一种牛种布氏菌弱毒疫苗株S19的检测方法与流程

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种牛种布氏菌弱毒疫苗株s19的重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，rpa)快速鉴别方法。

背景技术：

布氏菌病(简称布病)是由布氏菌引起的全球广泛流行的人兽共患传染病，对畜牧业及公共卫生安全造成严重威胁。近年来我国布病疫情防治形势严峻，呈现由牧区向非牧区转移，由职业人群向非职业人群扩散的趋势。对家畜进行弱毒疫苗免疫能遏制布病向人间传播，但弱毒疫苗的免疫会对布病的诊断和监测造成干扰。实现布氏菌弱毒疫苗株与野生型菌株的鉴别，对于布病防控工作具有重要意义。

布氏菌s19株是国际上广泛应用的布氏菌弱毒疫苗株之一，也是世界动物卫生组织(oie)推荐的弱毒疫苗株。s19株能持续刺激机体产生抗体，广泛应用于牛的免疫接种。s19株属于光滑型布氏菌，含有lps脂多糖，动物免疫后产生的抗体无法与自然感染相区分，给布病诊断带来困难。而布氏菌分离鉴定需要在生物安全三级实验室进行，且耗时长，对人员和设备要求较高。

分子生物学技术的发展，为s19株的快速鉴别提供了手段，国际上已先后建立基于pcr和荧光定量pcr方法鉴别s19株的方法。rpa是近年一种新开发的恒温核酸扩增技术，该方法能在36～40℃恒温条件下于20min内大量扩增目的基因以完成检测，具有特异性强、灵敏度高、反应速度快、操作简便等优点。与常规的pcr和荧光定量pcr方法相比，pra反应条件为恒温，不需要进行变性、退火、延伸循环，对实验仪器设备依赖少且反应速度快，特别适用于现场检测。目前该技术已经在一些病原快速检测方面得到应用，但还没有基于rpa技术鉴别s19株的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种牛种布氏菌弱毒疫苗株s19的rpa快速鉴别检测方法，从而弥补现有布氏菌检测技术的不足。

本发明首先提供一组用于鉴别s19株的rpa引物组，引物信息如下：

omp2-f:cgtgcggcatgtaaccgtcgatcgtgtaatc(seqidno:1)、

omp2-r:tgcatatatcacgcttggtggtttcaaggtt(seqidno:2)、

s19e-f:cgctaacccggacgactacgatccttacgcat(seqidno:3)、

s19e-r:ggcagatttcattatccaccgcgccgccttc(seqidno:4)；

本发明还提供一种利用上述rpa引物组检测s19株的方法，包括如下的步骤：

1)待检测基因组dna的提取：用细菌基因组dna提取试剂盒(qiagen公司)提取细菌dna；

2)rpa步骤：将本发明设计rpa引物组及各反应组分，分别加入反应体系中，39℃反应30min。

3)结果检测：回收纯化rpa反应产物，2％琼脂糖凝胶电泳检测，判定检测结果。

另一方面，本发明的rpa引物组可用于制备检测试剂盒。

本发明引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：30min即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为1.0×10^-3ng/μl；2)特异性强：采用两对pra引物组特异性对s19进行鉴别检测，与其他种、生物型的布氏菌、布氏菌疫苗株及常见非布氏菌株，无交叉反应；3)操作简便：配置好的rpa反应体系，置于39℃恒温条件下完成反应，不需要使用pcr仪；4)高通量：可在水浴或恒温培养箱中一次性进行大量样品检测，不受pcr仪设备检测孔数量限制。

附图说明

图1：rpa方法检测s19株和非s19布氏菌株的凝胶电泳图

条带1为dl1000dnamarker；条带2为omp2引物检测s19株基因组dna模版；条带3为s19e引物检测s19株基因组dna模版；条带4为omp2引物检测非s19布氏菌代表株m5-90基因组dna模版；条带5为s19e引物检测m5-90株基因组dna模版；条带6为omp2引物检测阴性对照；条带7为s19e引物检测阴性对照。

