本发明涉及一种含苯并异噁唑基团的螺嘧啶三酮类化合物、其药物组合物及其制备方法和在抗感染药物中的用途。
背景技术：
随着抗菌药物的广泛使用，甚至是滥用，致病菌的多重耐药性已成为一个威胁人类健康的严重问题，以多药耐药的金黄色葡萄球菌mrsa为代表的一系列耐药病原体，给临床治疗带来巨大挑战。近年来虽然有一些新型抗菌药物如利奈唑胺、达托霉素等上市，能有效的控制mrsa等革兰氏阳性菌的感染，但随着10余年的临床应用，细菌对这些药物也开始慢慢产生耐药菌株。因此，研发作用机制新颖、结构独特、对耐药菌有效的全新型抗菌药，是急迫的科研任务，也是未满足的重大临床需求。
苯并异噁唑螺嘧啶三酮类化合物是一类新型的细菌ii型拓扑异构酶抑制剂，虽然其与喹诺酮类药物都是作用于细菌ii型拓扑异构酶，但其具体作用区域和作用机制完全不同。苯并异噁唑螺嘧啶三酮类化合物的新颖化学结构和全新作用机制，使其对敏感和耐药的革兰氏阳性菌都具有良好抗菌活性，且与临床已有抗菌药物不存在交叉耐药性。
阿斯利康等公司报道了一系列螺嘧啶三酮类化合物，并对其构效关系做了初步研究后发现，异噁唑上甲基取代的螺嘧啶三酮类化合物具有良好的抗菌活性。阿斯利康继续对此类化合物进行衍生化研究，进而发现了活性更好的azd0914，同时消除了此类化合物的基因毒性和骨髓毒性，目前，azd0914正在进行ii期临床研究。
但是，这些螺嘧啶三酮化合物如azd0914还是存在抗菌活性不强、代谢性质不理想导致临床用药过量大的问题，在一定程度上限制了其作为治疗系统性感染药物的可能性。
因此本领域尚需开发活性更好、代谢性质更优的用于人或动物系统性感染的螺嘧啶三酮类化合物克服其上述问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种活性更好、代谢性质更优的苯并异恶唑螺嘧啶三酮类化合物，其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，以及其药学上可接受的盐。
本发明的第一方面，提供一种通式(i)所示的化合物，或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐，
式中，r1为氢、卤素或氰基；
r2、r3独立为氢原子或c1-c3烷基；或者r2、r3与相连的碳原子共同形成3-7元脂肪环或3-7元含氧杂环；
r4为氢原子或c1-c3烷基；
各*独立表示消旋、s型或r型；
条件是当r1为卤素时，r2、r3与相连的碳原子共同形成3-7元脂肪环或3-7元含氧杂环。
本发明的通式(i)表示化合物中至少含有3个手性中心，其存在对映异构体和非对映异构体。对于对映异构体，采用一般的手性拆分方法或不对称合成方法可以得到两个对映体。对于非对映异构体，可以通过分步重结晶或者色谱分离等方法分离。本发明的通式(i)表示的化合物包括上述异构体中的任何一种或者它们的混合物。
在另一优选例中，r2、r3与相连的碳原子共同形成3-7元脂肪环或3-7元含氧杂环。
在另一优选例中，r2、r3同时为氢或不同时为氢。
在另一优选例中，r1为氢、氟、氯或氰基。
在另一优选例中，r1为氢、氟或氯；r2、r3与相连的碳原子共同形成3-7元脂肪环或3-7元含氧杂环。
在另一优选例中，r1为氢、氟或氯；r4为氢。
在另一优选例中，r2、r3与相连的碳原子共同形成3-7元脂肪环或3-7元含氧杂环；r4为氢。
在另一优选例中，r1为氰基；
r2、r3独立为氢原子或c1-c3烷基；或者r2、r3与相连的碳原子共同形成3-7元脂肪环。
在另一优选例中，所述化合物为：
本发明的第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的化合物或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐；以及
药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明提供新型的苯并异恶唑螺嘧啶三酮类化合物，可以单独使用，或者将其与可药用的辅料(例如赋形剂、稀释剂等)混合，配制成口服给药的片剂、胶囊剂、颗粒剂或糖浆剂等。该药物组合物可以按照制药学上常规方法制得。
本发明的第三方面，提供第一方面所述的化合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(i)中间体ia经分子内亲核取代反应生成中间体ib；
(ii)中间体ib经亲核取代反应生成中间体ic；
(iii)中间体ic经催化水解反应生成中间体id；
(iv)中间体id经亲核取代反应生成中间体ie；
(v)中间体ie与巴比妥酸反应生成通式i所示的化合物，
各式中，*、r1、r2、r3和r4的定义如前所述。
在另一优选例中，中间体ia与碳酸铯经分子内亲核取代反应生成中间体ib。
在另一优选例中，中间体ib与n,n'-羰基二咪唑经亲核取代反应生成中间体ic。
在另一优选例中，中间体id与2r,6r-二甲基吗啉经亲核取代反应生成中间体ie。
在另一优选例中，中间体ic经盐酸催化水解反应生成中间体id
本发明的第四方面，提供第一方面所述的化合物的制备方法，r1为氰基时，所述方法包括以下步骤：
(i’)中间体i-12经水解反应生成中间体i-13；
(ii’)中间体i-13经分子内亲核取代反应生成中间体i-14；
(iii’)中间体i-14经亲核取代反应生成中间体i-15；
(iv’)中间体i-15经亲核取代反应生成中间体i-16；
(v’)中间体i-16与巴比妥酸反应生成式c所示的权利要求1所述的化合物，
各式中，*、r2、r3和r4的定义如前所述。
在另一优选例中，中间体i-12经盐酸催化发生水解反应生成中间体i-13
在另一优选例中，中间体i-13与碳酸氢钠经分子内亲核取代反应生成中间体i-14。
在另一优选例中，中间体i-14与2r,6r-二甲基吗啉经亲核取代反应生成中间体i-15。
在另一优选例中，中间体i-15与n,n'-羰基二咪唑经亲核取代反应生成中间体i-16。
本发明的第五方面，提供第一方面所述的化合物或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐，或第二方面所述的药物组合物的用途，用于制备治疗细菌感染性疾病的药物。
在另一优选例中，所述感染性疾病为革兰氏阳性菌引起的感染性疾病。
在另一优选例中，所述感染性疾病为多药耐药菌引起的感染性疾病。
在另一优选例中，所述多药耐药菌选自下组：mrsa、mssa、mrse、msse、prsp和spy。
本发明的第六方面，提供一种体外抑菌方法，向对象或环境中施用第一方面所述的化合物或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐，或第二方面所述的药物组合物。
本发明的第七方面，提供一种式i化合物中间体，其结构如式ia、ib、ic、id或ie所示：
各式中，*、r1、r2、r3和r4的定义如前所述。
本发明的化合物，具有较佳的体外、体内抗菌活性，优良的体内代谢性质，暴露量和达峰浓度远远优于阳性对照药物azd0914，且本发明化合物比阳性对照药azd0914具有更好的成药性，有望成为更好的抗菌药物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入地研究，对azd0914进行各种结构修饰，特别是噁唑烷酮环上引入螺环结构，合成了一系列结构新颖的螺嘧啶三酮类化合物，发现其体外、体内抗菌活性、药物代谢性质大大优于azd0914，很适合作为新型抗菌药物用于人或动物的抗菌治疗感染。在此基础上，完成了本发明。
术语
在本发明中，术语“c1-c3烷基”是指具有1至3个碳原子的直链或支链烷基，非限制性地包括甲基、乙基、丙基、异丙基。
在本发明中，术语“3-7元脂肪环”是指在环上具有3至7个碳原子的环状烷基，非限制性地包括环丙烷环、环丁烷环、环戊烷环、环己烷环、环庚烷环等。
在本发明中，术语“3-7元含氧杂环”是指具有3-7个环原子且包含1、2或3个o原子的环烷基环，非限制性地包括环氧丙烷环、环氧丁烷环、环氧庚烷环等。
所述“药学上可接受的盐”包括药学可接受的碱加成盐。包括但不限于无机碱的盐如钠盐，钾盐，钙盐和镁盐等。包括但不限于有机碱的盐，比如铵盐，三乙胺盐，赖氨酸盐，精氨酸盐等。这些盐可通过本专业已知的方法制备。
制备方法
本发明(i)所示化合物可通过如下的方法制得，然而该方法的条件，例如反应物、溶剂、碱、所用化合物的量、反应温度、反应所需时间等不限于下面的解释。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便地制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易的进行。
路线1
在优选实施方式中，以路线1制备化合物1、化合物2、化合物3和化合物4。
r2、r3和r4定义如前。
a、将中间体a[j.med.chem,2015,58(15):6264-6282.]与n-氯代丁二酰亚胺在极性非质子性溶剂中，于室温至50℃条件下反应20-60min(分钟)，得到中间体i-1，所述极性非质子性溶剂可以是：1，4-二氧六环、甲苯、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺，最佳反应温度为40℃，最佳反应时间为30min。
b、中间体i-1分别在不同的伯胺的存在下，在极性非质子性溶剂中，于0℃到室温反应20-60min，亲核取代生成相对应的中间体i-2，所述伯胺为各种符合要求的伯胺，所述极性非质子性溶剂可以是：1，4-二氧六环、甲苯、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺，最佳反应温度为0℃，最佳反应时间为30min。
