一种凡纳滨对虾纤维蛋白原LvFREP及其编码基因和应用的制作方法

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种凡纳滨对虾纤维蛋白原lvfrep及其编码基因和应用。

背景技术：
：

纤维蛋白原(fibrinogen)在人体中是一种具有凝血功能的蛋白质，是纤维蛋白的前体。除了参与凝血、止血外，还发挥多种功能，它可与多种细胞结合、参与人类癌症反应，并在细胞粘附以及炎症反应中起重要作用。目前，纤维蛋白原被报道广泛存在于脊椎和无脊椎动物的组织中。在无脊椎动物中，由于缺乏获得性免疫，其主要依赖体液中各免疫因子的共同作用抵御外来病原菌侵染。模式识别受体(patternrecognitionreceptors，prrs)是激活非特异性免疫的重要免疫因子。目前在无脊椎动物中已发现多种prrs，其中最主要的prrs是可识别微生物表面的凝集素；这些凝集素参与起始免疫反应。据报道，纤维蛋白原作为凝集素在多种无脊椎动物的免疫反应过程中发挥重要作用。

纤维蛋白原相关蛋白(fibrinogen-relatedproteins，freps)是具有保守纤维蛋白原结构域(fibrinogen-likedomain,fred)的一类蛋白。fred主要由大约200个氨基酸残基组成，并含有24个保守氨基酸残基。freps作为prrs参与无脊椎动物的免疫反应已在多种无脊椎动物中得到报道，包括紫怡贝(mytilusgalloprovincialis)、海兔(aplysiacalifornica)、长牡蛎(crassotreagigas)、热带按蚊(neotropicalanopheline)等，但在虾类中报道极少。目前我们已经在凡纳滨对虾中发现10个freps转录本，但其功能有待进一步验证。

凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)又称南美白对虾，属暖水性经济虾类。由于其具有盐度温度适应范围广、耐干性强、肉质鲜美、个体较大等优点，在世界各地被广泛养殖，凡纳滨对虾养殖产业已成为我国水产养殖的支柱性产业。然而，近年来由于对虾传染病频繁大规模爆发，给对虾养殖产业造成巨大损失的同时，也威胁着产业的健康和可持续发展；且抗生素等药物的广泛使用造成药物残留，环境污染，并产生抗药性菌株等负面影响。因此提高对虾机体的抗病力、选育具有抗病和抗逆性状的对虾品种，一直是对虾种业和养殖业发展的追求目标，已成为近十年来对虾种业发展的关键。其中，探索阐述虾类免疫防御机制是非常重要的基础工作，探查免疫功能基因及其功能也可以加快从遗传工程或遗传选育途径进行的育种工作。纤维蛋白原相关蛋白作为模式识别受体，可能在对虾非特异免疫反应中发挥重要作用。研究凝血纤维相关蛋白在凡纳滨对虾中的免疫调控机制，可为选育具有抗病和抗逆性状的对虾品种提供遗传标记，同时也可为对虾遗传改良提供新的靶位点。

技术实现要素：
：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种凡纳滨对虾纤维蛋白原lvfrep及其编码基因和应用。

本发明的第一个目的是提供一种凡纳滨对虾纤维蛋白原lvfrep，其氨基酸序列如seqidno.3所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码上述的凡纳滨对虾纤维蛋白原lvfrep的凡纳滨对虾纤维蛋白原基因lvfrep。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述凡纳滨对虾纤维蛋白原基因lvfrep的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。

优选，所述的凡纳滨对虾纤维蛋白原基因lvfrep，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明根据凡纳滨对虾转录组数据中的凡纳滨对虾纤维蛋白原基因lvfrep部分基因序列，设计了特异性引物。提取凡纳滨对虾鳃组织的rna反转录合成cdna，以该cdna为模板，采用上述特异引物进行3’race和5’race扩增出lvfrep基因的3’端片段和5’端片段，分别连接到pmd19-t载体上，获得重组载体pmd19-lvfrep1和pmd19-lvfrep2，获得的序列与原有转录组基因中间序列进行拼接，获得了lvfrep基因的全长序列。lvfrep基因包含一个开放阅读框，为1479个碱基，其序列如seqidno.2所示，将此基因命名为lvfrep，其编码蛋白具有492个氨基酸残基(其氨基酸序列如seqidno.3所示)，将该蛋白命名为lvfrep。

