一种软刀素肽的制备方法与流程

本发明属于多肽药物领域，具体涉及一种软刀素肽的制备方法。

背景技术：

软刀素肽(urumin)，是一种从青蛙皮肤提取分离的抗流感病毒防御肽，有望用于杀灭h1型流感病毒。软刀素肽的的氨基酸序列如下：iplrgafingrwdsqchrfsngaiaca，其相对分子量为2961.38，它能够靶向h1型季节性流感病毒，物理性地破坏病毒粒子，从而保护幼年小鼠免于h1流感病毒的感染。由于目前的抗病毒药物靶点为na和m2蛋白，本研究的软刀素肽的作用靶点为ha蛋白的茎状结构域。因此，软刀素肽对大多数耐药的h1型流感病毒是有效的。软刀素肽的ic50值(半数有效量)是值(半数致死量)是，td50/ic50＝ti(治疗指数)为644.7。

但是目前只能从青蛙皮肤中分离，其提取的效率太低。需要提供一种高效、简便、高纯度、高产率的全合成软刀素肽的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高效地制备软刀素肽的方法。

一种高效合成软刀素肽(urumin)的制备方法,包括如下步骤:

一种软刀素肽的固相合成方法，其特征在于：

所述软刀素肽的序列如下：iplrgafingrwdsqchrfsngaiaca

所述方法它包括如下步骤：

(1)取树脂固相载体和n端fmoc保护的氨基酸，通过固相合成法，按软刀素肽主链肽序依次偶联具有n端fmoc保护的氨基酸，得到全肽树脂，当偶联上一个具有n端fmoc保护的氨基酸后，采用脱保护剂脱除fmoc基团，再偶联下一个具有n端fmoc保护的氨基酸；

(2)采用tfa/tips/edt/水的切割试剂，将肽链从肽树脂上脱下，经过纯化即得软刀素肽。

步骤(1)所述的树脂固相载体为wang树脂。

步骤(1)中，所述固相合成时，树脂的载样量为0.33mmol/g。

步骤(1)中，所述固相合成时，采用dic—hobt氨基酸缩合体系，采用的活化剂为hobt、dmap和dic。其中，fmoc-ala-oh、hobt、dmap、dic的比例为(5-8)：(4-6)：(2-4)：(5-10)。优选地，所述fmoc-ala-oh、hobt、dmap、dic的比例为5:5:3:8。

步骤(3)中，tfa：tips：edt：水的比例为(90-95)：(2-4)：(2-4)：(1-2)。

步骤(3)中tfa：tips：edt：水的比例为95:2:2:1(v/v/v/v)。

步骤(3)中，所述纯化的方法为反向高效液相色谱法，条件如下：色谱柱：odsc18柱；流动相：流动相b为0.1％tfa/水，流动相a为0.1％tfa/乙腈；梯度洗脱程序：90％流动相b、10％流动相a洗3min，30％流动相b、70％流动相a洗30min，0％流动相b、100％流动相a洗40min，检测波长214nm和254nm。

其中，所述高效液相色谱法的流速10ml/min，进样量2ml。

本发明的优点在于通过固相合成制备软刀素肽(urumin)，本发明制备的直链肽，合成过程简单，具有很高的纯度和产率，本能满足目标化合物的生物活性测试，本发明方法可大规模工业制造，应用前景良好。

术语解释：

fmoc：芴甲氧羰基

dcm：二氯甲烷

dmf：n,n-二甲基甲酰胺

hobt：1-羟基苯并三唑

dmap：4-二甲氨基吡啶

dic：n,n-二异丙基碳二亚胺

nmp：n-甲基吡咯烷酮

tfa：三氟乙酸

tips：三异丙基硅烷

edt：1,2-乙二硫醇

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1合成路线图，其中，a：dcm，dmf,fmoc-ala-oh,hobt,dmap,dic,2h；b：20％的哌啶/dmf溶液,10min；c：fmoc-氨基酸,hobt,dic的nmp溶液；d：tfa/tips/edt/水＝95:2:2:1(v/v/v/v)，2h；

图2为纯化后的目标化合物高效液相色谱图(a)和质谱图(b)。

具体实施方式

实验材料：

氨基酸；wang树脂购自上海吉尔生化有限公司；

n-甲基吡咯烷酮(nmp)、n,n-二异丙基碳二亚胺(dic)、1-羟基苯并三唑(hobt)、三氟乙酸(tfa)、乙腈，三异丙基硅烷(tips)、1,2-乙二硫醇(edt)购自北京百灵威科技有限公司；

