本发明涉及蛋白及蛋白多肽领域，具体涉及一种鲟鱼精蛋白及鲟鱼精蛋白多肽的制备方法。
背景技术：
鱼精蛋白是一种多聚阳离子肽，主要存在于各类动物成熟的精巢组织中，与dna紧密结合在一起。鱼精蛋白具有较强的抑菌特性，在食品中主要用作防腐剂。与一般的化学合成防腐剂相比，鱼精蛋白具有许多优点，如安全性高、防腐性能好、热稳定性好等。而且，作为精氨酸含量丰富的蛋白类物质，鱼精蛋白具有很高的营养性和功能性，因此在食品应用研究范围广泛。鱼精蛋白也可与肝素的葡萄糖胺聚糖结合，是唯一与肝素形成拮抗作用的药物，可以快速有效地抵抗肝素或人工合成的抗凝血剂的抗凝作用，其在心脏直视手术和心导管介入治疗中有较大应用。鱼精蛋白多肽是鱼精蛋白的酶解产物，具有更小的分子量和异源性，可显著降低机体过敏风险，有效解决鱼精蛋白直接作用与机体时产生的过敏反应、免疫反应甚至休克的突发风险，使鱼精蛋白的应用更安全放心。而相比于鱼精蛋白，鱼精蛋白多肽具有更好的抑菌性，吸水持水性。通过辐照辅助酶解，得到更小分子量的天然活性蛋白肽类，具有高溶解性，高功能性等优点，有广阔的应用前景。
目前，市场上的鱼精蛋白主要提取自鲱、鲑科鱼等海水鱼，而且得率较低，而我国这类海鱼资源缺乏。鲟鱼具有高营养价值，蛋白含量高，而鲟鱼养殖业产量大，废弃物精巢组织原料充足。鱼类精巢除作为养鱼饲料及一部分腌制食品利用外，其它用途很少，价值低。如果从中分离出鱼精蛋白，利用蛋白酶抑制剂提高其提取得率，并在适当的领域应用则有望提高其附加价值，同时减少资源浪费和环境污染。
技术实现要素：
本发明的目的是针对等问题，旨在提供一种原材料丰富，天然无污染，抑菌性能强，且具有高持水保水性和抗氧化性；分子量小的鲟鱼精蛋白及鲟鱼精蛋白多肽的制备方法。
本发明目的的实现方式为，一种鲟鱼精蛋白的制备方法，具体步骤如下：
1)取除杂处理后的鲟鱼白切碎成浆状，加0.14mol/lnacl，0.05mol/lnaedta和0.001mol/lpmsf的混合溶液，均质匀浆搅拌1～3min，于0℃搅拌20min，静置10min，0℃低温离心，弃去上清液，重复3次，得沉淀物；
2)取步骤1所得沉淀物按体积比1：5～1：8加入浓度为0.8mol/l～1.2mol/l的硫酸溶液，温度25～65℃，提取15min～60min，在0℃低温离心10min,过滤，取滤液，滤渣再重复用硫酸提取2～6次，合并滤液；
3)取步骤2)所得滤液用naoh调节ph至7.0，透析除盐后用其体积三倍的95％冷乙醇沉淀，沉淀物分别用丙酮和乙醚各洗2次，真空冷冻干燥24h，得鲟鱼粗蛋白；
所述真空冷冻干燥条件为温度-50℃，压力10pa；
4)将步骤4)所得鲟鱼粗蛋白经过两步纯化，得鲟鱼精蛋白；
所述两步纯化为sephadexg-50葡聚糖凝胶层析和cmsepharosefastflow离子交换层析纯化；
每步分离纯化前都加入0.5mol/lnaedta和0.1mol/lpmsf的混合溶液。
一种鲟鱼精蛋白多肽的制备方法，具体步骤如下，
1)取除杂处理后的鲟鱼白切碎成浆状，加0.14mol/lnacl，0.05mol/lnaedta和0.001mol/lpmsf的混合溶液，均质匀浆搅拌1～3min，于0℃搅拌20min，静置10min，0℃低温离心，弃去上清液，重复3次，得沉淀物；
2)取步骤1所得沉淀物按体积比1：6加入浓度为0.8mol/l～1.2mol/l的硫酸溶液，温度35℃，提取30min，在0℃低温离心10min,过滤，取滤液，滤渣再重复用硫酸提取4次，合并滤液；