将lvfrep氨基酸序列进行blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)比对，发现lvfrep最相似的序列来源于文昌鱼(branchiostomabelcheri)的ficolin-2-like蛋白，但二者仅存在43％的一致值(如图2所示)，数据库中不存在完全一致的蛋白序列，说明lvfrep是一个新发现的蛋白。同时，采用blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？program＝blastn&page_type＝blastsearch&link_loc＝blasthome)将lvfrep基因与ncbi数据库进行比对，结果为没有发现明显的相似性，因此lvfrep的编码基因lvfrep也是一个新的基因。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述的凡纳滨对虾纤维蛋白原基因lvfrep的重组表达载体。

所述的重组表达载体中的表达载体优选为原核表达载体pet28b。考虑到表达载体的多样性，对表达载体更换，但表达基因的核心为lvfrep基因，也属于本发明的保护范围。

本发明的第四个目的是提供一种含有上述的重组表达载体的细菌。

所述的细菌优选为大肠杆菌bl21(de3)。

本发明发现纯化后的lvprep可导致多种不同来源的细菌发生明显凝集，包括溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、创伤弧菌(vibriovulnificus)、副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)、哈氏弧菌(vibrioharveyi)。将纯化的lvfrep蛋白与哈氏弧菌共同孵育后，注射到凡纳滨对虾体内，分别在不同时间点抽取对虾血淋巴，lb琼脂平板计数血淋巴细菌数量，发现lvfrep蛋白具有明显且快速的清除对虾体内细菌的作用。

因此，本发明的第五个目的是提供上述的凡纳滨对虾纤维蛋白原lvfrep在制备细菌凝集制剂中的应用。

所述的细菌优选为溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、创伤弧菌(vibriovμlnificus)、副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)或哈氏弧菌(vibrioharveyi)。

本发明的第六个目的是提供上述的凡纳滨对虾纤维蛋白原lvfrep在制备清除动物体内细菌药物中的应用。所述的动物优选为凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)。所述的细菌优选为哈氏弧菌(vibrioharveyi)。

本发明首次从凡纳滨对虾中克隆出凡纳滨对虾纤维蛋白原基因lvfrep，并通过实验证明该基因的编码蛋白lvfrep具有凝集细菌和在对虾体内快速清除细菌的功能。因此本发明证实了lvfrep基因和lvfrep蛋白的功能，促进了对虾类免疫调控机制的研究，为选育具有抗病和抗逆性状的对虾品种提供了可靠的遗传标记，同时也可以对虾遗传改良提供新的靶位点，本发明提供的lvfrep蛋白也可用于动物体内和体表细菌病的治疗。

附图说明：

图1是凡纳滨对虾鳃组织rna电泳图，其中1-3为凡纳滨对虾鳃组织rna；

图2是lvfrep与最相似的文昌鱼(branchiostomabelcheri)的ficolin-2-like蛋白的氨基酸序列对比结果图；

图3是lvfrep的sds-page电泳分析结果；其中，m为蛋白marker；1为诱导前菌液总蛋白；2为诱导后菌液总蛋白；3为纯化的目的蛋白；

图4是lvfrep对哈氏弧菌的凝集结果；其中，“-”表示不添加，“+”表示添加；

图5是lvfrep促进凡纳滨对虾体内清除细菌结果；其中，*表示p<0.05，fibrinogen代表lvfrep。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。本实施例中所用的引物，其序列见表1，所有引物均由上海生物工程有限公司合成，除非特别说明，所有引物的浓度为10mm。

表1引物序列表

实施例中所涉及的主要材料来源如下：

大肠杆菌jm109感受态细胞(上海唯地生物)、大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞(北京天根生化)、pmd19-t载体(takara，中国)、原核表达载体pet28b(上海玉博)。

实施例1：凡纳滨对虾纤维蛋白原基因lvfrep的克隆、测序及序列分析

(1)引物设计

根据本实验室的凡纳滨对虾转录组数据获得部分lvfrep基因序列，根据此部分序列设计5’/3’race用引物(见表1)。

(2)rna的提取

以凡纳滨对虾鳃组织为材料，使用trizol法提取总rna。操作步骤：将适量大小的超低温冻结的鳃组织块迅速放入1.5ml的离心管中加500μl的trizol提取液(invitrogen)，按照trizol提取液的说明书进行rna的提取。rna电泳结果如图1所示。

