多糖铁配合物。赵鹏[2]等用此法制备得到了二色补血草多糖铁(iii)配合物，发现多糖中羟基和铁离子发生了配位，配合产物热稳定性较好。
多糖锌配合物合成一般方法是将多糖配成一定的水溶液后，滴加一定量的金属离子溶液，在一定的温度和ph下搅拌反应一段时间，再加乙醇溶液得到醇沉物，冷冻干燥获得产品。毛跟年[3]等通过此法制备了甘露低聚糖锌配合物，通过配合物的表征发现甘露低聚糖与锌离子发生结合的部位在羟基上。
孙宏[4]等合成了壳聚糖铜(ⅱ)配合物。配合物合成工艺如下：在一定量的水中加入少量冰乙酸，再逐滴加入适量壳聚糖溶液，使在40℃反应3h后，加1％的氢氧化钠至溶液呈中性，形成的蓝色沉淀分别用去离子水和95％的乙醇洗涤，60℃烘干得到配合物产品。
现有技术中合成金属多糖配合物一般是先从原材料中浸提获得精制多糖，而后与特定金属离子在适宜条件下螯合从而得到多糖金属配合物；其中精制多糖一般由热水浸提后分离纯化获得；热水浸提法通常需要浸提温度高，浸提次数多，因而在生产中能量损耗大，配合物的制备工艺较复杂，也增加了生产中能量的损失。
目前虽然已有一些关于多糖金属配合物合成的研究，但对于白术多糖金属配合物的合成和制备工艺的研究，文献中未见有报道。
参考文献：
[1]袁海梅,李鸿翔与彭腾,正交试验法优选白术多糖的提取工艺.成都大学学报(自然科学版),2015(03):第217-219页；
[2]赵鹏等,二色补血草多糖铁(ⅲ)配合物的合成及吸附动力学.化学工程,2014(11):第6-9页；
[3]毛跟年等,甘露低聚糖锌配合物的制备工艺.食品研究与开发,2010(03):第1-4页；
[4]孙宏,张泽与王广东,壳聚糖铜(ⅱ)配合物催化氧化水中的罗丹明b.印染助剂,2016(09):第45-48页。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种白术多糖的提取方法，该方法的工艺难度低，提取的条件更温和，产率更高，白术多糖的生物活性保持更好。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种白术多糖的提取方法，包含以下步骤：
(1)取干燥白术根或/和茎的粉末，加入85℃以上的蒸馏水浸提，得到浸提液，之后将浸提液的温度调节至30℃～80℃；
(2)向步骤(1)所得浸提液中加入蒸馏水，同时加入硫酸盐溶液，调节ph值至3～8，反应0.5～3.0h后过滤得到第一次提取液和滤渣；
(3)将所得滤渣按上述步骤(1)和(2)重复提取至少一次，得到多次提取液，合并多次提取液，蒸发浓缩后，加入无水乙醇，静置过夜，过滤得到沉淀，所得沉淀经洗涤、干燥，得到螯合有金属离子的白术多糖粗制品。其中，步骤(1)中，优选90℃以上的蒸馏水浸提。
优选地，所述步骤(2)中，所加的蒸馏水体积和白术粉末的质量之比为5～30ml：1g。
优选地，所述步骤(2)中，所加的蒸馏水体积和白术粉末的质量之比为10ml：1g。本申请的发明人经多次试验发现，蒸馏水体积和白术粉末的质量之比为10ml：1g时，白术多糖的溶出率最佳。应当说明的是，本申请中的溶出率指水溶性多糖的收率。
优选地，所述步骤(2)中硫酸盐为硫酸锌、硫酸铜、硫酸亚铁中的至少一种。更优选地，步骤(2)中硫酸盐为硫酸亚铁，本申请的发明人经多次试验发现，当步骤(2)中硫酸盐为硫酸亚铁时，白术多糖的溶出率较高。
优选地，所述步骤(3)中无水乙醇的加入量为两次提取液的蒸发浓缩液体积的4倍。
优选地，所述步骤(1)中粉末过60目250μm分子筛后加入蒸馏水。
优选地，所述步骤(2)中ph值为4～5。本申请的发明人经多次试验发现，当步骤(2)中ph值为4或5时，白术多糖的溶出率较佳。
优选地，所述步骤(1)中温度调节至60～70℃。本申请的发明人经多次试验发现，当步骤(1)中温度调节至60℃或70℃时，白术多糖的溶出率较佳。
优选地，所述步骤(2)中反应时间为1h。本申请的发明人经多次试验发现，当步骤(2)中反应时间为1h时，白术多糖的溶出率较佳。
