一种人血白蛋白的制备工艺的制作方法

本发明涉及生物制药领域中蛋白质药物的分离及纯化工艺，特别是涉及一种人血白蛋白的制备工艺。

背景技术：

人血白蛋白是血液制剂的主要产品，在肝细胞合成，合成速度极快，具有分子相对小(分子量66250)、表面积相对较大，分子构形比较对称，结构简单、牢固、富韧性等特点。白蛋白对失血性休克，严重烧伤，脑水肿，肝肾疾病的血症有重要作用。自从cohn等人于40年代创立低温乙醇人血浆蛋白分离技术以来，血浆蛋白的工业化大生产取得了长足的进展。

目前采用传统低温乙醇分离法生产的人血白蛋白，存在分离步骤多，周期长，工艺复杂，且全过程需要低温环境，制备的白蛋白得率低，产品稳定性差，纯度低，其他部分指标容易不达标，如pka含量，铝残留量，多聚体含量等。出现以上不足的主要原因还是制备工艺的不合理。

传统低温乙醇法制备工艺不能有效将铝残留量降到最低，以确保制品在有效期内铝残留量不超标。铝可能具有引发低血色素性贫血、老年痴呆症、骨软化病和慢性肾功能损害等危险性。2015年版中国药典收入了人血白蛋白制品铝残留量的要求，质量标准与欧洲药典一致(≤200μg/l)。

如cn201110030776.4，该发明涉及一种生物制品技术中蛋白质的分离、提纯工艺方法，具体是一种人血白蛋白的生产方法。其主要特点是：用三步法进行分离，简化现有的分离工艺，提高了产品收率和生产效率，在压滤时加入合适比例的硅藻土作为助滤剂，提高过滤速度，改善过滤效果。加入层析步骤后，降低了人血白蛋白的多聚体含量，改进了人血白蛋白的稳定性，也控制了内毒素含量。产品的各项质量指标均超过国家标准。所述的层析超滤，用的是deaesepharoseff柱层析。

cn201210308161.8，该发明涉及一种人血白蛋白的制备方法，该方法是从人血浆分离的废弃物组分iv沉淀中提取、纯化出人血白蛋白，从而可以提高血浆的综合利用。本发明包括以下步骤：1、将组分iv沉淀溶解后压滤分离得到滤液a；2、边搅拌滤液a边加入聚乙二醇，压滤分离，得到滤液b；3、调整滤液b的ph，控制滤液b的温度，压滤分离，得到滤液c；4、边搅拌滤液c边加入聚乙二醇，得到反应液c，压滤分离，得到沉淀；5、沉淀溶解，进行deaesepharosefastflow弱阴离子交换层析，超滤；6、将超滤液中的蛋白浓度稀释后加入辛酸钠，调整ph至6.8～7.0，除菌过滤、巴氏灭活，得到人血白蛋白成品。

cn201110030776.4采用三步法进行分离，过程中经历了组份i+ii+iii制造，组份iv制造，组份v制造，再采用deaesepharoseff柱层析。在传统低温乙醇工艺总增加了一步deaesepharoseff柱层析，分离步骤较多，将影响产品的收率，延长生产周期，增加生产成本。

cn201210308161.8采用组份iv沉淀为原料制备人血白蛋白，是一种从血液制品行业目前废弃物中回收人血白蛋白的工艺，该工艺从组份iv沉淀溶解压滤，在经过聚乙二醇沉淀，在通过deaesepharoseff柱层析制备人血白蛋白。首先，人血白蛋白在组份iv沉淀中的含量有限，产品得率有限。第二，工艺过程中采用了聚乙二醇沉淀法，使用了聚乙二醇这种化学物质，在成品中会有一部分聚乙二醇残留，在临床使用过程中存在安全隐患。第三，多年来的研究及文献报告，以组份iv沉淀为原料制备的人血白蛋白目前上市产品很少，稳定性不高，整体质量对比血浆为原料制备的产品差距较远。

虽然现有技术中出现了更为先进的技术，如江西博雅生物制药股份有限公司已授权发明专利《一种人血白蛋白的制备工艺》(专利号：zl201310355272.9)中通过对传统低温乙醇法制备工艺进行深度优化，得到一种制备工艺，通过采用压滤技术替代传统的离心技术进行固液分离，显著提高白蛋白收率>29g/l血浆，纯度>98％和制品的稳定性。通过采用zetaplus深层滤芯过滤结合延长巴氏灭活时间，有效地控制了制品的pka水平至<20iu/ml，降低了制品中热源超标和病毒感染的风险。工艺过程中使用2种梯度浓度的氯化钠溶液超滤，不仅可以控制制品中的乙醇残留量至<0.025％，而且能够有效将铝残留量降到最低至<50μg/l。

但不可否认的是，在对传统低温乙醇法制备工艺进行深度优化过程中，通过对传统技术的再创新是本行业的一个发展方向和突破，在创新工艺发展中，本发明试图找到一条采用低温乙醇法结合离子交换层析法分离纯化人血白蛋白新的工艺。

众所周知，层析分离法自20世纪60年代逐步发展,主要有分子筛层析、离子交换层析、亲和层析等,成为各类活性蛋白成分、微量蛋白成分的主要分离方法。国内外相关文献已有报道，阴离子deaesepharoseff、阳离子cmsepharoseff、分子筛sephaeryls-200hr凝胶、阴离子deaesephadexa50和阳离子spsephadexc50等用于人血白蛋白的制备。

鉴于对传统低温乙醇法与层析分离法的组合路径中存在诸多不确定性和工艺复杂性，因此，解决上述问题就成为本发明的主要创造性劳动的具体体现。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本申请首次提出在人血白蛋白的制备工艺中采用低温乙醇法结合离子交换层析法分离纯化人血白蛋白，从白蛋白收率、纯度和制品的稳定性等方面考虑，通过对比明显更有优势，临床使用安全性将更好，缩短了制备周期，提高了效率。需要特别指出的是由于传统低温乙醇工艺因乙醇加入过程是一个放热过程，需要全过程低温环境，否则蛋白很容易变性，造成不可逆的后果；而本申请工艺中层析过程可以在常温下进行，不需要全过程低温环境，方便了制作，将有效地节约能源，降低成本；同时，本发明层析分离工艺中从众多层析填料中不断地优化筛选，最后选用fractogelemddeae，取得了非常好的效果，特别是对于本工艺的实施产生了出人意料的效果。

本申请人是zl201310355272.9权利人的关联公司，在zl201310355272.9发明人的共同参与下，针对本新的技术路径，通过不断地协同创新，得到本发明。本发明目的提供一种能提高白蛋白的得率和稳定性、保证产品的质量的人血白蛋白的制备工艺。

本发明的技术方案是：

一种人血白蛋白的制备工艺，它采用低温乙醇法结合离子交换层析法分离纯化人血白蛋白，以人血浆为原料，分别进行血浆溶解；吸附；组分i制作；组分ii+iii制作；超滤；层析；超滤；稀配；巴氏灭活病毒；蛋白除菌分装；制品孵育；成品包装，从白蛋白收率、纯度和制品的稳定性入手采用采用a50凝胶吸附和fractogelemddeae作层析填料，在常温下进行层析过程；

其中，a50凝胶平衡液：0.10mol/lnacl+0.02mol/l枸橼酸钠，ph6.5-6.8；

fractogelemddeae层析平衡液：0.02mol/l枸橼酸钠+0.1mol/lnacl，ph6.5-7.0；fractogelemddeae层析洗脱液：0.02mol/l枸橼酸钠+1mol/lnacl，ph6.5-7.0。

进一步，组分i制作步骤是，启动冷媒系统及搅拌，将血浆冷却至0～1℃之间，滴加ph4.0缓冲液，控制流速不超过1.0升/分钟，调节ph值为6.80～7.20；添加－20℃以下的95％乙醇至乙醇终浓度为8％，流速不超过1.0升/分钟，温度控制在-1～-3℃；加完乙醇后进行离心，离心得组分i沉淀和组分i上清液。

进一步，组分ii+iii制作步骤是，组分i上清液用ph4.0缓冲液调节至ph值为6.00～6.50，控制流速不超过1.0升/分钟；启动冷媒，缓慢加入－20℃以下的95％乙醇至乙醇体积比浓度为19％，流速不超过1.0升/分钟，温度控制在－4～－6℃；加完乙醇后，搅拌120分钟以上后，静置60分钟以上，再开启搅拌，按每升反应液加入18g硅藻土，进行压滤，压滤后得组分ⅱ+ⅲ沉淀和组分ⅱ+ⅲ上清液。

进一步，ph4.0缓冲液：取65.6g无水醋酸钠，加冰醋酸244.9ml，用适量注射用水充分溶解，加注射用水定容至1l混匀。

进一步，获得组分ⅱ+ⅲ上清液后，将其蛋白含量调节为5％～8％，用8倍体积的2～8℃的0.85％氯化钠溶液进行等体积透析；透析结束后，调节溶液ph为6.5-7.0，调节电导率值为1ms/cm，即得层析上样蛋白液；上样已平衡好的层析柱，平衡液冲洗2-3倍柱体积，洗脱液洗脱，收集洗脱液；将收集到的洗脱蛋白液浓缩至蛋白含量为15％以上，浓缩结束后，用6倍体积的2～8℃的0.5％氯化钠溶液进行等体积透析；透析结束后，将蛋白浓度浓缩至20％以上；使用1mol/lnahco3调节蛋白液的ph值至6.80～7.20。

进一步，稀配液制备后，使用60±5℃的夹套循环水升温，当蛋白液温度升至59.5℃时，开始计时，进行59.5～60.5℃巴氏灭活12h，巴氏灭活结束后，将蛋白液温度降至20～30℃，使用0.2μm的除菌滤芯进行除菌过滤，按要求进行灌装，将灌装后制品移至30～32℃孵放间孵育14天，孵育完后，进行成品检定，将检定合格的产品进行包装。

本发明的有益效果：

一、创新的技术具有以下优点：

本发明技术主要路径为：采用低温乙醇法结合离子交换层析法分离纯化人血白蛋白，以人血浆为原料，分别进行血浆溶解；吸附；组分i制作；组分ii+iii制作；超滤；fractogelemddeae层析；超滤；稀配；巴氏灭活病毒；蛋白除菌分装；制品孵育；成品包装；

cn201110030776.4主要路径为：采用低温乙醇法结合离子交换层析法分离纯化人血白蛋白，以人血浆为原料，分别进行血浆溶解；组分i+ii+iii制作；压滤；组分iv制作；压滤；组分v制作；压滤；deaesepharoseff层析；超滤；稀配；巴氏灭活病毒；蛋白除菌分装；成品包装；

cn201210308161.8主要路径为：本发明为一种人血白蛋白的制备方法，以人血浆分离的废弃物组份iv沉淀为原料，进行组份iv沉淀溶解，压滤；聚乙二醇沉淀，压滤；deaesepharoseff层析；超滤；稀配；巴氏灭活病毒；蛋白除菌分装；成品包装；

虽然cn201110030776.4和cn201210308161.8皆采用了离子交换层析法，但其层析所处的工艺步骤不同，对比现有专利cn201110030776.4，本发明专利在制备到组份ii+iii已经通过工艺优化除去了大量的杂蛋白，再直接进行一步离子交换层析，就能取得非常理想的效果。比现有专利cn201110030776.4节省了步骤，将节约工序，降低生产成本和生产周期。对比现有专利cn201210308161.8，本发明以人血浆为原料，采用先进的工艺，提高了人血白蛋白的分离效率，提高白蛋白收率、纯度，一些人血白蛋白产品不易控制的指标(如pka、铝离子、多聚体等)也在该工艺制备的产品中表现很好，分离出来的白蛋白质量稳定，临床使用安全性高。特别是本工艺中通过大量填料的筛选和工艺优化，确认了采用fractogelemddeae层析及对应的参数，取得了非常好的效果，这在本发明工艺中具有非常重要和不可替代的作用。

本发明采用低温乙醇法结合离子交换层析法，充分利用人血白蛋白传统制备工艺的优点和不断的工艺优化，进行了冷沉淀的离心，a50凝胶吸附，组分i制作，组分ii+iii制作，即有效的除去了白蛋白以外的其他大量蛋白，并且每一步所得到的组分都能制备其他血液制品，提高血浆的综合利用率。采用离子交换层析法，通过多种层析填料的筛选，筛选出fractogelemddeae，缩短了传统工艺的周期，提高了人血白蛋白的分离效率，所得产品的情况也更优于传统工艺，如提高白蛋白收率、纯度，一些人血白蛋白产品不易控制的指标(如pka、铝离子、多聚体等)也在该工艺制备的产品中表现很好，分离出来的白蛋白质量稳定，临床使用安全性高。整个制备过程不需要全过程低温环境，能有效地节约能源，方便操作，降低生产成本。

二、由于cn201110030776.4和cn201210308161.8中没有明确的参数，不好比较；现将本发明制备的产品与《中国药典》2015版三部中描述的人血白蛋白关键质量指标对比如下：

使用本发明制备的人血白蛋白与现有技术相比具有明显的优势，首先制作周期较传统工艺缩短了2天以上，其次白蛋白收率>30g/l血浆，高于行业内现有水平。其他主要技术指标，如纯度、多聚体含量、激肽释放酶原激活剂(pka)含量等，也均超过国家标准。部分技术指标与《中国药典》2015版三部标准对比如下：

三、本发明与zl201310355272.9产品对比及在生产过程中的优势。

对比zl201310355272.9发明专利，本发明采用低温乙醇法结合离子交换层析法，充分利用人血白蛋白传统制备工艺的优点和不断的工艺优化，进行了冷沉淀的离心，a50凝胶吸附，组分i制作，组分ii+iii制作，即有效的除去了白蛋白以外的其他大量蛋白，并且每一步所得到的组分都能制备其他血液制品，提高血浆的综合利用率。采用离子交换层析法，通过多种层析填料的筛选，筛选出fractogelemddeae，缩短了传统工艺的周期，提高了人血白蛋白的分离效率，所得产品的情况也更优于传统工艺，如提高白蛋白收率、纯度，一些人血白蛋白产品不易控制的指标(如pka、铝离子、多聚体等)也在该工艺制备的产品中表现很好，分离出来的白蛋白质量稳定，临床使用安全性高。整个制备过程不需要全过程低温环境，能有效地节约能源，方便操作，降低生产成本。

可见，本申请人在zl201310355272.9原有技术团队的支持下，就不同技术方向，寻找多条技术路径中做出的技术贡献。

附图说明

图1为本发明人血白蛋白制备工艺流程图

图2为本发明实例中制备出样品的纯度结果扫描图。

图3为本发明实例中制备出样品的多聚体含量结果扫描图。

图4为本发明实例中制备出第一次样品的铝残留量结果扫描图。

图5为本发明实例中制备出第二次样品的铝残留量结果扫描图。

图6为本发明实例中制备出第三次样品的铝残留量结果扫描图。

图7为本发明实例中制备出样品的激肽释放酶原激活剂(pka)含量结果扫描图。

具体实施方式

本发明可以通过上述发明技术方案具体实施，通过下述技术实验报告及实施例作进一步说明，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。

实施例1：

人血白蛋白的制备工艺：

一、基本要求

1、原料血浆的采集和质量应符合“血液制品生产用人血浆”

2、生产设备管路期间应清洁消毒等。

二、主要试剂配制

1、ph4.0缓冲液：取65.6g无水醋酸钠，加冰醋酸244.9ml，用适量注射用水充分溶解，加注射用水定容至1l混匀。

2、a50凝胶平衡液：0.10mol/lnacl+0.02mol/l枸橼酸钠，ph6.5-6.8

3、fractogelemddeae层析平衡液：0.02mol/l枸橼酸钠+0.1mol/lnacl，ph6.5-7.0

4、fractogelemddeae层析洗脱液：0.02mol/l枸橼酸钠+1mol/lnacl，ph6.5-7.0

5、1mol/l碳酸氢钠溶液：取84g碳酸氢钠用适量注射用水充分溶解，加注射用水至1l混匀。

6、0.85％氯化钠透析液：取8.5g氯化钠用适量注射用水充分溶解，加注射用水至1l搅拌均匀。

7、0.5％氯化钠透析液：取5g氯化钠用适量注射用水充分溶解，加注射用水至1l搅拌均匀。

三、工艺流程，包括原料血浆溶解；a50凝胶吸附；组分i制作；组分ii+iii制作；超滤；fractogelemddeae层析；超滤；稀配；巴氏灭活病毒；蛋白除菌分装；制品孵育；成品包装。

1、融浆：将原料血浆先用75％酒精浸泡2～3分钟，再用注射用水冲洗表面，然后将原料血浆破袋输送至融浆罐，用30～35℃的水进行夹层循环融浆，血浆温度控制在0～4℃之间，离心分离冷沉淀，冷沉淀用于制备人凝血因子viii，去除冷沉淀后的血浆输送至反应罐；

2、a50凝胶吸附：将去除冷沉淀血浆升温至10-15℃，按血浆重量的1.0-1.3％加入用平衡液(0.10mol/lnacl+0.02mol/l枸橼酸钠，ph6.5-6.8)平衡的a50凝胶，搅拌30分钟以上，过滤凝胶，凝胶吸附物用于制备人凝血酶原复合物，收集过滤液至反应罐中。

3、组分i制作：过滤液进入反应罐后，启动冷媒系统及搅拌，将血浆冷却至0～1℃之间，滴加ph4.0缓冲液(65.6g无水醋酸钠，244.9ml冰醋酸，适量注射用水溶解后，定容至1l)，控制流速不超过1.0升/分钟，调节ph值为6.80～7.20。添加－20℃以下的95％乙醇至乙醇终浓度为8％，流速不超过1.0升/分钟，温度控制在-1～-3℃。加完乙醇后进行离心，离心得组分i沉淀和组分i上清液，组分i沉淀用于制备人纤维蛋白原，组分i上清液进入下一步工序。

4、组分ii+iii制作：启动搅拌系统，组分i上清液用ph4.0缓冲液(65.6g无水醋酸钠，244.9ml冰醋酸，适量注射用水溶解后，定容至1l)调节至ph值为6.00～6.50，控制流速不超过1.0升/分钟。启动冷媒，缓慢加入－20℃以下的95％乙醇至乙醇体积比浓度为19％，流速不超过1.0升/分钟，温度控制在－4～－6℃。加完乙醇后，搅拌120分钟以上后，静置60分钟以上，再开启搅拌，按每升反应液加入18g硅藻土，进行压滤，压滤后得组分ⅱ+ⅲ沉淀和组分ⅱ+ⅲ上清液。组分ⅱ+ⅲ沉淀用于制备免疫球蛋白，组分ⅱ+ⅲ上清液进入下一步工序。

5、超滤：将组分ⅱ+ⅲ上清液的蛋白含量调节为5％～8％，用8倍体积的2～8℃的0.85％氯化钠溶液进行等体积透析。透析结束后，调节溶液ph为6.5-7.0，调节电导率值为1ms/cm，即得层析上样蛋白液。

6、fractogelemddeae层析：用3-5倍柱体积平衡液(0.02mol/l枸橼酸钠+0.1mol/lnacl，ph6.5-7.0)平衡层析柱，上样已平衡好的层析柱，平衡液冲洗2-3倍柱体积，洗脱液(0.02mol/l枸橼酸钠+1mol/lnacl，ph6.5-7.0)洗脱，收集洗脱液。

7、超滤：将收集到的洗脱蛋白液浓缩至蛋白含量为15％以上，浓缩结束后，用6倍体积的2～8℃的0.5％氯化钠溶液进行等体积透析。透析结束后，将蛋白浓度浓缩至20％以上。使用1mol/lnahco3调节蛋白液的ph值至6.80～7.20。

8、稀配：按20％蛋白浓度进行稀配，分别加入保护剂辛酸钠至0.16mmol/g蛋白浓度和氯化钠至最终原液145mmol/l，补加注射用水至最终稀配量，搅拌均匀。

9、巴氏灭活：稀配液搅拌均匀后，使用60±0.5℃的夹套循环水升温，当蛋白液温度升至59.5℃时，开始计时，进行59.5～60.5℃灭活10h。灭活完后，将蛋白液温度降至20～30℃。

10、蛋白除菌分装：将灭活后的蛋白液用0.2μm的除菌滤芯进行除菌过滤，按要求灌装。

11、制品孵育：将灌装后制品移至30～32℃孵放间孵育14天，孵育完后，进行成品检定。

12、成品包装：将检定合格的产品进行包装。

图2为本发明实例中制备出样品的纯度结果扫描，20170719批次人血白蛋白的纯度为98.6％。

图3为本发明实例中制备出样品的多聚体含量结果扫描，20170719批次人血白蛋白多聚体含量为2.4％。

图4为本发明实例中制备出第一次样品的铝残留量结果扫——20170719批次人血白蛋白铝残留量17μg/l。

图5为本发明实例中制备出第二次样品的铝残留量结果扫描，20170719批次人血白蛋白铝残留量17μg/l。

图6为本发明实例中制备出第三次样品的铝残留量结果扫描，20170719批次人血白蛋白铝残留量17μg/l。

图7为本发明实例中制备出样品的激肽释放酶原激活剂(pka)含量结果扫描，20170719批次人血白蛋白激肽释放酶原激活剂(pka)含量为14iu/ml。

需要说明的是，以上所述只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。