(3)cdna的合成，扩增基因lvfrep的cdna并克隆、测序

1)3’race

以提取的凡纳滨对虾鳃组织rna为模板，采用primescript^tmii1^ststrandcdnasynthesiskit(takara，中国)进行反转录。具体步骤为：模板rna1μl(约3μg)、3’cds引物(50μm)1μl、dntpmixture(10mmeach)1μl，rnasefreedh2o补足至总体积至10μl；65℃保温5min，冰上迅速度冷却；上述变性后反应液10μl、5×primerscriptiibuffer4μl、rnaseinhibitor(40u/μl)0.5μl、primescriptiirtase(200u/μl)1μl，rnasefreedh2o补足总体积至20μl；缓慢混匀，42℃处理60min，然后70℃处理15min，获得cdna。

以cdna为模板，分别使用特异引物3’race-1和通用引物upma(upma为upma-l与upma-s的混合引物)进行pcr，扩增基因lvfrep的3’端片段。pcr反应体系总体积共50μl：cdna模板2μl、引物3’race-11μl、引物upma1μl、2×hifitaqpcrstarmix(genstar)25μl，加ddh2o补足至50μl。反应条件为：94℃3min；94℃变性20sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，35个循环；72℃反应10min。将上述pcr产物稀释100倍，以稀释后dna样为模板，采用3’race-2和通用引物nupa进行巢式pcr扩增基因lvfrep的3’端片段。pcr反应体系总体积共50μl：dna模板2μl、引物3’race-21μl、引物nupa1μl、2×hifitaqpcrstarmix(genstar)25μl，加ddh2o补足至50μl。反应条件为：94℃3min；94℃变性20sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，35个循环；72℃反应10min。采用ezgene^tmgel/pcrextractionkit(biomiga，中国)对巢式pcr产物进行纯化，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

2)5’race

以提取的凡纳滨对虾鳃组织rna为模板，采用primescript^tmii1^ststrandcdnasynthesiskit(takara，中国)进行反转录。具体步骤为：模板rna1μl(约3μg)、特异引物5’race-11μl、dntpmixture(10mmeach)1μl，rnasefreedh2o补足至总体积至10μl；65℃保温5min，冰上迅速度冷却；上述变性后反应液10μl、5×primerscriptiibuffer4μl、rnaseinhibitor(40u/μl)0.5μl、primescriptiirtase(200u/μl)1μl，rnasefreedh2o补足总体积至20μl；缓慢混匀，42℃处理60min，然后70℃处理15min，获得cdna。将获得的反转录产物采用ezgene^tmgel/pcrextractionkit(biomiga，中国)进行纯化，具体操作步骤参照试剂盒说明书。采用terminaldeoxynucleotidyltransferase(takara，中国)对上述纯化产物dna末端加c，操作步骤参照说明书。

以上述加c后产物为模板，分别使用通用引物upma和特异引物5’race-1进行pcr扩增基因lvfrep的5’端片段。pcr反应体系总体积共50μl：cdna模板2μl、引物upma1μl、引物5’race-11μl、2×hifitaqpcrstarmix(genstar)25μl，加ddh2o补足至50μl。反应条件为：94℃3min；94℃变性20sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃反应10min。将上述pcr产物稀释100倍，以稀释产物为模板，进行巢式pcr扩增基因lvfrep的5’端片段，采用通用引物nupa和特异引物5’race-2进行巢式pcr，pcr反应体系总体积共50μl：cdna模板2μl、引物nupa1μl、引物5’race-21μl、2×hifitaqpcrstarmix(genstar)25μl，加ddh2o补足至50μl。反应条件为：94℃3min；94℃变性20sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃反应10min。采用ezgene^tmgel/pcrextractionkit(biomiga，中国)对巢式pcr产物进行纯化，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

采用pmd19-tvectorkit对基因lvfrep的5’端片段和3’端片段分别进行ta克隆。具体操作步骤：向200μl的pcr反应管中加入t-vectorpmd191μl、基因lvfrepcdna(上述5’/3’racepcr产物纯化后dna)4μl、ligationsolutioni5μl，置于金属浴中16℃连接30min。