3)取步骤2)所得滤液用naoh调节ph至7.0，透析除盐后用其体积三倍的95％冷乙醇沉淀，沉淀物分别用丙酮和乙醚各洗2次，真空冷冻干燥24h，得鲟鱼粗蛋白；
所述真空冷冻干燥条件为温度-50℃，压力10pa；
4)将步骤4)所得鲟鱼粗蛋白经过两步纯化，得鲟鱼精蛋白；
所述两步纯化为sephadexg-50葡聚糖凝胶层析和cmsepharosefastflow离子交换层析纯化；
每步分离纯化前都加入0.5mol/lnaedta和0.1mol/lpmsf的混合溶液；
5)将步骤4)所得鲟鱼精蛋白以体积比1:30～1:50加入ph为6～8的磷酸盐缓冲液匀浆，得鲟鱼精蛋白溶液；
6)将步骤5)所得鲟鱼精蛋白溶液移入透明玻璃杯并向其中加入其体积的3％～8％木瓜蛋白酶，然后置于60co辐照场中通过γ射线辐照，取出后在50～60℃水浴中加热酶解6～9h，得酶解液；
所述60co辐照场中通过γ射线辐照的辐照方法为：透明玻璃杯距地面高40cm，距离60co辐照源1.4m，辐照剂量率为33gy/min，辐照时间120min，辐照不均匀度小于1.0，辐照环境温度18℃；
7)取步骤6)所得酶解液，沸水灭酶10min，冷却；加入与酶解液等体积的，百分浓度为20％的三氯乙酸溶液，于0℃下离心15min，取上清液，真空冷冻干燥24h，即得鲟鱼精蛋白多肽；
所述真空冷冻干燥条件温度-50℃，压力10pa。
本发明原材料丰富，天然无污染，所制备的鲟鱼精蛋白属于体外异源性物质，可解决临床上依然存在的鱼精蛋白产生过敏反应、免疫反应甚至休克的突发风险；容易不被机体识别导致过敏反应，热稳定性高，相变温度可达92.5℃。鱼精蛋白经酶解后得到的鲟鱼精蛋白有更小的分子量和异源性，可大大降低过敏风险；具有高持水保水性，吸水率达106.0±0.09％，持水率为81.3±0.05％；且对大肠杆菌、金黄色葡萄糖球菌、酵母菌和黄曲霉都有较好的抑菌效果。
本发明制备的鱼精蛋白及鱼精蛋白多肽可广泛用于食品、化妆品、药品领域。特别可作为抗肝素剂用于体外心脏手术中。
附图说明
图1为dsc吸热峰图。
具体实施方式
本发明是除杂处理后的鱼白切碎成浆状，加nacl，naedta和pmsf混合液均质匀浆搅拌，离心分离，沉淀物加硫酸提取，低温离心分离，滤液用naoh调ph，透析除盐后用乙醇沉淀，用丙酮和乙醚洗，真空冷冻干燥得鱼精粗蛋白；经过2步纯化，得精鱼精蛋白。鱼精蛋白用磷酸盐缓冲液匀浆，得鱼精蛋白溶液；加酶，γ射线辐照，酶解得酶解液；酶解液沸水灭酶，冷却。加三氯乙酸溶液，离心分离，真空冷冻干燥得鲟鱼精蛋白多肽。
步骤4)中的，sephadexg-50葡萄糖凝胶层析条件为：紫外检测波长220nm，恒流泵流速480ml/h，上样3～4ml，每3min收集1管，收集各紫外吸收峰内的试管合并，旋蒸浓缩；cmsepharosefastflow离子交换层析的条件为：紫外检测波长为220nm，将上一步纯化的有效组分，每次以4～6ml的量上样，1mol/l的nacl溶液梯度洗脱，每3min收集1管，合并有效组分，鉴定后乙醇沉淀分离，-50℃冷冻干燥24h，得精鱼精蛋白。
