本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种鸡胚心肌细胞的培养及免疫组织化学鉴定方法。
背景技术：
心肌细胞是研究心脏肥大、心脏衰竭、心肌缺血再灌注损伤及自由基损伤等病理过程发生发展的主要环节。心肌细胞的培养有助于深入研究心脏疾病的病理机制。在人类医学中培养心肌细胞进行研究已成为心血管系统疾病研究的主要手段。
随着对禽类心血管系统疾病研究的不断深入，以培养的心肌细胞为材料进行研究将占重要地位。许多学者对鼠类的心肌细胞原代培养方法不断改进，其培养报道较多，但是家禽类原代细胞心肌细胞培养鲜见报道，并且培养纯度及高活力的鸡胚心肌细胞尚存在一定难度。家禽心肌与哺乳动物心肌组织存在较大的差别，且9-11d的心肌组织处于未完全分化的状态，鸡胚心肌细胞的原代培养是研究相关家禽心血管疾病心肌结构以及功能变化的一个理想模型。如何获得较高纯度及较高活力的鸡胚心肌细胞成为本领域亟待解决的问题之一。
技术实现要素：
本发明针对现有技术存在的诸多不足之处，提供了一种鸡胚心肌细胞的培养及免疫组织化学鉴定方法，采用11日龄的鸡胚作为分离对象，操作简单更主要是体现了动物福利的进步，利用差速贴壁法减少成纤维细胞的污染，该方法简单易行，可以获得纯度较高的心肌细胞，从而使心肌细胞贴壁。本发明参照哺乳动物心肌细胞培养和鉴定方法加以改进，形成比较稳定可靠的鸡胚心肌细胞培养和鉴定技术，能够提供足量心肌细胞用于研究工作。
本发明的具体技术方案如下：
一种鸡胚心肌细胞的培养方法，具体制备步骤如下：
(1)选取11日龄的spf鸡胚，用碘伏和75％的酒精先后擦拭蛋壳；镊子敲开鸡蛋气室端，撕去薄膜，镊子拉出鸡胚；
(2)镊子夹住龙骨突，剪刀从龙骨突两侧剪开，暴露心脏；剪取心尖，置于呈有pbs的25ml小烧杯中，先后洗五次，pbs基本无血色为止；
(3)夹出上述处理后的心尖置于培养皿中，剪刀剪碎至细沙状，每10个心尖加入8mlⅰ型胶原酶，酶浓度为1mg/ml，用0.01mph7.2pbs溶液配置；4℃消化14-16h；
(4)取培养皿，加入2ml含20vt％fbs的高糖dmem终止消化；巴士吸管吹散混匀心脏颗粒，吸出过滤，置于离心管，800r/min离心10min，弃上清；
(5)用10ml含20vt％fbs的高糖dmem重悬，分装入培养皿，37℃差速贴壁50-60min，然后将差速贴壁后产生的上清转移到离心管中；
(6)将上述离心管中的上清用巴士吸管吹打混匀后，按照2×105个/ml的密度加到6孔细胞板上，每孔2ml，加入brdu抑制成纤维细胞，每孔中brdu终浓度为0.1mm/l，24-48小时后细胞长成单层，分离培养结束，观察细胞生长状况。
其中步骤(5)主要是利用多聚赖氨酸，对成纤维细胞粘附力较强，对心肌细胞的粘附力较弱原理，而将成纤维细胞粘附到玻片上，将含有非粘附心肌细胞的上清收集、培养。
上述方法中所有试剂用品均为实验室常规化学试剂材料，可在试剂公司购得。一般来说哺乳动物培养心肌细胞使用的是新生幼龄动物，处死时较为痛苦。而本方法中使用的是11日龄的鸡胚，主要原因在于该鸡胚还处于发育的中期阶段，相对鸡而言组织分化要低级的多，鸡胚的感觉系统还没有发育完全，对外界刺激的反应程度也远低于鸡。从这个意义上说，使用鸡胚替代鸡更符合动物福利的要求，并且操作的步骤相对雏鸡或是哺乳动物较少，无菌操作更为容易，因鸡胚心脏发育程度较低，细胞培养液对其影响相对较小。
本发明消化所用的胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用pbs和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，此酶消化作用缓和，无需机械振荡。现有技术中对于哺乳动物的心脏培养，一般是使用胰蛋白酶37℃进行消化，并且使用恒温磁力搅拌器机械帮助消化以确保消化效果；而本发明中所用胶原酶进行4℃过夜消化，不需要借助机械消化，消化时间的选择上，如时间过短组织消化不彻底，过长则细胞成活率较低，消化12-14h最佳。虽然消化时间较哺乳动物心肌细胞培养的方法时间长，但是损伤的细胞较少，时间容易把控，同时最终获得的心肌细胞品质好。4℃消化完毕后吹打细胞时，所用的巴士吸管可以减少对细胞的损伤，也是起到提高细胞成活率的作用。对于差速贴壁的时间控制在50min—1h之间，时间过短，成纤维细胞贴壁不牢固，时间过长，心肌细胞也贴壁生长了，对于细胞培养上清中加入brdu，可以抑制成纤维细胞的生长。