c、中间体i-2在碳酸铯的存在下，在极性非质子性溶剂中，于室温至70℃反应2-5h(小时)，生成相对应的中间体i-3，所述极性非质子性溶剂可以是：1，4-二氧六环、甲苯、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺，最佳反应温度为60℃，最佳反应时间为3h。
d、中间体i-3与n,n'-羰基二咪唑在4-二甲氨基吡啶的催化下，在极性非质子性溶剂中，于60-90℃反应3-8h，生成相对应的中间体i-4，所述极性非质子性溶剂可以是：1，4-二氧六环、甲苯、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺，最佳反应温度为80℃，最佳反应时间为5h。
e、中间体i-4和盐酸，在溶剂中于室温至50℃下反应2-5h，生成相对应的中间体i-5，所述溶剂可以是1，4-二氧六环、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺，最佳反应温度为30℃，最佳反应时间为3h。
f、中间体i-5与2r,6r-二甲基吗啉，在有机碱存在下，于极性非质子性溶剂中，在70-100℃反应12-20h，生成相对应的中间体i-6，所述有机碱可以是三乙胺或n,n-二异丙基乙胺，所述的极性非质子溶剂可以为乙腈、1，4-二氧六环、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺，最佳反应温度为80℃，最佳反应时间为15h。
g、中间体i-6与巴比妥酸，在醋酸和水的混合溶剂中，与100-120℃反应4-7h，生成相对应的化合物b，最佳反应温度为100℃，最佳反应时间为5h。
路线2
在优选实施方式中，以路线2制备化合物5、化合物6和化合物7。
a、2,6-二氟苯腈与二异丙基氨基锂、n,n-二甲基甲酰胺，在极性非质子性溶剂中，于-80～-65℃反应3-8min，生成中间体i-7，所述极性非质子性溶剂可以是四氢呋喃、二氯甲烷，最佳反应温度为-80℃，最佳反应时间为5min。
b、中间体i-7与乙二醇，在对甲苯磺酸催化条件下，于甲苯溶剂中，100-130℃反应3-8h，生成中间体i-8，最佳反应温度为120℃，最佳反应时间为4h。
c、中间体i-8与二异丙基氨基锂、n,n-二甲基甲酰胺，在极性非质子性溶剂中，于-80～-65℃反应20-60min，生成中间体i-9，所述极性非质子性溶剂可以是四氢呋喃、二氯甲烷，最佳反应温度为-80℃，最佳反应时间为30min。
d、中间体i-9与盐酸羟胺，在有机碱条件下，于极性溶剂中，于0℃至室温反应1-3h，生成中间体i-10，所述有机碱可以是吡啶、三乙胺或n,n-二异丙基乙胺，所述的极性溶剂可以为甲醇、二氯甲烷、1，4-二氧六环、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺，最佳反应温度为0℃，最佳反应时间为2h。
e、中间体i-10与n-氯代丁二酰亚胺，在极性非质子性溶剂中，于室温至50℃条件下反应20-60min，得到中间体i-11，所述极性非质子性溶剂可以是：1，4-二氧六环、甲苯、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺，最佳反应温度为40℃，最佳反应时间为30min。
f、中间体i-11与各种符合条件的伯胺，在极性非质子性溶剂中，于0℃至室温反应10-60min，亲核取代生成中间体i-12，所述极性非质子性溶剂可以是：1，4-二氧六环、甲苯、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺，最佳反应温度为0℃，最佳反应时间为30min。
g、中间体i-12与盐酸，在溶剂中于室温至50℃下反应2-5h，生成中间体i-13，所述溶剂可以是：1，4-二氧六环、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺，最佳反应温度为40℃，最佳反应时间为3h。
h、中间体i-13与碳酸氢钠水溶液，在溶剂中于0℃至40℃下反应1-4h，生成中间体i-14，所述溶剂可以是：1，4-二氧六环、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺，最佳反应温度为25℃，最佳反应时间为2h。
i、中间体i-14与2r,6r-二甲基吗啉，在有机碱存在下，于极性非质子性溶剂中，在70-100℃反应12-20h，生成中间体i-15，所述有机碱可以是三乙胺或n,n-二异丙基乙胺，所述的极性非质子溶剂可以为乙腈、1，4-二氧六环、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺，最佳反应温度为80℃，最佳反应时间为12h。
j、中间体i-15与n,n'-羰基二咪唑，在4-二甲氨基吡啶的催化下，在极性非质子性溶剂中，于60-90℃反应3-8h，生成相对应的中间体i-16，所述极性非质子性溶剂可以是：1，4-二氧六环、甲苯、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺，最佳反应温度为80℃，最佳反应时间为5h。
k、中间体i-16与巴比妥酸，在醋酸和水的混合溶剂中，于100-120℃反应4-7h，生成化合物c，最佳反应温度为110℃，最佳反应时间为5h。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它包含安全有效量范围内的活性成分，以及药学上可接受的载体。
本发明所述的“活性成分”是指本发明所述的式i化合物。
本发明所述的“活性成分”和药物组合物用于制备治疗感染性疾病的药物。在另一优选例中，用于制备预防和/或治疗多药耐药菌引起的感染性疾病的药物。
“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg活性成分/剂，更佳地，含有10-200mg活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个药片。
“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如
本发明的活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)等。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他治疗药物(如抗菌药)联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
以下所有实施例中，1h-nmr用varianmercury400核磁共振仪记录，13c-nmr用bruker500mhz核磁共振仪(低温)记录，化学位移以δ(ppm)表示；分离用硅胶，未说明均为200-300目，洗脱液的配比均为体积比。
实施例1：(2r,4s,4as)-11-氟-2,4-二甲基-8-(5-氧代-4-氧-6-氮杂螺[2.4]庚烷-6-基)-1,2,4,4a-四氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-2',4',6'(1'h,3'h)-三酮(化合物1)
(a)1-(((5-(1,3-二氧戊环-2-基)-6,7-二氟苯并[d]异噁唑-3-基)氨基)甲基)-1-环丙醇(i-3-1)
将中间体a(1g，4.048mmol)加入到20mln,n-二甲基甲酰胺中，搅拌使其溶解，室温下加入n-氯代丁二酰亚胺(650mg，4.868mmol)，升至40℃反应30min，tlc(薄层色谱法)监测反应完全，将反应液将至0℃，缓慢加入1-氨甲基-1-环丙醇(1.06g，12.144mmol)，恢复至室温反应1h，tlc监测反应完全，加入碳酸铯(4.567g，12.144mmol)，升至60℃反应2h，tlc监测反应完全，降至室温，加水加乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩柱层析[石油醚：乙酸乙酯＝1:1]，得白色固体810mg，收率65％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.53(dd,j＝5.4,1.5hz,1h),6.13(s,1h),4.79(t,j＝5.6hz,1h),4.22–4.09(m,4h),3.58(d,j＝5.5hz,2h),2.65(s,1h),0.95(t,j＝6.2hz,2h),0.75(t,j＝6.2hz,2h)。
(b)6-(5-((1,3-二氧戊环-2-基)-6,7-二氟苯并[d]异噁唑-3-基)-4-氧-6-氮杂螺[2.4]庚烷-5-酮(i-4-1)
将中间体i-3-1(344mg，1.036mmol)加入到15mln,n-二甲基甲酰胺中，搅拌使其溶解，分别依次加入羰基二咪唑(671mg，4.414mmol)和4-二甲氨基吡啶(63mg，0.52mmol)，加热到115℃反应8h，tlc监测反应完全，冷却至室温，加水加乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩柱层析[石油醚：乙酸乙酯＝2:1]，得白色固体337mg，收率96％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.55(dd,j＝5.9,1.9hz,1h),6.16(s,1h),4.31(s,2h),4.22–4.09(m,4h),1.44–1.39(m,2h),0.98–0.92(m,2h)。