将上述连接产物转化到大肠杆菌jm109感受态细胞中。操作步骤见jm109感受态细胞说明书。取100μl转化并恢复培养的菌液涂布带有amp抗性的lb平板。

挑取白色菌落，接种到带有amp抗性的lb液体培养基中培养12h，采用引物m13f和下游引物m13r进行菌液pcr检测，得到含有携带3’端片段的重组载体pmd19-lvfrep1的阳性克隆和含有携带5’端片段的重组载体pmd19-lvfrep2的阳性克隆。将阳性克隆递交测序(上海生工)，将获得的5’/3’端片段的序列与原有转录组数据获得的lvfrep基因部分序列进行拼接，获得lvfrep全基因序列及部分非编码区序列(其核苷酸序列如seqidno.1所示)。经分析表明，该序列含有一个开放阅读框(orf)，位于如seqidno.1所示序列的第253-1731位碱基处，orf全长为1479bp，该orf编码基因命名为lvfrep，lvfrep全序列见seqidno.2所示。lvfrep编码蛋白具有492个氨基酸，其氨基酸序列如seqidno.3所示，将该蛋白命名为lvprep。

采用blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，将lvfrep与ncbi数据库进行比对，发现lvfrep与文昌鱼(branchiostomabelcheri)的ficolin-2-like蛋白的相似性最高，但氨基酸序列仅存在43％的一致值(如图2所示)，lvfrep具有fibrinogen的保守结构域，说明lvfrep具有fibrinogen蛋白的结构特征。经blastp比对，lvfrep序列不与任何先前已公布的蛋白序列一致，数据库中不存在完全一致的蛋白序列，说明lvfrep是一个新发现的蛋白。同时，采用blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？program＝blastn&page_type＝blastsearch&link_loc＝blasthome)将lvfrep基因与ncbi数据库进行比对，结果为没有发现明显的相似性，因此lvfrep的编码基因lvfrep也是一个新的基因。

通过在线程序smart(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？normal＝1)分析发现，lvfrep蛋白具有一个由23个氨基酸组成的信号肽、一个由223个氨基酸组成的fred结构域。其分子量为55.8kda，理论等电点为5.51。通过netnglyc1.0server(http://www.cbs.dtu.dk/services/netnglyc/)分析发现lvfrep蛋白具有3个糖基结合位点(ngt)，说明lvfrep蛋白具有与糖基结合的特性，为阐明lvfrep蛋白与细菌表面糖蛋白结合从而使细菌发生凝集现象提供理论依据。

实施例2：构建原核重组表达载体pet28b-lvfrep

采用引物pet28b-f和引物pet28b-r扩增原核表达载体pet28b。操作步骤：pcr反应体系总体积共50μl：原核表达载体pet28b2μl、引物pet28b-f1μl、引物pet28b-r1μl、primestardna聚合酶预混液(takara，中国)25μl，加ddh2o补足至50μl。反应条件为：98℃2.5min；98℃变性10sec，56℃退火25sec，72℃延伸5min，35个循环；72℃反应10min。采用pcr产物纯化试剂盒(takara，中国)对上述pcr产物进行纯化，获得线性化的pet28b载体。

采用引物frepex-f和frepex-r扩增lvfrep基因。具体操作步骤：pcr反应体系总体积共50μl：cdna模板2μl、引物frepex-f1μl、引物frepex-r1μl、primestardna聚合酶预混液(takara，中国)25μl，加ddh2o补足至50μl。反应条件为：98℃2.5min；98℃变性10sec，56℃退火25sec，72℃延伸2min，35个循环；72℃反应10min。采用pcr产物纯化试剂盒(takara，中国)对上述pcr产物进行纯化，获得纯化的并且两端具有pet28b同源序列的lvfrep基因片段。

iionestepcloningkit(vazyme，中国)对线性化载体pet28b与两端具有pet28b同源序列的lvfrep基因片段进行体外重组。具体操作步骤：向200μl的pcr反应管中加5×ceiibuffer4μl、ii2μl、线性化原核表达载体pet28b100ng、插入片段lvfrep200ng，加水补足至总体积20μl。将上述反应管放置在37℃的水浴锅中水浴60min，待反应完成后冰水浴5min。

将上述连接产物采用热激法转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，操作步骤见其说明书。取200μl培养后的菌液涂布在含有kan的lb培养基平板上，37℃过夜培养。

挑取菌落接种于带有kan抗性的lb液体培养基中37℃、200rpm摇床12h。采用引物frepex-tf和引物frepex-tr进行菌液pcr检测重组情况。得到的含有原核表达重组载体pet28b-lvfrep的阳性克隆，阳性克隆进一步测序验证，证实为具有正确序列的含重组载体pet28b-lvfrep的阳性克隆，命名为大肠杆菌bl21(pet28b-lvfrep)。

由此得到转有lvfrep基因的原核表达载体pet28b的大肠杆菌bl21(de3)，即得到含有原核重组表达载体pet28b-lvfrep的大肠杆菌bl21(de3)。

