一种吡咯-罗丹明酰腙衍生物及其制备方法和应用以及一种荧光探针与流程

本发明涉及有机合成的技术领域，特别涉及一种吡咯-罗丹明酰腙衍生物及其制备方法和应用以及一种荧光探针。

背景技术：

荧光传感器是监测阳离子、阴离子和小分子的强大工具，主要由于其具有高灵敏度，简便的操作以及实时和在线检测的优点。铜是所有生物体维持正常生存所必需的微量营养素，也是人体中第三丰富的过渡金属。过量的二价铜离子主要是通过溶酶体-胆汁途径排泄到胆汁中，引起人体神经退行性疾病，如威尔森氏病，门克斯病和阿尔茨海默氏病。此外，一些铜转运蛋白定位于溶酶体中以促进细胞对铜的吸收。鉴于二价铜离子在人体内的作用，开发可用于检测亚细胞中特别是溶酶体中的二价铜离子荧光探针非常重要。

现有的二价铜离子荧光探针多为单纯依赖荧光强度的“off-on”或“on-off”荧光探针，容易受到诸如设备效率、环境条件及探针浓度等因素的影响，限制了其进一步应用。相比之下，比率荧光探针的信号参量为两个不同波长处的荧光发射强度的比值，能够消除上述因素影响。但是，能够靶向溶酶体的二价铜离子比率荧光探针寥寥无几。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明目的在于提供一种吡咯-罗丹明酰腙衍生物及其制备方法和应用以及一种荧光探针。本发明提供的吡咯-罗丹明酰腙衍生物具有良好的二价铜离子识别性能，在作为荧光探针检测二价铜离子时具有较高的灵敏度和较强的选择性，且能够实现癌细胞溶酶体内二价铜离子的比率荧光检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种吡咯-罗丹明酰腙衍生物，所述吡咯-罗丹明酰腙衍生物具有式i所示结构：

本发明提供了上述方案所述吡咯-罗丹明酰腙衍生物的制备方法，包括以下步骤：

将n-(2-吗啉-4-乙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺、罗丹明6g酰肼和醇类溶剂混合进行缩合反应，得到具有式i所示结构的吡咯-罗丹明酰腙衍生物。

优选的，所述醇类溶剂为乙醇。

优选的，所述乙醇包括无水乙醇或体积浓度为95％的乙醇溶液。

优选的，所述n-(2-吗啉-4-乙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺和罗丹明6g酰肼的摩尔比为1:1～1.1。

优选的，所述n-(2-吗啉-4-乙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺的物质的量和醇类溶剂的体积比为0.01mol：0.3～0.35l。

优选的，所述缩合反应在回流搅拌条件下进行；所述缩合反应的压力为常压，时间为3～3.5h。

优选的，所述缩合反应完成后还包括：对缩合反应液进行后处理，所述后处理包括以下步骤：

将缩合反应液冷却至室温，使固体析出，过滤后对滤渣进行洗涤，得到具有式i所示结构的吡咯-罗丹明酰腙衍生物。

本发明提供了上述方案所述的吡咯-罗丹明酰腙衍生物或上述方案所述所述制备方法制备的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针在测定二价铜离子的光学性质中的应用。

本发明提供了一种用于检测细胞溶酶体内二价铜离子的荧光探针，所述荧光探针包括上述方案所述的吡咯-罗丹明酰腙衍生物或上述方案所述制备方法制备的吡咯-罗丹明酰腙衍生物。

本发明提供了一种具有式i所示结构的吡咯-罗丹明酰腙衍生物。本发明提供的吡咯-罗丹明酰腙衍生物能够与二价铜离子形成稳定的配合物，加入二价铜离子后会出现比率荧光信号，具有较好的二价铜离子识别性能；并且本发明提供的吡咯-罗丹明酰腙衍生物结构中存在溶酶体定位基吗啉，使得该衍生物作为荧光探针时能够靶向识别细胞溶酶体内的二价铜离子。