(c)6,7-二氟-3-(5-氧代-4-氧-6-氮杂螺[2.4]庚烷-6-基)苯并[d]异噁唑-5-甲醛(i-5-1)
将中间体i-4-1(330mg，0.976mmol)溶解于15ml1,4-二氧六环中，加6m盐酸(5ml)，室温下搅拌2h，tlc监测反应完全，加水加乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩柱层析[石油醚：二氯甲烷：乙酸乙酯＝5:5:1]，得白色固体285mg，收率99％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.30(s,1h),9.00(dd,j＝5.9,1.9hz,1h),4.32(s,2h),1.44(m,2h),1.00–0.95(m,2h)。
(d)6-((2r,6r)-2,6-二甲基吗啉)-7-氟-3-(5-氧代-4-氧-6-氮杂螺[2.4]庚烷-6-基)苯并[d]异噁唑-5-甲醛(i-6-1)
将中间体i-5-1(200mg，0..67mmol)溶于10ml乙腈中，搅拌使其溶解，分别依次加入2r,6r-二甲基吗啉(0.31ml，2.54mmol)和n,n-二异丙基乙胺(0.42ml，2.54mmol)，将反应液于90℃条件下回流反应10h，tlc监测反应完全，冷却至室温，加水加乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩柱层析[石油醚：乙酸乙酯＝5:1]，得淡黄色固体80mg，收率31％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.39(s,1h),8.83(s,1h),4.30(s,2h),4.29–4.22(m,2h),3.45(d,j＝11.7hz,2h),3.06(dd,j＝11.7,5.4hz,2h),1.45–1.40(m,2h),1.34(d,j＝6.5hz,6h),0.98–0.93(m,2h)。
(e)(2r,4s,4as)-11-氟-2,4-二甲基-8-(5-氧代-4-氧-6-氮杂螺[2.4]庚烷-6-基)-1,2,4,4a-四氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-2',4',6'(1'h,3'h)-三酮(化合物1)
将中间体i-6-1(80mg，0.206mmol)加入到4ml醋酸和1ml水的混合溶剂中，搅拌使其溶解，加入巴比妥酸(32mg，0.246mmol)，升至100℃反应3h，tlc监测反应完全，冷却至室温，加水加乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩反相柱制备[甲醇：水＝50:50]，得白色固体78mg，收率76％，m.p.266-267℃；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.82(s,1h),11.46(s,1h),7.76(s,1h),4.29–4.21(m,2h),4.11(d,j＝12.9hz,1h),3.94(d,j＝8.8hz,1h),3.78(brs,1h),3.72–3.62(m,2h),3.17–3.06(m,1h),2.92(d,j＝14.1hz,1h),1.24-1.19(m,2h),1.15(d,j＝6.3hz,3h),1.00–0.95(m,2h),0.90(d,j＝6.3hz,3h).13cnmr(126mhz,dmso)δ171.40,168.15,154.20(d,j＝12.8hz),153.79,153.17,149.98,135.30,133.76(d,j＝238.8hz),122.85,118.83,106.52,72.58,72.14,64.88,62.33,56.73(d,j＝9.3hz),53.38,50.71,39.02,18.64,18.61,10.32,10.26；ms(esi)m/z:[(m+1)+,500.1]。
实施例2:(2r,4s,4as)-11-氟-2,4-二甲基-8-(6-氧代-2,5-二氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)-1,2,4,4a-四氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-2',4',6'(1'h,3'h)-三酮(化合物2)
(a)3-(((5-(1,3-二氧戊环-2-基)-6,7-二氟苯并[d]异噁唑-3-基)氨基)甲基)氧杂环丁醇(i-3-2)
按照中间体i-3-1的合成方法，以中间体a(1.2g，4.857mmol)、n-氯代丁二酰亚胺(778mg，5.828mmol)、3-(氨甲基)氧杂环丁醇(1.25g，12.142mmol)和碳酸铯(4.748g，14.571mmol)为原料，合成1-(((5-(1,3-二氧戊环-2-基)-6,7-二氟苯并[d]异噁唑-3-基)氨基)甲基)氧杂环丁醇949mg，白色固体，收率59.5％，1hnmr(400mhz,dmso)δ8.08(d,j＝5.7hz,1h),7.41(t,j＝5.7hz,1h),6.09(s,1h),6.01(s,1h),4.48(dd,j＝15.1,6.6hz,4h),4.12–3.99(m,4h),3.55(d,j＝5.8hz,2h)。
(b)7-(5-((1,3-二氧戊环-2-基)-6,7-二氟苯并[d]异噁唑-3-基)-2,5-二氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-6-酮(i-4-2)
按照中间体i-4-1的合成方法，以中间体i-3-2(940mg，2.86mmol)、n,n'-羰基二咪唑(1.857g，11.45mmol)和4-二甲基氨基吡啶(175mg，1.43mmol)为原料，合成7-(5-((1,3-二氧戊环-2-基)-6,7-二氟苯并[d]异噁唑-3-基)-2,5-二氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-6-酮872mg，白色固体，收率86％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.44(dd,j＝5.9,1.8hz,1h),6.12(s,1h),5.10(d,j＝8.8hz,2h),4.82(d,j＝8.7hz,2h),4.49(s,2h),4.20–4.04(m,4h)。
(c)6,7-二氟-3-(6-氧代-2,5-二氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)苯并[d]异噁唑-5-甲醛(i-5-2)
按照中间体i-5-1的合成方法，以中间体i-4-2(885mg，2.498mmol)和6m盐酸(30ml)为原料，合成6,7-二氟-3-(6-氧代-2,5-二氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)苯并[d]异噁唑-5-甲醛580mg，白色固体，收率75％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.31(s,1h),8.91(dd,j＝5.8,1.8hz,1h),5.14(d,j＝9.0hz,2h),4.85(d,j＝8.7hz,2h),4.53(s,2h)。
(d)6-((2r,6r)-2,6-二甲基吗啉)-7-氟-3-(6-氧代-2,5-二氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)苯并[d]异噁唑-5-甲醛(i-6-2)
按照中间体i-6-1的合成方法，以中间体i-5-2(150mg，0.484mmol)、2r,6r-二甲基吗啉(139mg，1.209mmol)和n，n-二异丙基乙胺(187mg，1.451mmol)为原料，合成6-((2r,6r)-2,6-二甲基吗啉)-7-氟-3-(6-氧代-2,5-二氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)苯并[d]异噁唑-5-甲醛172mg，白色固体，收率87％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.37(s,1h),8.71(s,1h),5.14(d,j＝8.3hz,2h),4.85(d,j＝8.2hz,2h),4.50(s,2h),4.30–4.22(m,2h),3.45(d,j＝12.0hz,2h),3.06(dd,j＝11.7,5.6hz,2h),1.34(d,j＝6.5hz,6h)。
(e)(2r,4s,4as)-11-氟-2,4-二甲基-8-(6-氧代-2,5-二氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)-1,2,4,4a-四氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-2',4',6'(1'h,3'h)-三酮(化合物2)