步骤4)所得的精鱼精蛋白，分子量为10.8ku，属于三鱼精蛋白，赖氨酸、组氨酸和精氨酸三种碱性氨基酸含量达57.4％，占氨基酸总量的81.1％；；所述精鱼精蛋白结构中主要为无规则卷曲结构，无规则卷曲构象占64.70％，α-螺旋占7.05％，β-折叠15.55％，β-转角15.55％；所述鱼精蛋白具有高结合水能力，其吸水率达88.8±0.13％，持水力达75.7±0.08％；
精鱼精蛋白，热稳定性高，相变温度可达92.5℃。
所述鲟鱼精蛋白多肽分离过程为：经截流分子量为10ku、5ku、3ku、2ku的超滤膜分离后,得到了5ku-10ku、3ku-5ku、和小于2ku的3个分子量段的组分；条件为：将制得的鲟鱼精蛋白酶解液过截留分子量为1000u的超滤管，将其透过液过截留分子量为5000u的超滤管，然后将其透过液过截留分子量为3000u的超滤管，再将其透过液过截留分子量为2000u的超滤管收集各个分子量段的鲟鱼精蛋白多肤液，-50℃冷冻干燥24h后保存。
步骤7)所得鱼精蛋白多肽含有分子量为1.6ku，3.4ku和9.3ku的三种蛋白组分；所得鱼精蛋白多肽吸水率达106.0±0.09％，持水率为81.3±0.05％。
步骤2)中离心分离转速为4000r/min；步骤(7)离心分离转速为5000r/min。步骤1)所取鱼白为来自成熟的鲟鱼-甲骨板，其精巢组织发育至第ⅴ期。
下面结合实例及附图对本发明的技术方案进一步描述
实施例1
1)取除杂处理后的鲟鱼白切碎成浆状，加0.14mol/lnacl，0.05mol/lnaedta和0.001mol/lpmsf的混合溶液，均质匀浆搅拌1min，于0℃搅拌20min，静置10min，0℃低温离心，弃去上清液，重复3次，得沉淀物；转速为4000r/min；
2)取步骤1所得沉淀物按体积比1：8加入浓度为1.2mol/l的硫酸溶液，温度35℃，提取60min，在0℃低温离心10min,过滤，取滤液，滤渣再重复用硫酸提取2次，合并滤液；
3)取步骤2)所得滤液用naoh调节ph至7.0，透析除盐后用其体积三倍的95％冷乙醇沉淀，沉淀物分别用丙酮和乙醚各洗2次，真空冷冻干燥24h，得鲟鱼粗蛋白；
所述真空冷冻干燥条件为温度-50℃，压力10pa；
4)将步骤4)所得鲟鱼粗蛋白经过两步纯化，得鲟鱼精蛋白；鲟鱼精蛋白得率8.90％。
所述两步纯化为sephadexg-50葡聚糖凝胶层析和cmsepharosefastflow离子交换层析纯化；
每步分离纯化前都加入0.5mol/lnaedta和0.1mol/lpmsf的混合溶液。
实施例2，同实施例1，不同的是，
1)取除杂处理后的鲟鱼白切碎成浆状，加0.14mol/lnacl，0.05mol/lnaedta和0.001mol/lpmsf的混合溶液，均质匀浆搅拌2min，于0℃搅拌20min，静置10min，0℃低温离心，弃去上清液，重复3次，得沉淀物；转速为4000r/min；
2)取步骤1所得沉淀物按体积比1：6加入浓度为1.2mol/l的硫酸溶液，温度35℃，提取60min，在0℃低温离心10min,过滤，取滤液，滤渣再重复用硫酸提取4次，合并滤液。
鲟鱼精蛋白得率10.12％。
实施例3，同实施例1，不同的是，
1)取除杂处理后的鲟鱼白切碎成浆状，加0.14mol/lnacl，0.05mol/lnaedta和0.001mol/lpmsf的混合溶液，均质匀浆搅拌3min，于0℃搅拌20min，静置10min，0℃低温离心，弃去上清液，重复3次，得沉淀物；转速为4000r/min；
2)取步骤1所得沉淀物按体积比1：6加入浓度为0.8mol/l的硫酸溶液，温度35℃，提取30min，在0℃低温离心10min,过滤，取滤液，滤渣再重复用硫酸提取4次，合并滤液。
鲟鱼精蛋白得率11.28％。
实施例4，同实施例1，不同的是，
1)取除杂处理后的鲟鱼白切碎成浆状，加0.14mol/lnacl，0.05mol/lnaedta和0.001mol/lpmsf的混合溶液，均质匀浆搅拌1min，于0℃搅拌20min，静置10min，0℃低温离心，弃去上清液，重复3次，得沉淀物；转速为4000r/min；
2)取步骤1所得沉淀物按体积比1：7加入浓度为1.0mol/l的硫酸溶液，温度35℃，提取60min，在0℃低温离心10min,过滤，取滤液，滤渣再重复用硫酸提取6次，合并滤液。
鲟鱼精蛋白得率8.08％。
实施例5，同实施例1，不同的是，
1)取除杂处理后的鲟鱼白切碎成浆状，加0.14mol/lnacl，0.05mol/lnaedta和0.001mol/lpmsf的混合溶液，均质匀浆搅拌1min，于0℃搅拌20min，静置10min，0℃低温离心，弃去上清液，重复3次，得沉淀物；转速为4000r/min；
2)取步骤1所得沉淀物按体积比1：5加入浓度为1.1mol/l的硫酸溶液，温度25℃，提取15min，在0℃低温离心10min,过滤，取滤液，滤渣再重复用硫酸提取3次，合并滤液。
鲟鱼精蛋白得率7.73％。
实施例6
1)取除杂处理后的鲟鱼白切碎成浆状，加0.14mol/lnacl，0.05mol/lnaedta和0.001mol/lpmsf的混合溶液，均质匀浆搅拌1min，于0℃搅拌20min，静置10min，0℃低温离心，弃去上清液，重复3次，得沉淀物；转速为4000r/min；
2)取步骤1所得沉淀物按体积比1：6加入浓度为0.8mol/l的硫酸溶液，温度35℃，提取30min，在0℃低温离心10min,过滤，取滤液，滤渣再重复用硫酸提取4次，合并滤液；
3)取步骤2)所得滤液用naoh调节ph至7.0，透析除盐后用其体积三倍的95％冷乙醇沉淀，沉淀物分别用丙酮和乙醚各洗2次，真空冷冻干燥24h，得鲟鱼粗蛋白；
所述真空冷冻干燥条件为温度-50℃，压力10pa；
4)将步骤4)所得鲟鱼粗蛋白经过两步纯化，得鲟鱼精蛋白；鲟鱼精蛋白得率8.90％。
所述两步纯化为sephadexg-50葡聚糖凝胶层析和cmsepharosefastflow离子交换层析纯化；
每步分离纯化前都加入0.5mol/lnaedta和0.1mol/lpmsf的混合溶液。
5)将步骤4)所得鲟鱼精蛋白以体积比1:30加入ph为7的磷酸盐缓冲液匀浆，得鲟鱼精蛋白溶液；
6)将步骤5)所得鲟鱼精蛋白溶液移入透明玻璃杯并向其中加入其体积的3％的木瓜蛋白酶，然后置于60co辐照场中通过γ射线辐照，取出后在60℃水浴中加热酶解8h，得酶解液；
所述60co辐照场中通过γ射线辐照的辐照方法为：透明玻璃杯距地面高40cm，距离60co辐照源1.4m，辐照剂量率为33gy/min，辐照时间120min，辐照不均匀度小于1.0，辐照环境温度18℃；
7)取步骤6)所得酶解液，沸水灭酶10min，冷却；加入与酶解液等体积的，百分浓度为20％的三氯乙酸溶液，于0℃下离心15min，离心分离转速为5000r/min。取上清液，-50℃，10pa条件下真空冷冻干燥24h，得鲟鱼精蛋白多肽。
鱼精蛋白多肽得率10.2％。
实施例7，同实施例6，不同的是，