本发明提供了上述方案所述吡咯-罗丹明酰腙衍生物的制备方法，本发明以n-(2-吗啉-4-乙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺和罗丹明6g酰肼为反应物，通过缩合反应即可得到本发明的吡咯-罗丹明酰腙衍生物。本发明提供的制备方法步骤简单，原料易得。

本发明提供了上述方案所述的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针在测定二价铜离子的光学性质中的应用。实施例结果表明，在多种常见金属离子中，本发明的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针对二价铜离子表现出较高的选择性比率荧光识别性能；在探针溶液中加入二价铜离子后，荧光颜色由蓝色变为绿色，具有比率荧光效应，可实现裸眼辨别检测，具有快速、简便、灵敏度高、选择性强的特点。

本发明还提供了一种用于检测细胞溶酶体内二价铜离子的荧光探针，所述荧光探针包括上述方案所述的吡咯-罗丹明酰腙衍生物。使用吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针与商用溶酶体定位染料进行共定位实验，结果表明，本发明提供的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针能够实现细胞溶酶体内二价铜离子的比率荧光检测。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的吡咯-罗丹明酰腙衍生物的晶体结构图；

图2为本发明实施例1制备的吡咯-罗丹明酰腙衍生物的核磁共振氢谱图；

图3为本发明实施例1制备的吡咯-罗丹明酰腙衍生物的质谱谱图；

图4为本发明实施例2的荧光探针溶液和不同金属离子作用的荧光光谱图；

图5为本发明实施例2的荧光探针溶液滴定不同浓度cu²⁺的荧光光谱图；

图6为hela细胞中，荧光探针与二价铜离子及商用溶酶体定位染料lysotrackerred的荧光成像图。

具体实施方式

本发明提供了一种吡咯-罗丹明酰腙衍生物，所述吡咯-罗丹明酰腙衍生物具有式i所示结构：

本发明提供了上述方案所述吡咯-罗丹明酰腙衍生物的制备方法，包括以下步骤：

将n-(2-吗啉-4-乙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺、罗丹明6g酰肼和醇类溶剂混合进行缩合反应，得到具有式i所示结构的吡咯-罗丹明酰腙衍生物。

在本发明中，所述n-(2-吗啉-4-乙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺和罗丹明6g酰肼的摩尔比优选为1:1～1.1，更优选为1:1；所述醇类溶剂优选为乙醇；所述乙醇优选包括无水乙醇或体积分数为95％的乙醇水溶液；所述n-(2-吗啉-4-乙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺的物质的量和醇类溶剂的体积比优选为0.01mol：0.3～0.35l，更优选为0.01mol：0.3～0.32l，进一步优选为0.01mol：0.3l。

本发明优选先将罗丹明6g酰肼溶解在醇类溶剂中，再将n-(2-吗啉-4-乙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺加入溶液中。在本发明的具体实施例中，优选向6g酰肼、n-(2-吗啉-4-乙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺和醇类溶剂的混合液中滴加3滴乙酸，然后再进行缩合反应，在本发明中，乙酸作为催化剂可以催化反应的快速进行。

在本发明中，所述缩合反应优选在回流搅拌条件下进行；所述缩合反应的压力优选为常压，时间优选为3～3.5h，更优选为3h。

在本发明中，所述缩合反应的反应式如式ⅱ所示：

在本发明中，所述缩合反应完成优选后还包括：对缩合反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：

将缩合反应液冷却至室温，使固体析出，过滤后对滤渣进行洗涤，得到具有式i所示结构的吡咯-罗丹明酰腙衍生物。

在本发明中，所述洗涤滤渣用洗涤剂优选为乙醇；本发明对所述过滤和洗涤的具体操作方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的过滤和洗涤方法即可。