按照化合物1的合成方法，以中间体i-6-2(93mg，0.229mmol)和巴比妥酸(33mg，0.252mmol)为原料，合成(2r,4s,4as)-11-氟-2,4-二甲基-8-(6-氧代-2,5-二氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)-1,2,4,4a-四氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-2',4',6'(1'h,3'h)-三酮90mg，白色固体，收率76％，1hnmr(400mhz,dmso)δ11.63(s,2h),7.73(s,1h),4.86–4.76(m,4h),4.43–4.36(m,2h),4.10(d,j＝12.5hz,1h),3.93(d,j＝8.9hz,1h),3.83–3.74(m,1h),3.72–3.60(m,2h),3.18–3.05(m,1h),2.90(d,j＝13.7hz,1h),1.14(d,j＝6.2hz,3h),0.89(d,j＝6.4hz,3h)；13cnmr(126mhz,dmso)δ171.46,168.17,154.15(d,j＝13.0hz),152.88,152.86,150.07,135.28,133.74(d,j＝238.9hz),122.83,118.85,106.49,81.72,81.52,80.54,72.57,72.12,64.90,56.68,53.38,52.55,39.02,18.62,18.62；ms(ei)m/z:[m+,515]。
实施例3：(2r,4s,4as)-11-氟-2,4-二甲基-8-(6-氧代-5-氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)-1,2,4,4a-四氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-2',4',6'(1'h,3'h)-三酮(化合物3)
(a)1-(((5-(1,3-二氧戊环-2-基)-6,7-二氟苯并[d]异噁唑-3-基)氨基)甲基)环丁醇(i-3-3)
按照中间体i-3-1的合成方法，以中间体a(750mg，3.036mmol)、n-氯代丁二酰亚胺(527mg，3.947mmol)、1-(氨甲基)环丁醇(675mg，6.679mmol)和碳酸铯(3.957g，12.144mmol)为原料，合成1-(((5-(1,3-二氧戊环-2-基)-6,7-二氟苯并[d]异噁唑-3-基)氨基)甲基)环丁醇710mg，白色固体，收率72％，1hnmr(400mhz,dmso)δ8.15(d,j＝5.9hz,1h),7.23(t,j＝5.4hz,1h),6.08(s,1h),5.27(s,1h),4.11–3.99(m,4h),3.34(d,j＝5.6hz,2h),2.12–1.92(m,4h),1.72–1.45(m,2h)。
(b)7-(5-((1,3-二氧戊环-2-基)-6,7-二氟苯并[d]异噁唑-3-基)-5-氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-6-酮(i-4-3)
按照中间体i-4-1的合成方法，以中间体i-3-3(533mg，1.63mmol)、n,n'-羰基二咪唑(1.059g，6.53mmol)和4-二甲基氨基吡啶(100mg，0.82mmol)为原料，合成7-(5-((1,3-二氧戊环-2-基)-6,7-二氟苯并[d]异噁唑-3-基)-5-氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-6-酮468mg，白色固体，收率82％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.51(dd,j＝5.9,1.8hz,1h),6.15(s,1h),4.26(s,2h),4.22–4.07(m,4h),2.71(ddd,j＝19.3,10.1,2.9hz,2h),2.38(ddd,j＝11.4,8.5,3.7hz,2h),2.09–1.97(m,1h),1.85–1.71(m,1h)。
(c)6,7-二氟-3-(6-氧代-5-氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)苯并[d]异噁唑-5-甲醛(i-5-3)
按照中间体i-5-1的合成方法，以中间体i-4-3(468mg，1.328mmol)和6m盐酸(15ml)为原料，合成6,7-二氟-3-(6-氧代-5-氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)苯并[d]异噁唑-5-甲醛380mg，白色固体，收率93％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.29(s,1h),8.95(dd,j＝5.8,1.7hz,1h),4.27(s,2h),2.73(ddd,j＝19.5,10.1,2.9hz,2h),2.44–2.35(m,2h),2.10–2.00(m,1h),1.87–1.74(m,1h)。
(d)6-((2r,6r)-2,6-二甲基吗啉)-7-氟-3-(6-氧代-5-氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)苯并[d]异噁唑-5-甲醛(i-6-3)
按照中间体i-6-1的合成方法，以中间体i-5-3(100mg，0.324mmol)、2r,6r-二甲基吗啉(75mg，0.649mmol)和n，n-二异丙基乙胺(126mg，0.973mmol)为原料，合成6-((2r,6r)-2,6-二甲基吗啉)-7-氟-3-(6-氧代-5-氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)苯并[d]异噁唑-5-甲醛103mg，白色固体，收率79％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.38(s,1h),8.79(s,1h),4.31–4.20(m,4h),3.44(d,j＝12.1hz,2h),3.05(dd,j＝11.9,5.6hz,2h),2.72(ddd,j＝19.8,10.0,3.2hz,2h),2.43–2.34(m,2h),2.10–1.98(m,1h),1.85–1.73(m,1h),1.34(d,j＝6.4hz,6h)。
(e)(2r,4s,4as)-11-氟-2,4-二甲基-8-(6-氧代-5-氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)-1,2,4,4a-四氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-2',4',6'(1'h,3'h)-三酮(化合物3)
按照化合物1的合成方法，以中间体i-6-3(92mg，0.228mmol)和巴比妥酸(32mg，0.251mmol)为原料，合成(2r,4s,4as)-11-氟-2,4-二甲基-8-(6-氧代-5-氧-7-氮杂螺[3.4]辛烷-7-基)-1,2,4,4a-四氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-2',4',6'(1'h,3'h)-三酮99mg，白色固体，收率84％，1hnmr(400mhz,dmso)δ11.73(s,1h),11.47(s,1h),7.70(s,1h),4.23(s,2h),4.10(d,j＝12.5hz,1h),3.93(d,j＝8.8hz,1h),3.84–3.74(m,1h),3.71–3.62(m,2h),3.17–3.05(m,1h),2.91(d,j＝13.9hz,1h),2.50–2.32(m,4h),1.89–1.63(m,2h),1.15(d,j＝6.3hz,3h),0.89(d,j＝6.3hz,3h).13cnmr(126mhz,dmso)δ171.41,168.15,154.12(d,j＝12.9hz),153.34,153.24,150.00,135.26,133.76(d,j＝238.8hz),122.77,118.81,106.65,81.39,72.57,72.13,64.87,56.73(d,j＝9.4hz),55.57,53.37,39.01,34.95,34.79,18.64,18.61,11.96；ms(ei)m/z:[m+,513]。
实施例4：(2r,4s,4as)-11-氟-2,4-二甲基-8-(2-氧代-1-氧-3-氮杂螺[4.4]壬烷-3-基)-1,2,4,4a-四氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-2',4',6'(1'h,3'h)-三酮(化合物4)
(a)1-(((5-(1,3-二氧戊环-2-基)-6,7-二氟苯并[d]异噁唑-3-基)氨基)甲基)环戊醇(i-3-4)
按照中间体i-3-1的合成方法，以中间体a(600mg，2.430mmol)、n-氯代丁二酰亚胺(422mg，3.160mmol)、1-(氨甲基)环戊醇(615mg，5.346mmol)和碳酸铯(3.167g，9.720mmol)为原料，合成1-(((5-(1,3-二氧戊环-2-基)-6,7-二氟苯并[d]异噁唑-3-基)氨基)甲基)环戊醇582mg，白色固体，收率70％，1hnmr(400mhz,dmso)δ8.13(d,j＝5.0hz,1h),7.19(t,j＝5.6hz,1h),6.08(s,1h),4.51(s,1h),4.14–3.99(m,4h),3.31(d,j＝5.8hz,2h),1.78–1.50(m,8h)。
(b)3-(5-((1,3-二氧戊环-2-基)-6,7-二氟苯并[d]异噁唑-3-基)-1-氧-3-氮杂螺[4.4]壬烷-2-酮(i-4-4)