实施例3：大肠杆菌bl21(pet28b-lvfrep)诱导表达和lvprep蛋白的纯化

取100μl培养好的大肠杆菌bl21(pet28b-lvfrep)于4ml液体lb培养基中，37℃摇床培养，至od600达到0.6，分别加iptg诱导，以未加iptg的菌液作为对照。iptg的工作浓度为0.2mm，诱导时间6h。

各取1ml未经iptg诱导的样品、经iptg诱导的样品用于总蛋白分析。具体步骤为：取1ml菌液12000rpm离心3min，弃上清，加入200μl的ddh2o重悬菌液，取15μl菌液并加入4μl的5×proteinloadingbuffer于沸水中加热4min，-20℃保存。

蛋白样品sds-page电泳检测分析。具体步骤：制备分离胶和浓缩胶，2种样品上样20μl，电泳后取出分离胶，考马斯亮蓝染色1h，脱色过夜，sds-page电泳结果见图3(泳道1-3)。由图3可见，经iptg诱导后，预期位置出现明显且量大的蛋白条带，而对照组预期位置没有明显的高含量蛋白出现，表明lvfrep重组表达菌构建成功。重组蛋白lvprep纯化委托上海生工生物工程股份有限公司进行，采用常规ni柱纯化纯度80％，过滤除菌，纯化结果如图3(泳道3)所示。

实施例4：lvprep蛋白的细菌凝集实验

收集对数生长期的病原细菌，细菌种类包括：溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、创伤弧菌(vibriovμlnificus)、副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)、哈氏弧菌(vibrioharveyi)。6000rpm，离心5min，弃上清，然后用tbs-ca缓冲液(50mmtris-hcl,100mmnacl,10mmcacl2,ph7.5)重悬，重复3次离心，用tbs-ca缓冲液调整细菌的浓度使其在od600值为0.6。为了检测lvprep是否为ca⁺依赖型纤维蛋白原，采用tbs-edta缓冲液(50mmtris-hcl,100mmnacl,4mmedta,ph7.5)离心、重悬细菌，并调整各菌液od600值至0.6。重组蛋白lvprep的初始浓度为0.2mg/ml，对其进行梯度稀释后，与不同的细菌于200μlpcr反应管混合，其中lvprep蛋白的工作浓度为100μg/ml，孵育1h，然后显微镜镜检。使用牛血清蛋白bsa和小家鼠(musmusculus)的c-typelectin(ctl)做为对照。结果发现，lvprep蛋白和对照蛋白ctl蛋白在ca⁺存在情况下，细菌发生凝集，在缺失ca⁺情况下无凝集现象发生；而bsa对照组在有无ca⁺存在情况下，都无凝集现象发生。图4是以哈氏弧菌为例的细菌凝集结果显示。本结果表明lvprep蛋白具有强烈的细菌凝集作用，因此也证实了lvprep属于一种钙离子依赖型凝血纤维蛋白。

实施例5：lvprep蛋白在凡纳滨对虾体内协助清除弧菌实验

收集哈氏弧菌菌液(4×10⁸cfu)750μl，用pbs重悬，离心3次，最终重悬在500μlpbs中。实验组为lvprep(工作浓度100μg/ml)与哈氏弧菌(1.5×10⁸cfu/ml)混合，在30℃孵育0.5h，以bsa和pbs做为对照组。孵育后，100μl孵育液注射到虾体中。在注射后的2min、5min、15min、30min、1h时分别抽取血淋巴200μl，稀释100倍，取100μl稀释液涂布lb平板，30℃培养12h。统计细菌菌落数量，每个组设三个重复。菌落计数统计结果如图5所示。由图5可见，注射2min后实验组和对照组对虾清除弧菌的能力就表现出差异，且在5、15分钟时，实验组对虾体内的弧菌数量明显少于对照组。这一结果表明lvprep蛋白确实能够帮助凡纳滨对虾快速清除体内的细菌。

序列表

<110>中国科学院南海海洋研究所

<120>一种凡纳滨对虾纤维蛋白原lvfrep及其编码基因和应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1903

<212>dna

<213>凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)

<400>1

cgcgtcgactagtacggggggggggcacacacacacctacacagacacacacacacctac60

acctacacaaagggagagcctgtagactctcacagtcgaccctgaacagtggtacacaca120

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aagattgttttgccacttccacctccctgtggcatagccttgctagactcatgctcgaca240

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<210>2

<211>1479

<212>dna

<213>凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)

<400>2

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