在获得了上述的鸡胚细胞后可以进行间接免疫组织化学鉴定，具体步骤如下：下述百分比均为体积分数；
(1)铺板：将通过上述方法获得的鸡胚心肌细胞以2×105个/ml的密度加到24孔细胞板上，每孔500μl，大约48h后细胞长成单层；
(2)0.01mph7.2pbs洗涤3次；然后每孔加入200μl预冷的4％多聚甲醛，室温固定15min，最后采用0.01mph7.2pbs再洗涤3次；
(3)使用2％tritonx-100(北京索莱宝科技有限公司)200μl/孔，室温10min，之后再pbs洗涤3次。
(4)每孔加入兔抗鸡α-actin多克隆抗体(abcam)200μl，37℃温箱中作用1h；
(5)pbs洗涤5min×4次；之后每孔加入100μlfitc标记的羊抗兔二抗(北京博奥森生物技术有限公司)，37℃温箱避光作用1h；
(6)pbs洗涤，5min×4次；四蒸水洗10min×1次，除水避光干燥后镜检：
培养的心肌细胞胞体较大，呈梭形、星形、三角形等多种形态，胞核椭圆位居中央，细胞间常有轴突相连，核近圆形；培养3-5d之后细胞连成片，95％的抗α-actin间接免疫荧光化学染色阳性的心肌细胞成片同步收缩，证明已经建立了良好的分离培养鸡胚心肌细胞的方法。
综上所述，本发明采用11日龄的鸡胚作为分离对象，操作简单更主要是体现了动物福利的进步，利用差速贴壁法减少成纤维细胞的污染，该方法简单易行，可以获得纯度较高的心肌细胞，从而使心肌细胞贴壁。本发明参照哺乳动物心肌细胞培养和鉴定方法加以改进，形成比较稳定可靠的鸡胚心肌细胞培养和鉴定技术，能够提供足量心肌细胞用于研究工作。
附图说明
图1为采用本发明方法培养48h之后的心肌细胞图；
其中左侧是白光下心肌细胞的形态(200×)；
右侧是间接免疫荧光鉴定细胞的结果(200×)，其中心肌细胞细胞质会被标记成绿色(图中灰色部分)，不是心肌细胞，细胞没有绿色荧光。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)选取11日龄的spf鸡胚，用碘伏和75％的酒精先后擦拭蛋壳；镊子敲开鸡蛋气室端，撕去薄膜，镊子拉出鸡胚；
(2)镊子夹住龙骨突，剪刀从龙骨突两侧剪开，暴露心脏；剪取心尖，置于呈有pbs的25ml小烧杯中，先后洗五次，pbs基本无血色为止；
(3)夹出上述处理后的心尖置于培养皿中，剪刀剪碎至细沙状，每10个心脏加入8mlⅰ型胶原酶，酶浓度为1mg/ml，用0.01mph7.2pbs溶液配置；4℃消化14-16h；
(4)取培养皿，加入2ml含20vt％fbs的高糖dmem终止消化；巴士吸管吹散混匀心脏颗粒，吸出过滤，置于离心管，800r/min离心10min，弃上清；
(5)用10ml含20vt％fbs的高糖dmem重悬，分装入培养皿，37℃差速贴壁50-60min，然后将差速贴壁后产生的上清转移到离心管中；
(6)将上述离心管中的上清用巴士吸管吹打混匀后，按照2×105个/ml的密度加到6孔细胞板上，每孔2ml，加入brdu抑制成纤维细胞，每孔中brdu终浓度为0.1mm/l，24-48小时后细胞长成单层，分离培养结束，观察细胞生长状况。
实施例2
(1)铺板：将通过上述方法获得的鸡胚心肌细胞以2×105个/ml的密度加到24孔细胞板上，每孔500μl，大约48h后细胞长成单层；
(2)0.01mph7.2pbs洗涤3次；然后每孔加入200μl预冷的4vt％多聚甲醛，室温固定15min，最后采用0.01mph7.2pbs再洗涤3次；
(3)使用2vt％tritonx-100(北京索莱宝科技有限公司)200μl/孔，室温10min，之后再pbs洗涤3次。
(4)每孔加入兔抗鸡α-actin多克隆抗体(abcom)200μl，37℃温箱中作用1h；
(5)pbs洗涤5min×4次；之后每孔加入100μlfitc标记的羊抗兔二抗(北京博奥森生物技术有限公司)，37℃温箱避光作用1h；
(6)pbs洗涤，5min×4次；四蒸水洗10min×1次，除水避光干燥后镜检：
结果如图1所示，培养的心肌细胞胞体较大，呈梭形、星形、三角形等多种形态，胞核椭圆位居中央，细胞间常有轴突相连，核近圆形(如附图1左侧所示)；培养3-5d之后细胞连成片，95％的抗α-actin间接免疫荧光化学染色阳性的心肌细胞成片同步收缩(如附图1右侧所示)，证明已经建立了良好的分离培养鸡胚心肌细胞的方法。