按照中间体i-4-1的合成方法，以中间体i-3-4(526mg，1.546mmol)、n,n'-羰基二咪唑(1.002g，6.182mmol)和4-二甲基氨基吡啶(95mg，0.773mmol)为原料，合成3-(5-((1,3-二氧戊环-2-基)-6,7-二氟苯并[d]异噁唑-3-基)-1-氧-3-氮杂螺[4.4]壬烷-2-酮450mg，白色固体，收率79％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.54(dd,j＝5.9,1.7hz,1h),6.16(s,1h),4.23–4.07(m,6h),2.32–2.21(m,2h),2.03–1.80(m,6h)。
(c)6,7-二氟-3-(2-氧代-1-氧-3-氮杂螺[4.4]壬烷-3-基)苯并[d]异噁唑-5-甲醛(i-5-4)
按照中间体i-5-1的合成方法，以中间体i-4-4(158mg，0.431mmol)和6m盐酸(5ml)为原料，合成6,7-二氟-3-(2-氧代-1-氧-3-氮杂螺[4.4]壬烷-3-基)苯并[d]异噁唑-5-甲醛135mg，白色固体，收率97％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.30(s,1h),8.98(dd,j＝5.9,1.8hz,1h),4.17(s,2h),2.33–2.22(m,2h),2.08–1.81(m,6h)。
(d)6-((2r,6r)-2,6-二甲基吗啉)-7-氟-3-(2-氧代-1-氧-3-氮杂螺[4.4]壬烷-3-基)苯并[d]异噁唑-5-甲醛(i-6-4)
按照中间体i-6-1的合成方法，以中间体i-5-4(100mg，0.310mmol)、2r,6r-二甲基吗啉(72mg，0.620mmol)和n，n-二异丙基乙胺(120mg，0.931mmol)为原料，合成6-((2r,6r)-2,6-二甲基吗啉)-7-氟-3-(2-氧代-1-氧-3-氮杂螺[4.4]壬烷-3-基)苯并[d]异噁唑-5-甲醛114mg，淡白色固体，收率88％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.38(s,1h),8.81(s,1h),4.31–4.21(m,2h),4.15(s,2h),3.44(d,j＝12.1hz,2h),3.05(dd,j＝11.8,5.5hz,2h),2.28(m,2h),2.06–1.80(m,6h),1.34(d,j＝6.4hz,6h)。
(e)(2r,4s,4as)-11-氟-2,4-二甲基-8-(2-氧代-1-氧-3-氮杂螺[4.4]壬烷-3-基)-1,2,4,4a-四氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-2',4',6'(1'h,3'h)-三酮(化合物4)
按照化合物1的合成方法，以中间体i-6-4(99mg，0.237mmol)和巴比妥酸(34mg，0.261mmol)为原料，合成(2r,4s,4as)-11-氟-2,4-二甲基-8-(2-氧代-1-氧-3-氮杂螺[4.4]壬烷-3-基)-1,2,4,4a-四氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-2',4',6'(1'h,3'h)-三酮94mg，白色固体，收率75％，1hnmr(400mhz,dmso)δ11.82(s,1h),11.46(s,1h),7.73(s,1h),4.14–4.08(m,3h),3.93(d,j＝8.8hz,1h),3.83–3.74(m,1h),3.70–3.62(m,2h),3.15–3.07(m,1h),2.91(d,j＝13.7hz,1h),2.12–2.04(m,2h),1.96–1.87(m,2h),1.80–1.71(m,4h),1.15(d,j＝6.2hz,3h),0.89(d,j＝6.4hz,3h)；13cnmr(151mhz,dmso)δ170.96,167.69,153.68(d,j＝12.9hz),153.06,152.90,149.54,134.78,133.29(d,j＝238.8hz),122.23,118.53,106.19,90.29,72.12,71.68,64.42,56.27(d,j＝8.9hz),53.33,52.92,38.55,37.72,37.55,23.11,23.08,18.19,18.17；ms(ei)m/z:[m+,527]。
实施例5：(2r,4s,4as)-2,4-二甲基-2',4',6'-三氧代-8-(5-氧代-4-氧杂-6-氮杂螺[2.4]庚烷-6-基)-1,1',2,3',4,4a,4',6'-八氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-11-腈(化合物5)
(a)2,6-二氟-3-氰基苯甲醛(i-7)
室温下，将2m二异丙基氨基锂的四氢呋喃溶液(14ml，28.04mmol)加入到20ml干燥的四氢呋喃中，氩气保护下，降温至-80℃，缓慢滴加2,6-二氟苯腈(3.00g，21.57mmol)的四氢呋喃溶液，5min后，缓慢滴加n,n-二甲基甲酰胺(5.00ml，64.71mmol)，5min后，tlc监测反应完全，加入饱和氯化铵淬灭反应，升至室温，加水加乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩柱层析[石油醚：乙酸乙酯＝2:1]，得无色油状物1.72g，收率48％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.32(d,j＝0.6hz,1h),8.20(ddd,j＝8.9,7.8,6.2hz,1h),7.27–7.22(m,1h)。
(b)3-(1,3-二氧戊环-2-基)-2,6-二氟苯腈(i-8)
室温下，将中间体i-7(2.00g，11.97mmol)加入到15ml甲苯中，搅拌溶解，加入乙二醇(2.00ml，35.92mmol)和对甲苯磺酸一水合物(227mg，1.197mmol)，搭载分水器，升至110℃反应3h，tlc监测反应完全，降至室温，加水加乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩柱层析[石油醚：乙酸乙酯＝4:1]，得无色油状物1.92g，收率76％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.85–7.79(m,1h),7.12–7.06(m,1h),6.04(s,1h),4.18–4.07(m,4h)。
(c)3-(1,3-二氧戊环-2-基)-2,6-二氟-5-甲酰基苯腈(i-9)
室温下，将2m二异丙基氨基锂的四氢呋喃溶液(7.7ml，15.41mmol)加入到15ml干燥的四氢呋喃中，氩气保护下，降温至-80℃，缓慢滴加中间体i-8(2.71g，12.84mmol)的四氢呋喃溶液，30min后，缓慢滴加n,n-二甲基甲酰胺(2.97ml，38.52mmol)，30min后，tlc监测反应完全，加入饱和氯化铵淬灭反应，升至室温，加水加乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩柱层析[石油醚：乙酸乙酯＝5:1]，得无色油状物1.95g，收率64％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.31(s,1h),8.36(t,j＝7.7hz,1h),6.07(s,1h),4.21–4.06(m,4h)。
(d)3-(1,3-二氧戊环-2-基)-2,6-二氟-5-((肟基)甲基)苯腈(i-10)
冰浴条件下，将中间体i-9(700mg，2.929mmol)加入到20ml甲醇中，搅拌使其溶解，依次加入盐酸羟胺(224mg，3.222mmol)和吡啶(0.31ml，3.808mmol)，升至室温搅拌1h，tlc监测反应完全，加水加乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩柱层析[石油醚：乙酸乙酯＝2:1]，得白色固体720mg，收率96％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.28(s,1h),8.23(t,j＝7.8hz,1h),7.79(s,1h),6.02(s,1h),4.17–4.05(m,4h)。
(e)3-氰基-5-(1,3-二氧戊环-2-基)-2,4-二氟-n'-羟基-n-((1-羟基环丙基)甲基)苯甲脒(i-12-5)
室温下，将中间体i-10(400mg，1.574mmol)加入到20mln,n-二甲基甲酰胺中，搅拌使其溶解，加入n-氯代丁二酰亚胺(252mg，1.889mmol)，升至40℃反应30min，tlc监测反应完全，将反应液降至0℃，缓慢滴加1-氨甲基-1-环丙醇(343mg，3.935mmol)，10min后，tlc监测反应完全，加水加乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩柱层析[石油醚：乙酸乙酯＝1:3]，得淡黄色粉末150mg，收率28％，1hnmr(400mhz,dmso)δ10.05(s,1h),7.85(t,j＝8.0hz,1h),6.07–6.02(m,2h),5.27(s,1h),4.10–3.97(m,4h),2.90(d,j＝6.4hz,2h),0.48(dd,j＝6.7,4.8hz,2h),0.37(dd,j＝6.5,4.6hz,2h)。