优选地，所述步骤(2)中ph值为4.5，所加的蒸馏水体积和白术粉末的质量之比为8ml：1g，所述硫酸盐为硫酸铜。本申请的发明人经多次试验发现，当步骤(2)中ph值为4.5，所加的蒸馏水体积和白术粉末的质量之比为8ml：1g，所述硫酸盐为硫酸铜时，白术多糖的溶出率最佳。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明将采矿技术中的螯合提取技术应用于植物中多糖的提取，与传统工艺不同的是：传统工艺是用螯合剂来辅助提取矿石中的金属离子，此处用金属离子螯合多糖，促进植物中的多糖提取效率；
2、本发明的工艺仅采用一步就可直接获取多糖微量元素螯合物，从工艺上避免了加热提取得到多糖、分离纯化后干燥、再加热螯合的过程中能源和水浪费，也减少了环境污染；提高了产品竞争力；
3、本发明制得的白术多糖微量元素螯合物既可高效补充微量元素，又补充生物免疫活性物质多糖。
具体实施方式
微量元素络合物具有生物学效价高，安全等特性，通过此工艺获得的产品作为饲料添加剂，一方面可以给动物补充必须的免疫性生物活性物质，同时可以高效的补充微量元素，从而大幅度的减少饲料中微量元素(fe、cu、zn等)的添加量，降低料重比，降低饲料成本，减少矿产资源的消费量，同时可以减少微量元素在肉食品中的残留，减少动物排泄物中微量元素的含量，进而减少养殖业对环境的污染。故开发本发明的新工艺，本发明涉及一种白术多糖金属配合物的提取方法，可用于保障肉类食品安全，环境保护，资源节约，同时降低饲料成本，增加养殖户收益，促进农民致富。
本发明的螯合提取工艺利用了微量元素(铜、铁、锌)和多糖可络合形成稳定螯合物，可对植物原料中的多糖提取形成协同效应，从而降低了多糖提取的工艺难度，使提取的条件更温和，产率更高，并且减少多糖金属配合物制备的中间环节，不需要长时间热水浸提的多糖提取工艺，可极大地保持白术多糖的生物活性。
本发明的白术多糖提取方法包括以下步骤：
将白术样品用万能粉碎机粉碎，粉末过60目250μm分子筛，60℃烘干24h备用；称取干燥白术粉末10g，迅速加入100.0ml蒸馏水，在85℃以上热水中磁力搅拌浸提1h后将温度调节至反应温度(30℃-80℃)，按照一定的料液比(白术样品质量和蒸馏水体积之比：1/5-1/30)加入蒸馏水，马上加入一定体积(0-40ml)0.5mol/l硫酸盐(硫酸锌、硫酸铜、或硫酸亚铁)溶液，调节ph值(3-8)一定共同反应一段时间(0.5-3.0h)，过滤，保存提取液。然后将所得滤渣按上述操作重复提取一次，合并两次所得提取液，旋转蒸发浓缩后加入浓缩液4倍体积的无水乙醇，于4℃冰箱中静置过夜，过滤，将收集到的沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤，60℃干燥得到白术多糖金属配合物粗制品。
本发明在热水浸提白术多糖的过程中，控制加入的金属离子量、反应温度、反应时间、料液比、ph值等因素，通过单因素和正交试验优化，运用苯酚硫酸法计算多糖溶出率，etda滴定法测定所得金属配合物中金属含量，确定了一步合成白术多糖螯合物的最佳试验条件。
本发明中还涉及葡萄糖标准曲线的确定，多糖溶出率的计算公式的确定，配合物中金属含量的测定，单因素优化试验和正交优化试验，分别介绍如下：
(1)葡萄糖标准曲线的确定
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。精密称取在105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品0.200g，溶解定容于100ml容量瓶中，配置成2mg/ml的葡萄糖母液备用。再分别吸取0，0.25ml，0.5ml，0.75ml，1.0ml，1.25ml，1.5ml，1.75ml，2.0ml于50ml容量瓶中定容。各取1ml，加入6％苯酚溶液1ml，迅速加入浓硫酸5ml，混匀，静置5分钟，再置85℃水浴加热20min后取出，冷却至室温，于490nm处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度c(mg/ml)为横坐标x，吸光度a(abs)为纵坐标y，确定各试验组葡萄糖标准曲线回归方程。