5)将步骤4)所得鲟鱼精蛋白以体积比1:30加入ph为8.0的磷酸盐缓冲液匀浆，得鲟鱼精蛋白溶液；
6)将步骤5)所得鲟鱼精蛋白溶液移入透明玻璃杯并向其中加入其体积的4％的木瓜蛋白酶，然后置于60co辐照场中通过γ射线辐照，取出后在55℃水浴中加热酶解8h，得酶解液。
鱼精蛋白多肽得率8.01％。
实施例8，同实施例6，不同的是，
5)将步骤4)所得鲟鱼精蛋白以体积比1:40加入ph为7.0的磷酸盐缓冲液匀浆，得鲟鱼精蛋白溶液；
6)将步骤5)所得鲟鱼精蛋白溶液移入透明玻璃杯并向其中加入其体积的3％的木瓜蛋白酶，然后置于60co辐照场中通过γ射线辐照，取出后在55℃水浴中加热酶解8h，得酶解液。
鱼精蛋白多肽得率8.91％。
实施例9，同实施例6，不同的是，
5)将步骤4)所得鲟鱼精蛋白以体积比1:50加入ph为8.0的磷酸盐缓冲液匀浆，得鲟鱼精蛋白溶液；
6)将步骤5)所得鲟鱼精蛋白溶液移入透明玻璃杯并向其中加入其体积的6％的木瓜蛋白酶，然后置于60co辐照场中通过γ射线辐照，取出后在60℃水浴中加热酶解6h，得酶解液。
鱼精蛋白多肽得率6.53％。
实施例10，同实施例6，不同的是，
5)将步骤4)所得鲟鱼精蛋白以体积比1:30加入ph为6.0的磷酸盐缓冲液匀浆，得鲟鱼精蛋白溶液；
6)将步骤5)所得鲟鱼精蛋白溶液移入透明玻璃杯并向其中加入其体积的8％的木瓜蛋白酶，然后置于60co辐照场中通过γ射线辐照，取出后在50℃水浴中加热酶解9h，得酶解液。
鲟鱼鱼精蛋白多肽得率7.38％。
本申请人用实施例3所得的鲟鱼精蛋白及实施例6所得的鲟鱼精蛋白多肽作了抑菌性实验，具体情况如下：
将鲟鱼精蛋白配置成系列浓度梯度的溶液，通过滤纸片法得到各种浓度鲟鱼精蛋白溶液对菌落的抑制作用，结果如表1所示。
表1：不同浓度鲟鱼精蛋白对不同菌种的抑菌圈分析
从表1可见鲟鱼精蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，酿酒酵母均有较好的抑菌效果，且随着鲟鱼精蛋白浓度增大，不同菌种的抑菌圈直径增大。
将鲟鱼精蛋白多肽，配置成浓度为2.0％的鲟鱼精蛋白多肽溶液，浸泡滤纸，进行抑菌圈测试。结果如表2所示
表2：鱼精蛋白多肽抑菌测试
从表2可见鲟鱼精蛋白多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌和黄曲霉均有抑制作用。
本申请人用实施例6所得的鲟鱼精蛋白多肽作了抗氧化性实验，实验情况如下：
鱼精蛋白多肽经分离纯化后，得到分子量为1.6ku，3.4ku和9.3ku三种组分，溶解后，评价清除超氧阴离子自由基活性。结果如表3所示
表3：鱼精蛋白多肽抗氧化性测试
从表3可见鲟鱼精蛋白多肽分子量越小，抗氧化性越好。
本申请人用实施例3所得的鲟鱼精蛋白作了热稳定性实验，实验结果见图1。
如图1所示，1.1～1.4分别为鲟鱼鱼白原料，粗提鱼精蛋白，市售鲑鱼精蛋白和精鲟鱼精蛋白(本发明所述鲟鱼精蛋白)的示差扫描量热分析(dsc)图谱。蛋白的热稳定性表现在该吸热峰的相变温度和变性热焓值上，相变温度和变性热焓值越高，则表示蛋白热稳定性越高。粗提鱼精蛋白、鲑鱼精蛋白和精制鲟鱼精蛋白，相变温度分别为84.1℃、89.6℃和92.5℃，表明纯度越高，鱼精蛋白稳定性越高，
从图1可见，本发明所制备的鲟鱼精蛋白稳定性高于市售鲑鱼精蛋白，具有更高的高温加工稳定性。