图2:rpa方法灵敏度检测凝胶电泳图(含图2a和2b)

图2a.采用rpa方法检测系列稀释的s19株基因组dna模版，模版浓度为10ng/μl～1.0×10^-4ng/μl。其中，条带2～7为omp2引物检测结果，条带9～14为s19e引物检测结果。具体如下：条带1和8为dl1000marker；条带2和9为10ng/μl；条带3和10为1ng/μl；条带4和11为1.0×10^-1ng/μl；条带5和12为1.0×10^-2ng/μl；条带6和13为1.0×10^-3ng/μl；条带7和14为1.0×10^-4ng/μl。

图2b.采用rpa方法检测系列稀释非s19布氏菌代表株m5-90基因组dna模版，模版浓度为10ng/μl～1.0×10^-4ng/μl。其中，条带2～7为omp2引物检测结果，条带9～14为s19e引物检测结果。具体如下：条带1和8为dl1000marker；条带2和9为10ng/μl；条带3和10为1ng/μl；条带4和11为1.0×10^-1ng/μl；条带5和12为1.0×10^-2ng/μl；条带6和13为1.0×10^-3ng/μl；条带7和14为1.0×10^-4ng/μl。

图3:rpa方法特异性检测凝胶电泳图(含图3a、3b和3c)

图3a和3b.采用pra方法检测布氏菌常见种、生物型参考株与布氏菌疫苗株的基因组dna模版。其中，图3a为omp2引物检测结果，图3b为s19e引物检测结果。具体如下：条带1，dl1000dnamarker；条带2,brucellasuisbiovar1s1330；条带3,b.suisbiovar2thomsen；条带4,b.suisbiovar3686；条带5,b.suisbiovar440；条带6,b.abortusbiovar1a544；条带7,b.abortusbiovar286/8/59；条带8,b.abortusbiovar3tulya；条带9,b.abortusbiovar4292；条带10,b.abortusbiovar5b3196；条带11,b.abortusbiovar6870；条带12,b.abortusbiovar763/75；条带13,b.abortusbiovar9c68；条带14,b.melitensisbiovar116m；条带15,b.melitensisbiovar263/9；条带16,b.melitensisbiovar3ether；条带17,b.ovis63/290；条带18,b.canisrm6/66；条带19,b.neotomae5k33；条带20,s19；条带21,m5-90；条带22,s2；条带23,a19；条带24,阴性对照；条带25，阳性对照。

图3c.采用pra方法检测四种常见非布氏菌株基因组dna模版。其中，条带1～7为omp2引物检测结果，条带8-14为s19e引物检测结果。具体如下：条带1和8，dl1000dnamarker；条带2和9，escherichiacolik99；条带3和10，pasteurellamultocidac48-1；条带4和11，streptococcussuisst171；条带5和12，pseudomonasaeruginosadi-1；条带6和13,阴性对照；条带7和14，阳性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。

实施例1、用于检测s19株的rpa引物组的设计

牛种布氏菌s19株于1923年由美国自牛奶中分离，经实验室自然传代减毒后，成为一株毒力稳定的弱毒菌株。s19株是赤藓糖醇敏感株，与其它布氏菌基因组比较，s19株存在显著的eryc基因缺失。omp2基因是布氏菌高度保守的基因，存在于所有的种型布氏菌基因组中。本发明使用oligo软件首先根据omp2基因设计了布氏菌株通用检测引物omp2，再根据eryc基因设计了s19株鉴别引物s19e，使用上述两组引物可实现s19株的有效鉴别。设计筛选合适的引物是进行rpa反应的关键，设计引物时需要考虑碱基组成、gc含量、二级结构的形成、tm值等因素，随后进行大量实验，从中筛选检测效果最好的引物对。

使用上述引物检测时，omp2引物可扩增所有种型布氏菌株omp2基因片段，s19e引物可扩增除s19株外的所有布氏菌株中eryc基因片段。反应完成后回收产物，进行琼脂糖凝胶电泳，omp2引物检测阳性，s19e引物检测阴性，可判断该模板来源于s19株；omp2引物检测阳性，s19e引物检测阳性，可判断该模板来源于非s19的其它布氏菌菌株。引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，引物如表1所示：