(2)测定样品吸光度以计算多糖溶出率
取0.100g样品于100ml容量瓶中定容，得1mg/ml样品母液。取2ml样品母液于50ml容量瓶中定容，得0.04mg/ml样品溶液。取1ml样品溶液，加6％苯酚1ml，迅速加浓硫酸5ml，混匀。静置5分钟。再置85℃水浴加热20min后取出，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，从而计算各试验组多糖溶出率。
2.1各试验组回归方程：
试验锌组：y＝10.21x+0.011，r2＝0.997；
试验铜组：y＝10.53x+0.006，r2＝0.999；
试验铁组：y＝10.63x-0.011，r2＝0.999；
注：试验锌组：在白术多糖提取过程中加入硫酸锌溶液共热反应组；
试验铜组：在白术多糖提取过程中加入硫酸铜溶液共热反应组；
试验铁组：在白术多糖提取过程中加入硫酸亚铁溶液共热反应组。
2.2各试验组多糖溶出率计算公式：
试验锌组：多糖溶出率＝[粗多糖×(a-0.011)×2500]/(10.21×101×10)；
试验铜组：多糖溶出率＝[粗多糖×(a-0.006)×2500]/(10.53×101×10)；
试验铁组：多糖溶出率＝[粗多糖×(a+0.011)×2500]/(10.63×101×10)；
注：上式中a指吸光度，2500为稀释倍数，10指浸提所取白术原料克数，101指测定吸光度时所取的粗多糖配合物毫克数。
(3)配合物中金属含量的测定
3.1碘量法测定铜离子含量
称取0.4g试样(称准至0.0002g)置于250ml碘量瓶，加50ml水溶解，加4ml冰乙酸、2g碘化钾摇匀后，于暗处放置10min，用硫代硫酸钠标准溶液(0.1mol/l)滴定至淡黄色，加2ml淀粉溶液，继续滴定至蓝色刚刚消失即为终点。
铜的百分含量x1按式(a)计算：
x1＝0.06355×c1×v1/m1(a)
式中：c1为硫代硫酸钠标准溶液的摩尔浓度mol/l；
v1为滴定时消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积ml；
0.06355为每毫摩尔铜的质量克数；
m1为试样质量g。
3.2edta滴定法测定锌离子含量
称取样品0.100g，加30ml去离子水溶解后加入5％naoh至刚好出现沉淀，加入20mlph5.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，再加入2滴二甲酚橙，用edta标准溶液(0.013mol/l)滴定溶液由酒红色至亮黄色为终点。
锌的百分含量x2按式(b)计算：
x2＝0.065×c2×v2/m2(b)
式中：c2为edta标准溶液的摩尔浓度mol/l；
v2为滴定时消耗edta标准溶液的体积ml；
0.065为每毫摩尔锌的质量克数；
m2为试样质量g。
3.3edta滴定法测定铁离子和亚铁离子含量
称取0.100g样品置于250ml容量瓶中，加40ml去离子水溶解，调节ph为1.8-2.5，加入10滴磺基水杨酸(100g/l)作指示剂，用edta(0.0109mol/l)滴定三价铁离子，直到颜色由紫红色稳定的亮黄色即为滴定终点，记录edta消耗的体积。
加入浓硝酸5ml，加热5min，冷却，使二价铁离子转化成三价铁离子，调节ph为1.8-2.5，使溶液变成紫红色，用edta滴定三价铁离子，直到颜色由紫红色变成亮黄色，记录edta消耗的体积。
铁的百分含量x3按式(c)计算：
x3＝0.065×c3×v3/m3(c)
(4)单因素优化
4.1最适硫酸盐体积加入量的确定
按照料液比(白术样品质量和蒸馏水体积之比)1g/10ml，在提取液中加入不同体积(0-40ml)0.5mol/l的硫酸盐，在ph为6，60℃下反应1h，苯酚硫酸法在490nm下测定多糖吸光度，计算多糖溶出率。试验结果表明试验锌组、铜组、铁组在硫酸盐加入量分别为16ml、4ml、12ml时，多糖溶出率最佳，分别为31.51％，33.30％，35.62％。
4.2最适反应ph值的确定
在锌、铜、亚铁离子溶液加入量确定后，调节ph值(3-8)，料液比1/10，60℃下提取1h。试验锌组、铜组、铁组在ph值分别为5、4、5时，多糖溶出率最佳，分别为33.24％，28.56％，40.70％。
4.3最适反应温度的确定
在锌、铜、铁试验组离子溶液加入量和ph值确定后，调节提取温度(30℃-80℃)，照料液比1/10下提取1h。试验锌组、铜组、铁组在温度分别为60℃、70℃、60℃时，多糖溶出率最佳，分别为32.61％，35.33％，35.20％。
4.4最适反应时间的确定
在锌、铜、铁试验组离子溶液加入量、ph值和反应温度确定后，在料液比1/10下提取一段时间(0.5-3.0h)，试验锌组、铜组、铁组在提取时间为1h时，多糖溶出率最佳，分别为30.45％，33.27％，35.20％。
4.5最适料液比的确定
在锌、铜、铁试验组离子溶液加入量、ph值、反应温度和反应时间确定后，在一定的料液比(1/5-1/30)下提取1h，试验锌组、铜组、铁组在料液比为1/10时，多糖溶出率最佳，分别为32.04％，29.49％，35.20％。
5、正交优化
根据单因素试验结果，锌试验组选取znso4体积(10-30ml)、ph(4-6)、料液比(1/5-1/15)三因素，铜试验组选取cuso4体积(10-30ml)、ph(4-6)、料液比(1/5-1/15)三因素，铁试验组选取feso4体积(10-30ml)、温度(45-65℃)、时间(0.5-2.5h)三因素做正交试验。
试验锌组在znso4体积加入量为16ml，ph为5.0，料液比1/12时多糖溶出率最佳，为30.55％，取0.101g产物测得锌离子百分含量是9.49％。
试验铜组在cuso4体积加入量为5ml，ph为4.5，料液比为1/8时多糖溶出率最佳，为41.26％。取0.401g产物测得铜离子百分含量是2.44％。
试验铁组在feso4体积加入量为10ml，温度为55℃，时间为0.75h时多糖溶出率最佳，为36.02％。取0.102g产物测得铁离子百分含量是6.11％。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明的白术多糖的提取方法的一种实施例，包括如下步骤：
将白术样品用万能粉碎机粉碎，粉末过60目250μm分子筛，60℃烘干24h备用；称取干燥白术粉末10g，迅速加入100.0ml蒸馏水，在85℃热水中磁力搅拌浸提1h后将温度调节至30℃，按照一定的料液比(白术样品质量和蒸馏水体积之比：1g:5ml)加入蒸馏水，马上加入4ml0.5mol/l硫酸锌溶液，调节ph值至3，共同反应0.5h，过滤，保存提取液。然后将所得滤渣按上述操作重复提取一次，合并两次所得提取液，旋转蒸发浓缩后加入浓缩液3.5倍体积的无水乙醇，于4℃冰箱中静置过夜，过滤，将收集到的沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤，60℃干燥得到白术多糖金属配合物粗制品，其中，白术多糖的溶出率为17.42％。
实施例2
本发明的白术多糖的提取方法的一种实施例，包括如下步骤：
将白术样品用万能粉碎机粉碎，粉末过60目250μm分子筛，60℃烘干24h备用；称取干燥白术粉末10g，迅速加入100.0ml蒸馏水，在87℃热水中磁力搅拌浸提1h后将温度调节至50℃，按照一定的料液比(白术样品质量和蒸馏水体积之比：1g:15ml)加入蒸馏水，马上加入16ml0.5mol/l硫酸铜溶液，调节ph值至4共同反应1.5h，过滤，保存提取液。然后将所得滤渣按上述操作重复提取一次，合并两次所得提取液，旋转蒸发浓缩后加入浓缩液4倍体积的无水乙醇，于4℃冰箱中静置过夜，过滤，将收集到的沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤，60℃干燥得到白术多糖金属配合物粗制品，其中，白术多糖的溶出率为24.35％。
实施例3
本发明的白术多糖的提取方法的一种实施例，包括如下步骤：
将白术样品用万能粉碎机粉碎，粉末过60目250μm分子筛，60℃烘干24h备用；称取干燥白术粉末10g，迅速加入100.0ml蒸馏水，在90℃热水中磁力搅拌浸提1h后将温度调节至70℃，按照一定的料液比(白术样品质量和蒸馏水体积之比：1g:10ml)加入蒸馏水，马上加入12ml0.5mol/l硫酸亚铁溶液，调节ph值至5共同反应1h，过滤，保存提取液。然后将所得滤渣按上述操作重复提取一次，合并两次所得提取液，旋转蒸发浓缩后加入浓缩液4倍体积的无水乙醇，于4℃冰箱中静置过夜，过滤，将收集到的沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤，60℃干燥得到白术多糖金属配合物粗制品，其中，白术多糖的溶出率为29.57％。
实施例4
本发明的白术多糖的提取方法的一种实施例，包括如下步骤：
将白术样品用万能粉碎机粉碎，粉末过60目250μm分子筛，60℃烘干24h备用；称取干燥白术粉末10g，迅速加入100.0ml蒸馏水，在92℃热水中磁力搅拌浸提1h后将温度调节至60℃，按照一定的料液比(白术样品质量和蒸馏水体积之比：1g:25ml)加入蒸馏水，马上加入25ml0.5mol/l硫酸铜溶液，调节ph值至6共同反应2.5h，过滤，保存提取液。然后将所得滤渣按上述操作重复提取一次，合并两次所得提取液，旋转蒸发浓缩后加入浓缩液4.5倍体积的无水乙醇，于4℃冰箱中静置过夜，过滤，将收集到的沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤，60℃干燥得到白术多糖金属配合物粗制品，其中，白术多糖的溶出率为18.21％。
实施例5
本发明的白术多糖的提取方法的一种实施例，包括如下步骤：
将白术样品用万能粉碎机粉碎，粉末过60目250μm分子筛，60℃烘干24h备用；称取干燥白术粉末10g，迅速加入100.0ml蒸馏水，在95℃热水中磁力搅拌浸提1h后将温度调节至80℃，按照一定的料液比(白术样品质量和蒸馏水体积之比：1g:30ml)加入蒸馏水，马上加入40ml0.5mol/l硫酸锌溶液，调节ph值至8共同反应3.0h，过滤，保存提取液。然后将所得滤渣按上述操作重复提取一次，合并两次所得提取液，旋转蒸发浓缩后加入浓缩液4倍体积的无水乙醇，于4℃冰箱中静置过夜，过滤，将收集到的沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤，60℃干燥得到白术多糖金属配合物粗制品，其中，白术多糖的溶出率为22.32％。
实施例6
本发明的白术多糖的提取方法的一种实施例，包括如下步骤：
将白术样品用万能粉碎机粉碎，粉末过60目250μm分子筛，60℃烘干24h备用；称取干燥白术粉末10g，迅速加入100.0ml蒸馏水，在90℃热水中磁力搅拌浸提1h后将温度调节至50℃，按照一定的料液比(白术样品质量和蒸馏水体积之比：1g:8ml)加入蒸馏水，马上加入5ml0.5mol/l硫酸铜溶液，调节ph值至4.5共同反应1.5h，过滤，保存提取液。然后将所得滤渣按上述操作重复提取一次，合并两次所得提取液，旋转蒸发浓缩后加入浓缩液4倍体积的无水乙醇，于4℃冰箱中静置过夜，过滤，将收集到的沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤，60℃干燥得到白术多糖金属配合物粗制品，其中，白术多糖的溶出率为39.28％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。