茚三酮、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二氯甲烷(dcm)、哌啶、苯酚、甲醇均为分析纯(国药集团化学试剂北京有限公司)。

实施例1本发明制备软刀素肽(urumin)的方法

一、制备

1、合成策略

软刀素肽(urumin)是一种含丰富种类氨基酸的多肽。我们通过前期试验探索，优化选择以wang树脂为载体树脂与肽链c端的氨基酸以共价键结合。在dic—hobt氨基酸缩合体系中，以异亮氨酸为直链肽的氨基端，丙氨酸为直链肽的羧基端，通过固相合成制备软刀素肽(urumin)。粗肽产物用高效液相色谱(qp-hplc)进行纯化，获得目标化合物软刀素肽(urumin)。

2、直链肽的固相合成过程

采用如图1所示的合成路线制备软刀素肽(urumin)，其中，步骤1中化合物2与fmoc-ala-oh的比例为300mg:156mg，所述步骤2中化合物3置于20％的哌啶/dmf溶液中脱除fmoc保护基；化合物5表示wang树脂与合成完成后直链肽的结合物。

具体步骤如下：

(1)称取wang树脂300mg(载样量为0.33mmol/g)置于固相合成反应管中，加入5mldcm浸泡溶胀15min，用dmf冲洗三次抽干；

(2)向树脂中加入含有fmoc-ala-oh(156mg,5倍当量)，hobt(81mg,5倍当量)，dmap(182.5mg,3倍当量)，dic(100ul,8倍当量)的5mldmf溶液，置于气浴恒温振荡器中在常温下反应2h，反应结束后抽干反应液用dcm、dmf洗涤wang树脂各三次，取少量树脂用乙醇茚三酮溶液检测显无色；

(3)向树脂中加入5毫升20％的哌啶/dmf溶液反应10分钟脱去丙氨酸上n端的fmoc保护，用dcm、dmf洗涤wang树脂各三次，取少量树脂用乙醇茚三酮溶液检测显色；

(4)重复步骤(2)(3)的做法，依次将fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ser(otbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-arg(pdf)-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-cys-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-ser(otbu)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-trp-oh(boc)、fmoc-arg(pdf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ile-oh。偶联到树脂上,脱保护基，得到化合5；

(5)将树脂置于tfa/tips/edt/水＝95:2:2:1(v/v/v/v)的切割试剂中反应2小时，过滤收集滤液，用氩气鼓泡至原有体积的一半，用冰乙醚反复洗涤离心三次，常温低压干燥得目标化合物1。粗品收率52.8％。

收率的计算方法：实际产量/理论产率*100％。本发明中，理论产量为295.9mg。

3、产物直链肽的纯化

将所得的目标产物用乙腈和水溶解，通过反向高效液相色(qp-hplc)分离纯化。分离条件如下：

仪器：lc-6a制备液相色谱仪,色谱柱：odsc18柱(20mm×250mm，)、prominencelc-20ad高效液相色谱仪(日本岛津公司)色谱柱：odscl8柱(4.6mm×150mm，，100a，hypersil)

流动相：乙腈、水

步骤与参数：流动相b为0.1％tfa/水，流动相a为0.1％tfa/乙腈，梯度洗脱：90％b(3min)一30％b(30min)一0％b(40min)，流速10ml/min，检测波长214nm和254nm，进样量2ml。

经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备软刀素肽的纯度>98％(图2a)，纯收率5.3％。

收率的计算方法：实际产量/理论产率*100％。本发明中，理论产量为295.9mg。

二、产物的鉴别与结构分析

将步骤3所得产物通过hplc进行鉴别以及hr-q-tof-ms(高分辨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)进行结构分析，色谱流动相为乙腈和水。

通过hr-esi-ms质谱仪分析，质谱图中741.1263对应[m+4h]+峰,987.8257对应[m+3h]+峰,1481.2327对应[m+2h]+峰(图2b)，与软刀素肽理论分子量2961.38，在误差范围之内，显示主峰物质分子量与软刀素肽相符，说明本发明制备得到了软刀素肽。

实验结果说明，本发明方法可以制备得到软刀素肽，而且纯度大于98％，本发明方法的产率高，应用前景良好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>成都医学院

<120>一种软刀素肽的制备方法

<130>gy044-17p1531

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>27

<212>prt

<213>软刀素肽(rananigromaculata)

<400>1

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151015

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2025