表1：rpa引物的序列信息

实施例2、牛种布氏菌弱毒疫苗株s19rpa的效果检测

1.1试验材料

菌株：使用的布氏菌常见种、生物型参考株及布氏菌疫苗株，见表2；四个非布氏菌参考菌株：大肠杆菌k99、巴氏杆菌c48-1、猪链球菌st171、绿脓杆菌di-1。

表2：使用的布氏菌株及登录号

1.2细菌dna提取

将上述菌株菌种接种胰蛋白琼脂培养基，37℃培养24～72h，根据需要不添加或添加5～10％co2。培养菌落用含0.5％甲醛的生理盐水洗涤后，37℃灭活24h，用细菌基因组dna提取试剂盒(qiagen公司)提取细菌dna，微量核酸蛋白测定仪测定细菌基因组dna浓度，冻存于-20℃，备用，作为rpa扩增模板。

1.3rpa反应体系及条件

反应条件：39℃30min。

s19e引物反应体系为：

反应条件：39℃30min。

1.4rpa反应产物的检测

反应结束后，使用dna片段回收试剂盒(北京聚合美生物技术有限公司)回收纯化rpa反应产物，2％琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5rpa方法的灵敏度评价

灵敏度评价：经超微量核酸蛋白测定仪测定，布氏菌s19株和非s19布氏菌代表株m5-90基因组dna的浓度分别为12.0ng/μl和30.0ng/μl。首先将s19株和m5-90株基因组dna定量稀释至10.0ng/μl，然后进行10倍系列梯度稀释。用rpa方法分别检测系列稀释的布氏菌s19株和m5-90株基因组dna模版，每个反应加入1μl作为模板。反应结束后回收产物，2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后进行成像分析。评估pra方法检测s19株和非s19的布氏菌株的灵敏度。

1.6rpa方法的特异性评价

特异性评价：分别提取布氏菌常见种、生物型参考株与布氏菌疫苗株(见表2，编号1～23)以及大肠杆菌k99、巴氏杆菌c48-1、猪链球菌st171、绿脓杆菌di-1的基因组dna。以无菌水代替细菌dna模板作为阴性对照。评估pra方法鉴别s19株的特异性。

2结果与分析

2.1rpa灵敏度检测结果

图2a显示，rpa方法检测s19株基因组dna的灵敏度为1.0×10^-3ng/μl；图2b显示，rpa方法检测非s19布氏菌株基因组dna的灵敏度为1.0×10^-3ng/μl。

2.2rpa特异性检测结果

图3a显示，rpa方法中，omp2引物可检测样品盘中常见种、生物型布氏菌与疫苗株基因组dna；3b显示，rpa方法中，s19e引物可检测样品盘中除s19株外常见种、生物型布氏菌与疫苗株基因组dna；图3c显示，pra方法的两组引物检测大肠杆菌、巴氏杆菌、猪链球菌、绿脓杆菌基因组dna均无交叉反应。结果说明，本研究建立的rpa方法特异性好，通过两组引物共同检测，可实现布氏菌s19株的有效鉴别。

上述结果表明，本发明的布氏菌s19株rpa引物及检测方法灵敏度高、特异性好，通过检测可快速、有效地鉴别检测样品是否为布氏菌s19株。同时，操作简便，在恒温水浴或培养箱条件下即可进行反应，检测不受pcr仪器设备检测孔数量的限制，可同时大批量进行检测。

序列表

<110>中国动物卫生与流行病学中心

<120>一种牛种布氏菌弱毒疫苗株s19的检测方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgtgcggcatgtaaccgtcgatcgtgtaatc31

<210>2

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tgcatatatcacgcttggtggtttcaaggtt31

<210>3

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgctaacccggacgactacgatccttacgcat32

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggcagatttcattatccaccgcgccgccttc31