一株用于验证脊肌萎缩症的永生淋巴细胞株的制作方法

本发明属于医药生物领域，具体而言，涉及一株用于验证脊肌萎缩症的永生淋巴细胞株。

背景技术：

脊肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,sma)是最常见的常染色体隐性遗传性神经肌肉病，发病率约为1/6000～1/10,000[1]。该病是由于运动神经元存活基因1(survivalmotorneuron,smn1)纯合缺失或复合杂合突变(杂合缺失伴点突变)所致。基因诊断是sma疾病临床确诊的主要依据。然而，目前sma基因诊断主要针对smn1基因纯合缺失患儿，仍有很大比例的点突变患儿尚未得到明确的基因诊断[2-5]。

smn1基因全长27kb，包含9个外显子(1，2a，2b，3～8)，该基因存在与其高度同源的smn2基因，前者为sma疾病的致病基因，后者则为疾病表型的修饰基因[6-8]。上述两个基因在全部基因组上仅存在5个核苷酸差异位点，其中2个位点位于外显子区(e7和e8各一个)。在sma的实际临床基因诊断过程中，鉴于两个基因高度同源，直接基于基因组水平进行扩增测序来明确点突变来源是smn1或smn2较为困难。目前，国内外大多数smn1点突变基因诊断是基于cdna水平，利用rt-克隆技术结合测序分析鉴别点突变是否发生于smn1基因[9-14]。

申请人近年来一直致力于smn1基因点突变的研究，先后确定smn1点突变15种，发现除了常见的错义突变和移码突变外，产生提前终止密码子(prematureterminationcodon,ptc)的smn1点突变也有6种，约占sma点突变人群的70％(36/50)，其中，p.ser8lysfs*23、p.leu228*为中国sma的常见突变[5-8]。

而多项研究表明，含有ptc的转录产物,将导致翻译提前终止而产生无生物活性甚至毒害性截短蛋白。而无义介导的mrna降解(nonsense-mediatedmrnadecay,nmd)作用机制是机体内的一种翻译依赖性质控机制，可选择性地迅速降解含有ptc的mrna(ptc+mrna)，避免产生对细胞正常生理功能有害的截短蛋白。

申请人发现相比错义突变(p.arg2gly)，上述携带ptc的突变在rt-克隆实验中全长smn1基因mrna转录本的阳性克隆比例极低，降低了点突变基因诊断效率，为临床基因确诊带来了很大困难，有必要对点突变的临床基因诊断策略进行优化。对携带上述突变的患儿外周血进行全长smn1基因转录本的检测，结果提示其smn1mrna转录水平显著下降[10,13]。这提示我们，smn1基因无义/移码突变极可能通过nmd机制下调含ptc的全长smn1mrna转录，进而引起含全长转录本的阳性克隆比例降低，这就是造成这类点突变基因诊断困难的根本原因。

noensie和diet最早将nmd应用于肿瘤研究，他们提出了一种新的研究策略，即通过抑制nmd来鉴定突变基因(geneidentificationbynmdinhibition,gini),首先用药物或者sirna来抑制nmd，然后通过微阵列技术比较基因表达状况的改变，表达上调的基因即可能为发生无义突变的抑癌基因[15]。这一研究策略也提示我们，在sma无义/移码突变的基因诊断过程中，通过加入常用的抑制nmd机制的药物(如放线菌酮和嘌呤霉素)或使用rnai的技术特异性的抑制相关nmd基因，可能会在一定程度上增加ptc+型mrna的稳定性，提高含ptc的全长smn1转录本的表达，使得nmd相关突变的基因诊断中全长smn1转录本阳性克隆比例上调，进而提高这类点突变基因诊断的效率，以达到优化smn1点突变临床基因诊断策略的目的。

本发明拟在前期研究基础上，以smn1基因常见突变p.ser8lysfs*23和p.leu228*为研究对象，利用nmd药物抑制试验和nmd关键因子(upf1)敲减实验明确其smn1mrna降解是否通过nmd调控所致；同时，将抑制nmd机制的药物应用于此类sma点突变患儿的临床基因诊断中，观察其对sma点突变诊断效率的影响，进而优化smn1基因点突变的基因诊断策略。

技术实现要素：

本发明首先涉及一株来源于脊肌萎缩症患者的永生淋巴细胞株iop28，所述的细胞株2017年11月7日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)，编号cgmccno.14734，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名：人永生化淋巴细胞株。

所述的细胞株iop28的培养方法为：

培养基为：rpmi1640完全培养基(10％胎牛血清+90％rpmi1640培养基、青霉素、链霉素)；培养条件为：37℃、5％co2的无菌培养箱。

本发明还涉及所述细胞株iop28在制备检测smn1基因突变的试剂盒中的应用。

所述的smn1基因突变包括但不限于包括如下smn1基因的如下突变：p.ser8lysfs*23、p.glu14*、p.gln15*、p.val19glyfs*21、p.leu228*、p.ile249tyrfs*16、p.tyr272trpfs*35、p.gly279glufs*5等无义突变或移码突变。

所述的试剂盒中还包括：

(1)抑制nmd机制的药物或干扰rna；

(2)mrna提取试剂及反转录试剂；

(3)检测目标突变所需的引物、探针和必要的试剂。

所述的抑制nmd机制为upf1基因介导的nmd机制；

所述的抑制nmd机制的药物为放线菌酮或嘌呤霉素。

本发明还涉及所述的细胞株iop28在筛选或制备抗脊肌萎缩症的药物中的应用。

附图说明

图1、iop28细胞株的形态学观察。

图2、iop28细胞株smn基因外显子1的sanger测序结果，备注：下划线处提示为起始密码子处，箭头所示为c.22位插入碱基a。

图3、iop28细胞株的mlpa拷贝数结果。

图4、iop28细胞株的smn1基因rt-pcr克隆测序结果。

图5、iop28细胞株中smn1的mrna的表达量和smn1蛋白的表达量。

具体实施方式

实施例1、建立永生淋巴细胞株(immortalizedblymphoblastoidcells)：

1、永生淋巴细胞株原代建系方法：

(1)取p.ser8lysfs*23点突变患儿以及单拷贝携带者5～10ml肝素抗凝血；

(2)加入2ml无血清1640培养液，混匀，沿管壁小心加在4ml淋巴细胞分离液上；

(3)2500r/min离心30min，将白细胞层轻轻吸出后移入另一试管中；

(4)加入10ml无血清1640培养液洗涤3次，然后将洗涤后的白细胞用2mlrpmi1640完全培养基(10％胎牛血清+90％rpmi1640培养基+青、链霉素)重悬；

(5)加入1.3mlebv悬液和0.4ml环胞霉素a(cysa，sigma)，充分混匀后等量移入2个10ml培养瓶内，置于37℃、5％co2培养箱培养；

(6)培养7天左右镜下观察，此后每周两次半量换液；约2周后转瓶，继续培养、换液和传代；

(7)至细胞数达到(4～6)x10⁹/ml时，转化后的细胞在倒置显微镜下观察，可见细胞体积增大，呈球状，胞质丰富，呈明显的团状或簇状增生(见图1)，标志转化成功。

(8)取传代2周后的子代细胞株，进行染色体核型分析，并挑取核型完整的单克隆细胞进行进一步扩增培养，得到能够稳定传代的iop28细胞系，做进一步的实验验证工作。

2、smn基因外显子1的sanger测序结果：

患儿家长知情同意抽取患儿及家系成员外周血，应用苯酚一氯仿方法提取基因组dna。以：

smn-e1f(5'-gggcggcggaagtcgtca-3')和

smn-e1r(5'-tgatgctgtcccgaggct-3')为上下游引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，结果表明患儿的iop28细胞系在smn基因外显子1的c.22处存在c.22dupa突变(见图2)，由于基因组测序同时混有smn1和smn2基因组序列，因此需要后续mlpa结合克隆测序验证突变位点发生于smn1基因，而非smn2基因。

3、多重连接探针扩增(multiplex-ligation—dependentprobeamplification，mlpa)检测：

应用mlpap060试剂盒(salsamlpakitp060，mrc—holland)进行smn1基因与smn2基因的拷贝数分析，所得数据采用coffalysermlpadat9.0软件进行分析，比值为0.7～1.3时基因拷贝数为2；比值为0.3～0.7时基因拷贝数为1；比值为0时，基因拷贝数为0，即纯合缺失。结果提示患儿smn1和smn2拷贝数分别为1和3(见图3)。

4、rt-pcr点突变克隆测序验证：

以iop28总rna为模板，应用反转录试剂盒(invitrogen，美国)逆转录合成互补dna(cdna)第1条链。利用smn575和541cl120特异引物扩增包含smn基因e1～e8以及部分3’非翻译区的片段，扩增产物经电泳分离切胶纯化后克隆人pgem-t载体(promega，美国)，连接产物转化dh5a感受态细胞。根据smnl和smn2cdna外显子7的差异位点，利用pcr—rflp技术筛选smnl和smn2克隆子各5个，并进行序列测定。结果提示iop28细胞系的smn1基因处存在c.22dupa突变(见图4)，。

实施例2、在iop28细胞株中验证无义介导的mrna降解机制

使用salsamlpakit(p021-a2；rc-holland,amsterdam,thenetherlands)，对构建成功的iop28细胞系的smn1和smn2拷贝数进行检测，结果显示，iop28细胞系smn1和smn2的拷贝数与其外周血中的拷贝数一致。在smn基因的sanger测序后，我们确认了iop28细胞系中存在smn突变体(c.22dupa)。并且iop28细胞系中并未检测到其他新smn基因突变体。

进一步的研究结果表明，与非nmd突变阴性对照(c.830a>g)个体的细胞系和正常对照的细胞系相比，携带c.22dupa突变的iop28细胞系的fl-smn1转录表达水平显著降低(如图5)。同时，与正常对照相比，c.22dupa的iop28细胞系的smn蛋白表达水平也显著降低(如图5)。

以上实验说明所述的iop28细胞系中，在nmd机制的作用下，受提前终止密码子型smn1点突变的影响，smn1的转录水平和蛋白水平都有所降低。

实施例3、抑制nmd机制后对iop28细胞系的smn1转录水平和蛋白水平的影响

为进一步验证目标细胞系iop28确实携带了正确的smn1突变信息，对多次复苏且稳定传代的目标细胞系进行了反向验证，

5％co2，37℃条件下，目标淋巴细胞系在含有胎牛血清、双抗(青霉素和链霉素)的1640培养基中培养24小时。在1.5ml细胞悬液中分别加入放线菌酮和嘌呤霉素至终浓度为100μg/ml和300ug/ml，继续培养5.5个小时。分析了两种药物对细胞内smn1转录水平的影响，结果显示，经过放线菌酮和嘌呤霉素处理后，sc35基因和smn1基因的转录水平和蛋白表达量都有显著增加。

最后需要说明的是，以上实施例仅帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用作对本发明保护范围的限定。

序列表

<110>首都儿科研究所

<120>一株用于验证脊肌萎缩症的永生淋巴细胞株

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