(f)6-氟-5-甲酰基-3-(((1-羟基环丙基)甲基)氨基)苯并[d]异噁唑-7-腈(i-14-5)
室温下，将中间体i-12-5(150mg，0.442mmol)加入到10ml1,4-二氧六环中，加6m盐酸(4ml)，升至35℃搅拌2h，tlc监测反应完全，将反应液降至0℃，加饱和碳酸氢钠水溶液调ph值至9，搅拌30min，tlc监测反应完全，加水加乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩柱层析[石油醚：乙酸乙酯＝1:3]，得黄色粉末83mg，收率68％，1hnmr(400mhz,dmso)δ10.17(s,1h),8.97(d,j＝6.6hz,1h),7.79(t,j＝5.4hz,1h),5.49(s,1h),3.36(d,j＝5.9hz,2h),0.63(d,j＝7.3hz,4h)。
(g)6-((2r,6r)-2,6-二甲基吗啉)-5-甲酰基-3-(((1-羟基环丙基)甲基)氨基)苯并[d]异噁唑-7-腈(i-15-5)
室温下，将中间体i-14-5(83mg，0.323mmol)加入到20ml乙腈中，加入2r,6r-二甲基吗啉(0.065ml，0.484mmol)和n,n-二异丙基乙基胺(0.110ml，0.646mmol)，升至40℃搅拌2h，tlc监测反应完全，降至室温，直接拌样柱层析[石油醚：乙酸乙酯＝2:3]，得黄色固体50mg，收率42％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.18(s,1h),8.22(s,1h),5.23(t,j＝5.3hz,1h),4.37–4.28(m,2h),3.76(dd,j＝12.3,3.0hz,2h),3.56(d,j＝5.4hz,2h),3.27(dd,j＝12.3,5.7hz,2h),1.34(d,j＝6.5hz,6h),0.95(dd,j＝6.5,5.7hz,2h),0.76(dd,j＝6.8,5.5hz,2h)。
(h)6-((2r,6r)-2,6-二甲基吗啉)-5-甲酰基-3-(5-氧代-4-氧杂-6-氮杂螺[2.4]庚烷-6-基)苯并[d]异噁唑-7-腈(i-16-5)
按照中间体i-4-1的合成方法，以中间体i-15-5(50mg，0.135mmol)、n,n-羰基二咪唑(44mg，0.270mmol)、4-二甲氨基吡啶(17mg，0.135mmol)为原料，制得黄色固体20mg，收率38％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.06(s,1h),9.17(s,1h),4.40–4.32(m,2h),4.30(d,j＝2.3hz,2h),3.80(dd,j＝12.7,2.9hz,2h),3.23(dd,j＝12.7,6.0hz,2h),1.43(t,j＝7.4hz,2h),1.32(d,j＝6.4hz,6h),0.99–0.94(m,2h)。
(i)(2r,4s,4as)-2,4-二甲基-2',4',6'-三氧代-8-(5-氧代-4-氧杂-6-氮杂螺[2.4]庚烷-6-基)-1,1',2,3',4,4a,4',6'-八氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-11-腈(化合物5)
以中间体i-16-5(20mg，0.050mmol)和巴比妥酸(8mg，0.060mmol)为原料，按照化合物1的合成方法，制得淡黄色固体15mg，收率59％，1hnmr(400mhz,dmso)δ11.75(s,2h),8.08(s,1h),4.56(d,j＝13.4hz,1h),4.23(s,2h),4.05(d,j＝8.9hz,1h),3.87–3.80(m,1h),3.75(d,j＝14.6hz,1h),3.70–3.63(m,1h),3.26(dd,j＝14.6,10.3hz,1h),2.86(d,j＝14.3hz,1h),1.20(t,j＝7.1hz,2h),1.18(d,j＝6.2hz,3h),0.97(t,j＝7.1hz,2h),0.92(d,j＝6.3hz,3h)；13cnmr(126mhz,dmso)δ171.22,168.39,166.83,153.87,153.32,151.45,150.24,127.89,121.77,115.55,104.11,76.30,72.83,72.72,66.01,62.47,56.45,52.58,50.54,38.31,18.52,18.16,10.30,10.24；ms(ei)m/z:[m+,506]。
实施例6、(2r,4s,4as)-2,4-二甲基-8-((s)-4-甲基-2-氧代噁唑-3-基)-2',4',6'-三氧代-1,1',2,3',4,4a,4',6'-八氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-11-甲腈(化合物6)
(a)(s)-3-氰基-5-(1,3-二氧戊环-2-基)-2,4-二氟-n'-羟基-n-(1-羟基丙烷-2-基)苯甲脒(i-12-6)
以中间体i-10(300mg，1.181mmol)、n-氯代丁二酰亚胺(189mg，1.417mmol)和(s)-2-氨基-1-丙醇(0.200ml，2.598mmol)为原料，按照中间体i-12-5的合成方法，制得棕黄色油状物299mg，收率77％，1hnmr(400mhz,cd3od)δ10.03(s,1h),7.86(t,j＝7.9hz,1h),6.05(s,1h),5.79(d,j＝10.5hz,1h),4.67(t,j＝5.4hz,1h),4.09–3.99(m,5h),3.23(t,j＝5.4hz,2h),0.99(d,j＝6.5hz,3h)。
(b)(s)-6-氟-5-甲酰基-3-((1-羟基丙烷-2-基)氨基)苯并[d]异噁唑-7-甲腈(i-14-6)
以中间体i-12-6(200mg，0.612mmol)、6m盐酸(5ml)和碳酸氢钠饱和水溶液为原料，按照中间体i-14-5的合成方法，制得白色固体70mg，收率44％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.35(s,1h),8.40(d,j＝6.2hz,1h),5.00(d,j＝6.4hz,1h),3.97(dd,j＝21.6,7.8hz,2h),3.76–3.70(m,1h),1.92(t,j＝4.6hz,1h),1.40(d,j＝6.6hz,3h)。
(c)6-((2r,6r)-2,6-二甲基吗啉)-5-甲酰基-3-(((s)-1-羟基丙烷-2-基)氨基)苯并[d]异噁唑-7-甲腈(i-15-6)
以中间体i-14-6(70mg，0.266mmol)、2r,6r-二甲基吗啉(0.037ml，0.277mmol)、n,n-二异丙基乙基胺(0.057ml，0.333mmol)为原料，按照中间体i-15-5的合成方法，制得黄色固体67mg，收率70％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.18(s,1h),8.18(s,1h),4.90(d,j＝7.2hz,1h),4.35–4.29(m,2h),4.00–3.91(m,2h),3.75(dd,j＝12.9,3.3hz,2h),3.72–3.68(m,1h),3.27(dd,j＝12.4,5.8hz,2h),1.37(d,j＝6.6hz,3h),1.34(d,j＝6.5hz,6h)。
(d)6-((2r,6r)-2,6-二甲基吗啉)-5-甲酰基-3-((s)-4-甲基-2-氧代噁唑-3-基)苯并[d]异噁唑-7-甲腈(i-16-6)
以中间体i-15-6(67mg，0.187mmol)、羰基二咪唑(61mg，0.374mmol)和4-二甲氨基吡啶(23mg，0.187mmol)为原料，按照中间体i-4-1的合成方法，制得黄色固体50mg，收率70％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.06(s,1h),9.03(s,1h),4.79–4.73(m,2h),4.39–4.33(m,2h),4.28–4.23(m,1h),3.79(dd,j＝12.6,3.1hz,2h),3.22(dd,j＝12.7,5.9hz,2h),1.61(d,j＝5.9hz,3h),1.31(d,j＝6.5hz,6h)。
(e)(2r,4s,4as)-2,4-二甲基-8-((s)-4-甲基-2-氧代噁唑-3-基)-2',4',6'-三氧代-1,1',2,3',4,4a,4',6'-八氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-11-甲腈(化合物6)
以中间体i-16-6(50mg，0.130mmol)和巴比妥酸(18mg，0.143mmol)为原料，按照化合物1的合成方法，制得淡黄色固体35mg，收率54％，1hnmr(500mhz,dmso)δ11.88(s,1h),11.57(s,1h),7.93(s,1h),4.72–4.61(m,2h),4.56(dd,j＝14.3,1.3hz,1h),4.19(dd,j＝8.0,5.3hz,1h),4.05(d,j＝8.9hz,1h),3.87–3.79(m,1h),3.73(d,j＝14.6hz,1h),3.65(dq,j＝12.8,6.3hz,1h),3.27(dd,j＝14.6,10.4hz,1h),2.89(d,j＝14.5hz,1h),1.42(d,j＝6.0hz,3h),1.18(d,j＝6.2hz,3h),0.92(d,j＝6.3hz,3h)；13cnmr(126mhz,dmso)δ170.97,168.19,166.56,154.63,152.77,151.48,149.88,127.72,121.66,115.51,104.94,76.44,72.86,72.69,70.80,65.94,56.49,52.93,52.65,38.29,18.54,18.15,17.74；ms(esi)m/z:[(m-1)-,493.2]。
实施例7、(2r,4s,4as)-2,4-二甲基-8-((s)-5-甲基-2-氧代噻唑-3-基)-2',4',6'-三氧代-1,1',2,3',4,4a,4',6'-八氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-11-腈(化合物7)
(a)(r)-3-氰基-5-(1,3-二氧戊环-2-基)-2,4-二氟-n'-羟基-n-(2-羟丙基)苯甲脒(i-12-7)
以中间体i-10(800mg，3.149mmol)、n-氯代丁二酰亚胺(463mg，3.464mmol)和(r)-(-)-1-氨基-2-丙醇(0.545ml，6.928mmol)为原料，按照中间体i-12-5的合成方法，制得淡黄色粉末456mg，收率44％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.89(t,j＝7.7hz,1h),6.05(s,1h),5.77(s,1h),4.18–4.05(m,4h),3.82–3.75(m,1h),2.97(d,j＝13.1hz,1h),2.87–2.80(m,1h),1.11(d,j＝6.3hz,3h)。
(b)(r)-6-氟-5-甲酰基-3-((2-羟丙基)氨基)苯并[d]异噁唑-7-腈(i-14-7)
以中间体i-12-7(443mg，1.354mmol)、6m盐酸(8ml)和饱和碳酸氢钠水溶液为原料，按照中间体i-14-5的合成方法，得淡黄色粉末150mg，收率42％，1hnmr(400mhz,dmso)δ10.17(s,1h),8.90(d,j＝6.7hz,1h),7.71(t,j＝5.7hz,1h),4.86(d,j＝4.8hz,1h),3.97–3.87(m,1h),3.17(td,j＝6.0,2.2hz,2h),1.13(d,j＝6.2hz,3h)。
(c)6-((2r,6r)-2,6-二甲基吗啉)-5-甲酰基-3-(((r)-2-羟丙基)氨基)苯并[d]异噁唑-7-腈(i-15-7)
以中间体i-14-7(150mg，0.570mmol)、2r,6r-二甲基吗啉(0.090ml，0.684mmol)和n,n-二异丙基乙基胺(0.200ml，1.140mmol)为原料，按照中间体i-15-5的合成方法，制得淡黄色固体162mg，收率79％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.18(s,1h),8.22(s,1h),5.28–5.24(m,1h),4.36–4.28(m,2h),4.24–4.16(m,1h),3.75(dd,j＝12.3,3.0hz,2h),3.60–3.54(m,1h),3.32–3.22(m,3h),1.33(d,j＝6.4hz,9h)。
(d)6-((2r,6r)-2,6-二甲基吗啉)-5-甲酰基-3-((r)-5-甲基-2-氧代噁唑-3-基)苯并[d]异噁唑-7-甲腈(i-16-7)
以中间体i-15-7(120mg，0.335mmol)、羰基二咪唑(109mg，0.670mmol)和4-二甲氨基吡啶(41mg，0.335mmol)为原料，按照中间体i-4-1的合成方法，制得黄色固体82mg，收率64％，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.05(s,1h),9.11(s,1h),5.03(dd,j＝14.0,7.5hz,1h),4.39–4.29(m,3h),3.84(dd,j＝8.5,5.8hz,1h),3.80(dd,j＝12.3,2.6hz,2h),3.23(dd,j＝12.7,5.9hz,2h),1.64(d,j＝6.3hz,3h),1.32(d,j＝6.4hz,6h)。
(e)(2r,4s,4as)-2,4-二甲基-8-((r)-5-甲基-2-氧代噁唑-3-基)-2',4',6'-三氧代-1,1',2,3',4,4a,4',6'-八氢-2'h,6h-螺[异噁唑[4,5-g][1,4]恶嗪[4,3-a]喹啉-5,5'-嘧啶]-11-甲腈(化合物7)
以中间体i-16-7(82mg，0.213mmol)和巴比妥酸(30mg，0.235mmol)为原料，按照化合物1的合成方法，制得白色固体34mg，收率32％，1hnmr(400mhz,dmso)δ11.77(s,1h),11.64(s,1h),8.08(s,1h),5.02–4.92(m,1h),4.60–4.54(m,1h),4.22(dd,j＝9.5,8.3hz,1h),4.04(d,j＝8.9hz,1h),3.88–3.81(m,1h),3.77(d,j＝14.7hz,1h),3.74–3.62(m,2h),3.27(dd,j＝14.7,10.3hz,1h),2.85(dd,j＝14.5,1.2hz,1h),1.46(d,j＝6.2hz,3h),1.19(d,j＝6.3hz,3h),0.93(d,j＝6.4hz,3h)；13cnmr(151mhz,dmso)δ170.98,168.12,166.72,154.18,153.44,151.29,149.90,128.07,121.48,115.52,104.19,76.22,73.07,72.78,72.64,65.95,56.39,52.60,51.24,38.22,20.32,18.48,18.10；ms(esi)m/z:[(m-1)-,493.2]。
实施例8
体外抗菌活性测定
1.实验菌株
体外抗菌活性实验选用临床分离的3株甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌mrsa，3株甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌mssa，3株甲氧西林耐药表皮葡萄球菌mrse，3株甲氧西林敏感表皮葡萄球菌msse，3株青霉素耐药肺炎链球菌prsp，3株化脓性链球菌。
以上菌株均为2015年12月在四川地区、北京地区收集的临床分离致病菌。在收集单位经vitek-60自动微生物鉴定仪鉴定再经常规方法重新鉴定。每株细菌在实验前经琼脂平板划单菌落分纯，37℃隔夜新鲜培养的菌体适当稀释用于实验。
质控菌株：金黄色葡萄球菌atcc25923。购自中华人民共和国卫生部临床检测中心。
2.培养基及培养条件
培养基：mh(mueller-hinton，水解酪蛋白)肉汤培养基(oxoid)；
培养条件：35-37℃孵育16-18h。
3.试验方法
采用美国临床和实验室标准协会(clinicalandlaboratorystandardsinstitute,clsi)抗菌药物敏感性试验操作规程【(performancestandardsforantimicrobialsusceptibilitytesting；twenty-thirdinformationalsupplement)m02-a11、m07-a9和m11-a8，2013】推荐的微量肉汤稀释法测定各受试样品对所试菌株的最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration，mic)值。
用mh肉汤培养基分别将各受试样品倍比稀释至不同浓度后，分别吸取100μl各不同浓度的受试样品溶液于灭菌的96孔聚苯乙烯板中。第1至第12孔加药液，各孔中药物终浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03mg/l。另设不加药和菌，作为空白对照。加菌不加药作为细菌生长对照。
用生理盐水将试验菌液调至相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经mh肉汤1∶100稀释后，加入药液中，使菌液最终浓度约为104cfu/ml；再分别吸取100μl菌液加入上述孔中(每孔中总体积为200μl)，密封后置于35-37℃培养箱内培养18-20h，判断结果。用酶标仪测定od600值，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为其最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration，mic)。测试肺炎链球菌时，需用哥伦比亚肉汤培养基中加入终浓度为5％的无菌脱纤维羊血，5％co2，35-37℃培养箱内培养18-20h。
体外抗菌活性结果如表1所示。由表1可知，本发明化合物具有很好的体外抗菌活性，化合物1对mrsa、mssa、mrse、msse、prsp和spy的体外抗菌活性都要大大优于对照药azd0914，是azd0914的8倍左右，而化合物2、3和4的体外抗菌活性与对照药相当。
表1本发明部分化合物的体外抗菌活性实验结果
amethicillinresistants.aureus.bmethicillinsensitives.aureus.cmethicillinresistants.epidermidis.dmethicillinsensitives.epidermidis.epenicillinresistants.pneumoniae.fs.pyogenes.
实施例9化合物溶解度测定
1.空白基质
人工胃液(不含胃蛋白酶)的配制：取20mg氯化钠，加入70μl的浓盐酸和足够的水定容到10ml。人工胃液的ph约为1.2。
人工肠液(不含胰酶)的配制：取68mg磷酸二氢钾溶于2500μl水中，加入770μl0.2n氢氧化钠溶液和5ml水，用0.2n的氢氧化钠或0.2n的盐酸调节ph至6.8±0.1，加水定容至10ml。
去离子水。
2.样品制备
称取约3mg化合物，分别加入500μl空白基质，于37℃环境下摇24h。孵育结束后的样品，离心30min，上清液转移至新的ep管中，继续离心30min。
3.色谱条件：
分析柱：acquitybehc18(1.5μm；2.1x50mm,waters)
流动相：0.1％fa+5mmnh4acinwater:0.1％fainacn
4.标准曲线制作
用乙腈/水(1/1，v/v)配制标准曲线样品(12.5,25,50,100,200,400,2000,10000nm)，待测物峰面积由watersmasslynx(版本v4.1)软件定量。使用外标法计算待测物浓度。以待测物的峰面积(y)为纵坐标，待测物的浓度(x)为横坐标，用加权(1/x2)最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程y＝ax+b，a是斜率，b是截距。
5.样品分析
每种基质的样品分别各取50μl上清液，加入450μl乙腈/水(1/1，v/v)，涡流混匀后，再取20μl加入180μl乙腈/水(1/1，v/v)，涡流混匀后进行lc-ms/ms分析，将所得峰面积带入标准曲线方程得到每种基质的饱和溶解度。每个样品于每种基质分别各取四次进行测量，所得结果取平均值得到最终化合物的不同基质饱和溶解度。
实验结果见表2。
溶解度是评价药物分子成药性的一个重要性质，它影响药物分子在动物和人体内的吸收、分布、药物暴露量、口服生物利用度等。目前绝大多数药物分子最终不能成功上市，溶解度差是一个关键因素。从表2可以看出，本发明化合物在不同基质中的溶解度相对于阳性对照药azd0914有很大提高，生物药学性质大幅改善，成药性更优。
表2不同基质下化合物的溶解度数据
实施例10
小鼠体内药代动力学试验
健康雌性cd-1小鼠，随机分成两组，每组3只，口服给予被试化合物，具体安排见下表3。
表3给药方案
每只动物每次通过眼眶取0.030ml血液，edtak2抗凝，采集时间点为：po组：给予受试物后15min，30min，1h，2h，4h，6h，8h和24h。血液样本采集后置于冰上，并于30分钟之内离心分离血浆(离心条件：5000转/分钟，10分钟，室温)。分析前存放于–80℃。实验结果见表4。
表4小鼠口服药代动力学数据
优良的代谢性质是化合物成药性的关键指标，药代实验证明，本发明化合物具有理想的代谢特征，暴露量和达峰浓度远远优于阳性对照药物azd0914。
实施例11
大鼠体内药代动力学试验
sd大鼠9只，随机分成三组，每组3只，具体安排见表5。
表5给药方案
每只动物每次通过眼眶取0.100ml血液，edtak2抗凝，采集时间点为：(1)po组：给予受试物后15min，30min，1h，2h，4h，6h，8h，24h；(2)iv组：给予受试物后5min，15min，30min，1h，2h，4h，6h，8h，24h。血液样本采集后置于冰上，并于30分钟之内离心分离血浆(离心条件：5000转/分钟，10分钟，4℃)。分析前存放于–80℃。实验结果见表6。
表6sd大鼠口服给药(po)或静脉注射(iv)化合物1后的主要药动学参数
从10mg/kg和100mg/kg口服给药剂量下所得结果对比中显示出二者血浆中的cmax与给药量呈现明显的正相关关系，化合物1给药100mg/kg的cmax是给药10mg/kg的15倍，表明化合物1在100mg/kg剂量下的吸收并未受到明显影响，口服生物利用度也逐渐增大，从22.6％上升至45.8％。
综合化合物1各方面药代动力学参数，可以看出，化合物1在大鼠体内代谢性质优良，值得进一步研究开发。
实施例12
本发明化合物对mrsa的体内抗菌活性
1.试验菌株
根据体外试验结果选取临床分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa15-3(见下表7)作为体内保护实验的备用受试菌株。
表7本发明化合物及对照药对金黄色葡萄球菌mrsa15-3
的体外抗菌活性-mic(mg/l)
2.试验动物
健康4周龄左右昆明种小鼠，体重为18-22g，雌雄各半，spf级
预计小鼠使用数量：200只
3.体内保护试验方法
3.1菌液配备
将试验用菌于感染前一天，挑取2-3个单菌落接种于2mlmh肉汤，37℃培养6h，取此菌液0.1ml转种于10mlmh肉汤中，37℃培养18h，该菌液即为原菌液。将该菌液用5％干酵母液进行倍比稀释备用(当日新鲜配制)。
3.2最小致死菌量(mld)试验
取健康昆明种小白鼠，体重18～22克，随机分组，每组5-10只小鼠，雌雄各半，吸取上述不同稀释浓度菌液，分别腹腔注射入小鼠体内，每20g鼠重注射0.5ml，感染后观察7-14天，并记录小鼠死亡数，以引起小鼠100％死亡的最低菌量作为最小致死菌量(mld)，用该菌量作为体内保护试验的感染菌量。
3.3药液配备及给药途径：
药液配备：试验用药用0.5％羧甲基纤维素钠配制并稀释到所需浓度溶液备用
给药途径：灌胃给药
给药容量：0.5ml/20gbw(bodyweight，体重)
3.4组别设计
拟设供试品剂量范围为20-2.5mg/kg，精确称取药物，按效价将其换算到有效药物重量，用药均用0.5％羧甲基纤维素钠配制成所需浓度溶液，剂量组间矩为1：0.5。
组别设计：azd0914(20、10、5、2.5g·kg-1)组、化合物1(20、10、5、2.5g·kg-1)组、感染对照组、空白对照组、abt毒性对照。
3.5体内保护实验方法及结果统计
将小鼠于试验前18小时停食供水，按体重随机分组，每组8只小鼠，雌雄各半，分别腹腔注射感染试验菌液，每20g鼠重注射0.5ml，感染后0.5h,4h按设计剂量灌胃给药，每20g鼠重灌胃0.5ml；观察并记录小鼠死亡数，连续观察7-14天，根据小鼠死亡数，用孙瑞元等主编das1.0软件按bliss法计算半数有效剂量ed50及95％可信限。
对照药azd0914组在感染前两小时，口服细胞色素p450抑制剂1-氨基苯并三唑(abt)50mg/kg，12小时后再口服一次50mg/kgabt，其他化合物不需要口服abt。
感染对照组：只感染细菌不给药，感染细菌后即灌胃等体积的生理盐水；空白对照组：不感染细菌，腹腔注射等体积的生理盐水，灌胃等体积的生理盐水。
4.试验结果
全身系统感染模型的体内抗菌活性实验结果见表8。
表8本发明化合物对金黄色葡萄球菌mrsa15-3感染小鼠
的体内保护作用(ed50)
阳性对照药azd0914需要与细胞色素p450抑制剂1-氨基苯并三唑(abt)联用，对金黄色葡萄球菌mrsa15-3感染小鼠的ed50为11.51mg/kg，而化合物1无需联用abt，口服给药对金黄色葡萄球菌mrsa15-3感染小鼠的ed50为3.87mg/kg，明显优于azd0914。
综上所述，本发明化合物比阳性对照药azd0914具有更好的成药性，有望成为更好的抗菌药物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。