本发明提供了上述方案的吡咯-罗丹明酰腙衍生物或上述方案所述制备方法制备的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针在测定二价铜离子的光学性质中的应用。本发明提供的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针可用于二价铜离子的荧光定量检测，在应用时，本发明优选将吡咯-罗丹明酰腙衍生物与乙腈(ch3cn)-羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)缓冲溶液混合，配制成荧光探针溶液；所述荧光探针溶液的浓度优选为1×10^-5mol/l；所述缓冲溶液中ch3cn和hepes的体积比优选为8:2；所述乙腈-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液的ph值优选为5.0。在检测时，将含有金属离子的溶液中等量加入荧光探针溶液，所述荧光探针溶液能够选择性的识别其中的铜离子，从而实现对二价铜离子的光学性质的测定。

本发明还提供了一种用于检测细胞溶酶体内二价铜离子的荧光探针，所述荧光探针包括上述方案所述的吡咯-罗丹明酰腙衍生物。在本发明中，所述吡咯-罗丹明酰腙衍生物结构中包括溶酶体定位基吗啉，因而该衍生物作为荧光探针时能够靶向识别细胞溶酶体内的二价铜离子。在应用时，本发明将吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针配制成荧光探针溶液；所述荧光探针溶液的配制方法和上述方案一致，在此不再赘述；本发明对所述检测细胞溶酶体内二价铜离子的具体检测方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的检测方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种吡咯-罗丹明酰腙衍生物及其制备方法和应用以及一种荧光探针进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将n-(2-吗啉-4-乙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺(279mg，1mmol)加入到含罗丹明6g酰肼(428mg，1mmol)的etoh溶液(30ml)中，向混合物中滴加3滴乙酸，加热回流3小时，然后将其冷却至室温，冷却至室温后，将反应液减压抽滤，用乙醇洗涤滤饼，然后在空气中干燥，得到白色固体，即为本发明的目标产物吡咯-罗丹明酰腙衍生物，收率为72％。

采用单晶衍射确定所得产物的晶体结构，所得结果如图1所示；晶体结构显示所得吡咯-罗丹明酰腙衍生物以乙醇合物形式存在。

对制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物进行核磁共振分析，结果如下：

¹hnmr(400mhz，dmso-d6)，δ(ppm)：11.09(s，1h，nh-吡咯)，8.00(s，1h，ch＝n)，7.85-7.87(dd，1h，ar-h)，7.52-7.55(m，2h，ar-h)，7.10-7.13(t，1h，ar-h)，6.96-6.98(t，1h，ar-h)，6.30(s，2h，ar-h)，6.15(s，2h，ar-h)，5.10-5.13(t，2h，2nh)，4.36-4.38(t，1h，nh)，3.54-3.56(t，4h，2ch2)，3.22-3.27(dd，3h，ch3)，2.33-2.39(m，6h，2ch2+ch2)，2.23(s，3h，ch3)，1.88(s，3h，ch3)，1.84(s，6h，2ch3)，1.17-1.21(t，6h，2ch3)，具体核磁图谱如图2所示；

对制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物进行了质谱分析：m/z＝345.6877([m+2h]²⁺)；690.3656([m+h]⁺)，具体质谱谱图如图3所示。

实施例2

使用吡咯-罗丹明酰腙衍生物对二价铜离子的光学性质进行测定，步骤如下：

(1)将实施例1制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针和ch3cn/hepes(8/2,v/v)缓冲液混合，配制成摩尔浓度为1×10^-5mol/l的荧光探针溶液，分别在含摩尔浓度为3×10^-5mol/l的ag⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，co²⁺，cr³⁺，cu²⁺，fe³⁺，hg²⁺，k⁺，mg²⁺，mn²⁺，na⁺，ni²⁺，pb²和zn²⁺的金属离子的溶液中加入等量的上述荧光探针溶液，采用荧光光谱仪对其分别进行荧光光谱分析(激发波长为360nm)，所得的荧光光谱图如图4所示。

根据图4可以看出，本发明实施例1制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针与二价铜离子的作用后，荧光发射峰位置和强度均发生明显改变。365nm紫外灯激发下，探针与二价铜离子作用，由蓝色荧光变为绿色荧光，具有比率荧光效应，可实现裸眼辨别检测。而本发明实施例1制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物对其它金属离子如ag⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，co²⁺，cr³⁺，cu²⁺，fe³⁺，hg²⁺，k⁺，mg²⁺，mn²⁺，na⁺，ni²⁺，pb²和zn²⁺等无明显荧光发射峰位置变化。

上述结果表明，ch3cn/hepes(8/2,v/v)溶液中，摩尔浓度为1×10^-5mol/l的吡咯-罗丹明酰腙衍生物荧光探针对二价铜离子具有较高的选择性响应。

(2)采用步骤(1)中配制的荧光探针溶液进行荧光滴定实验：向步骤(1)制备的荧光探针溶液中加入0～10eq.的cu²⁺溶液(cu²⁺溶液的浓度为0～1.0×10^-4mol/l)，采用荧光光谱仪对其分别进行荧光光谱分析(激发波长为360nm)。

所得荧光滴定光谱图如图5所示，根据图5可以看出，随着cu²⁺的逐渐增加(0～10eq.)，位于550nm处的吸收峰强度逐渐增加，而位于480nm处的吸收峰逐渐减弱，使用本发明的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针对cu²⁺进行检测时，铜离子浓度和550nm处的荧光强度呈现良好的线性关系(r²＝0.99508)，通过荧光滴定光谱可以计算得到cu²⁺的检出限为1.05×10^-7mol/l。

以上结果说明，本发明提供的吡咯-罗丹明酰腙衍生物可用于二价铜离子的荧光定量检测。

实施例3

吡咯-罗丹明酰腙衍生物在细胞内铜离子的检测实验(共定位实验)，步骤如下：

hela细胞用1×10^-5mol/l的上述实施例2制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物荧光探针溶液与商用溶酶体定位染料lysotrackerred培育30分钟后加入cu²⁺，继续培育30分钟后使用olympusfv500-ix70激光共聚焦显微镜进行荧光成像，获得在hela细胞的荧光成像图，具体如图6所示。

图6中：a～f为荧光探针+lysotrackerred共染时的荧光成像图：a为蓝色通道荧光成像图；b为绿色通道荧光成像图；c为lysotrackerred红色通道荧光成像图；d为蓝色通道，绿色通道和红色通道叠加图；e为明场图；f为明场图和荧光图叠加图；

g～l为荧光探针+cu²⁺+lysotrackerred共染时的荧光成像图：g为蓝色通道荧光成像图；h绿色通道荧光成像图；i为lysotrackerred红色通道荧光成像图；j为蓝色通道，绿色通道和红色通道叠加图；k为明场图；l为明场图和荧光图叠加图。

m为荧光探针横跨hela细胞线性区域的蓝色通道强度与lystrasered红色通道强度的重叠图；n为荧光探针与二价铜离子作用后横跨hela细胞线性区域的绿色通道强度与lystrasered红色通道强度的重叠图。

根据图6中a、b和g、h可以看出，加入cu²⁺后，蓝色通道的荧光强度明显变弱，绿色通道的荧光强度明显增强。

根据图6中的蓝色通道、绿色通道和红色通道叠加图(d和j)可以看出，本发明的荧光探针加入cu²⁺前后与商品化染料有良好的重合性；并且根据m和n计算得出，本发明的荧光探针蓝色通道发射和加入铜离子后的绿色通道发射与lystrasered红色通道发射的pearson重叠系数分别为0.86和0.90。

以上实验结果表明，以本发明的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针能够实现细胞溶酶体内二价铜离子的比率荧光检测。

由以上实施例可以看出，本发明提供吡咯-罗丹明酰腙衍生物具有良好的铜离子识别性能，能够实现铜离子的比率荧光检测，并且能够靶向识别细胞溶酶体内的二价铜离子，能够实现癌细胞溶酶体内二价铜离子的比率荧光检测，具有广阔的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。