微生物对肠道菌群的影响的评估方法及具有稳定的肠道菌群的动物模型的构建方法与流程

文档序号：14657221发布日期：2018-06-12 06:24阅读：171来源：国知局

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种微生物对肠道菌群的影响的评估方法及具有稳定的肠道菌群的动物模型的构建方法。

背景技术：

肠道菌群对生物体的生理、免疫、营养及消化等方面均起着至关重要的作用。肠道菌群包括有益菌群和有害菌群，其中，有益菌能够合成多种生物体生长发育所必需的维生素，参与糖类和蛋白质的代谢，促进铁、镁及锌等矿物元素的吸收。在正常情况下，生物体肠道内的有益菌和有害菌处于相对平衡的状态。一旦肠道菌群失去平衡，有害菌占优势时，有害菌能够将摄入的营养物质转化成有害的物质，进而对生物体产生不良的影响。

一些研究通过使生物体摄入一些有益微生物来维持肠道菌群的平衡。目前，对于这些微生物对肠道菌群的影响的评价，主要是利用反应器模拟肠道环境，向反应器中添加微生物并培养，以检测这些微生物对肠道菌群的影响，但是这种方式不能真实地反映微生物在动物肠道中对肠道菌群的影响，得到的结果准确性较差。

技术实现要素：

基于此，有必提供一种能够真实且较为准确地评估微生物对肠道菌群的影响的评估方法。

此外，提供一种具有稳定的肠道菌群的动物模型的构建方法。

一种微生物对肠道菌群的影响的评估方法，包括如下步骤：

给无菌动物饲喂粪便悬液，使得所述无菌动物的肠道内达到稳态，得到动物模型；

分别饲喂第一组动物模型和第二组动物模型，其中，给所述第一组动物模型饲喂无菌饲料，给所述第二组动物模型饲喂含有待测微生物的无菌饲料，所述含有待测微生物的无菌饲料中的所述待测微生物的添加量为 10⁵cfu/g～10⁷cfu/g，收集饲喂后所述第一组动物模型的粪便得到第一粪便，收集饲喂后所述第二组动物模型的粪便得到第二粪便；及

通过实时荧光定量PCR分别检测所述第一粪便和所述第二粪便中肠道菌群的含量，所述肠道菌群包括双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌，

若则所述待测微生物对所述肠道菌群具有促进作用，其中，a'表示所述第一粪便中所述双歧杆菌的含量，b'表示所述第一粪便中所述乳杆菌的含量，c'表示所述第一粪便中所述肠杆菌的含量，d'表示所述第一粪便中所述肠球菌的含量，a表示所述第二粪便中所述双歧杆菌的含量，b表示所述第二粪便中所述乳杆菌的含量，c表示所述第二粪便中所述肠杆菌的含量，d表示所述第二粪便中所述肠球菌的含量。

上述评估方法通过给无菌动物饲喂粪便悬液，能够得到肠道内达到稳态的动物模型，该动物模型中除了粪便悬液中的菌群，不含有其他任何外源的菌，能够保证评价微生物对肠道菌群的影响的准确性。由于通过给两组动物模型饲喂分别饲喂无菌饲料和含有待测微生物的无菌饲料，并收集饲喂后动物模型的粪便，得到第一粪便和第二粪便，使得第一粪便和第二粪便中的肠道菌群的分布更接近于生物体的肠道菌群的分布，能够更加真实地反应微生物对肠道菌群的影响。又由于通过实时荧光定量PCR检测粪便中肠道菌群的含量，使得检测结果更加准确。同时，通过将第一粪便中双歧杆菌及乳杆菌的含量的对数之和与肠杆菌及肠球菌的含量的对数之和的比值与第二粪便中双歧杆菌及乳杆菌的含量的对数之和与肠杆菌及肠球菌的含量的对数之和的比值之间的差异作为待测微生物对肠道菌群的影响的评价指标，能够更加准确的反映肠道菌群的变化，进而更加准确地反映待测微生物对肠道菌群的影响。经试验验证，通过上述评估方法对双歧杆菌、乳酸菌、嗜酸杆菌、丁酸梭菌及产气荚膜梭菌对肠道菌群的影响进行评估，结果显示双歧杆菌、乳酸菌、嗜酸杆菌及丁酸梭菌均对肠道菌群有促进作用，产气荚膜梭菌不利于肠道菌群的稳定，导致肠杆菌和肠球菌的大量增值，同时，上述评估方法得到的双歧杆菌对肠道菌群的影响的趋势与在反应器模拟培养得到的双歧杆菌对肠道菌群的影响的趋势是一致，说明上述评估方法能够真实且较为准确地评估微生物对肠道菌群的影响。

在其中一个实施例中，所述给无菌动物饲喂粪便悬液，使得所述无菌动物的肠道内达到稳态的操作具体如下：

在无菌环境中，给所述无菌动物饲喂所述粪便悬液，饲喂14天～21天，得到所述动物模型，其中，所述粪便悬液的浓度为0.2g/mL～0.5g/mL，所述粪便悬液的饲喂量为每kg所述无菌动物每次饲喂0.3mL～0.5mL的所述粪便悬液。

在其中一个实施例中，所述无菌环境的温度为20℃～24℃，湿度为 40％～70％。

在其中一个实施例中，所述粪便为猪的粪便或人的粪便，所述无菌动物为无菌小鼠或无菌大鼠。

在其中一个实施例中，所述给所述第二组动物模型喂含有待测微生物的无菌饲料的操作中，每kg所述第二组动物模型每次饲喂2g～5g的含有所述待测微生物的无菌饲料，饲喂的频率为1次/天～2次/天，饲喂的时间至少为7天。

在其中一个实施例中，所述无菌饲料包括小麦、奶粉、豆粕、植物油、维生素、酵母、磷酸氢钙及柠檬酸，所述小麦、所述奶粉、所述豆粕、所述植物油、所述维生素、所述酵母、所述磷酸氢钙及所述柠檬酸的质量比为51：19.5： 11：9.75：0.001：2.5：0.5：0.001～52：20.5：12：10.75：0.1：4.5：1.5：0.525。

在其中一个实施例中，所述通过实时荧光定量PCR分别检测所述第一粪便和所述第二粪便中肠道菌群的含量的操作具体如下：

分别提取所述第一粪便和所述第二粪便中肠道菌群的基因组DNA，将所述基因组DNA分别与其中一种所述肠道菌群的正向引物、反向引物混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，所述肠道菌群包括双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌；及

分别获取所述第一粪便和所述第二粪便中每一种所述肠道菌群实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，将所述CT值带入相应的细菌标准品建立的标准曲线中，得到所述第一粪便和所述第二粪便中的每一种所述肠道菌群的含量。

在其中一个实施例中，所述双歧杆菌的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1 所示，所述双歧杆菌的反向引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示；及/或，

所述乳杆菌的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示，所述乳杆菌的反向引物的碱基序列如SEQ ID No.4所示；及/或，

所述肠杆菌的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.5所示，所述肠杆菌的反向引物的碱基序列如SEQ ID No.6所示；及/或，

所述肠球菌的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.7所示，所述肠球菌的反向引物的碱基序列如SEQ ID No.8所示。

在其中一个实施例中，所述待测微生物为双歧杆菌、乳酸菌、嗜酸杆菌或丁酸梭菌。

一种具有稳定的肠道菌群的动物模型的构建方法，包括以下步骤：给无菌动物饲喂粪便悬液，以使所述无菌动物的肠道内具有稳定的肠道菌群，得到所述动物模型；其中，所述粪便悬液的浓度为0.2g/mL～0.5g/mL，所述粪便悬液的饲喂量为每kg所述无菌动物每次饲喂0.3mL～0.5mL的所述粪便悬液。。

附图说明

图1为不同稀释倍数的双歧杆菌的PCR扩增后的溶解曲线；

图2为不同稀释倍数的乳杆菌的PCR扩增后的溶解曲线；

图3为不同稀释倍数的肠杆菌的PCR扩增后的溶解曲线；

图4为不同稀释倍数的肠球菌的PCR扩增后的溶解曲线；

图5为以双歧杆菌的DNA浓度的对数为横坐标，PCR扩增反应对应的CT 为纵坐标绘制的标准曲线；

图6为以乳杆菌的DNA浓度的对数为横坐标，PCR扩增反应对应的CT为纵坐标绘制的标准曲线；

图7为以肠杆菌的DNA浓度的对数为横坐标，PCR扩增反应对应的CT为纵坐标绘制的标准曲线；

图8为以肠球菌的DNA浓度的对数为横坐标，PCR扩增反应对应的CT为纵坐标绘制的标准曲线。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。未特别说明，序列表中的碱基序列均为从5’端到3’端的顺序。

一实施方式的微生物对肠道菌群的影响的评估方法，包括如下操作 S110～S130：

S110、给无菌动物饲喂粪便悬液，使得所述无菌动物的肠道内达到稳态，得到动物模型。

通过给无菌动物饲喂粪便悬液得到的动物模型，动物模型的肠道中除了粪便悬液中的菌群，不含有其他任何外源的菌，能够保证评价微生物对肠道菌群的影响的准确性。

具体地，在无菌环境中，给无菌动物饲喂浓度为0.2g/mL～0.5g/mL的粪便悬液，饲喂14天～21天，得到动物模型。当然，需要说明的是，在构建动物模型的过程中，除了给无菌动物饲喂粪便悬液，还会给无菌动物饲喂无菌饲料，以满足无菌动物的正常生长需要。

在其中一个实施方式中，粪便悬液中的粪便为猪的粪便或人的粪便。

在其中一个实施方式中，粪便悬液中的粪便为猪粪。通过给无菌动物饲喂猪粪，以得到具有稳定的猪的肠道菌群的动物模型。

在其中一个实施方式中，无菌动物为无菌小鼠或无菌大鼠。

优选地，无菌动物为无菌C57BL/6J小鼠。

在其中一个实施方式中，粪便悬液的饲喂量为每kg无菌动物每次饲喂 0.3mL～0.5mL的粪便悬液，粪便悬液的饲喂频率为1次/天～2次/天。

在其中一个实施方式中，粪便悬液的饲喂方式为灌喂。

在其中一个实施方式中，无菌环境为温度为20℃～24℃、湿度为40％～70％、光照与黑暗交替的环境。

优选地，无菌环境中光照的时间为12小时/天，黑暗的时间为12小时/天，进而较好地模拟自然环境中的白昼与黑夜的交替。

在其中一个实施方式中，动物模型构建的过程中，无菌饲料包括小麦、奶粉、豆粕、植物油、维生素、酵母、食盐、磷酸氢钙及柠檬酸，小麦、奶粉、豆粕、植物油、维生素、酵母、食盐、磷酸氢钙及柠檬酸的质量比为51：19.5： 11：9.75：0.001：3.5：0.875：0.5：0.001～52：20.5：12：10.75：1：4.5：1.875： 1.5：0.525。当然，需要说明的是，在动物模型构建的过程中，给无菌动物饲喂的无菌饲料不限于上述指出饲料，还可以为其他无菌饲料，只要能够满足无菌动物生长需要的无菌饲料均可。

在其中一个实施方式中，奶粉选自羊奶粉及牛奶粉中的至少一种。

在其中一个实施方式中，奶粉为脂肪质量百分含量为0％～20％的脱脂奶粉。

在其中一个实施方式中，植物油选自花生油、玉米油及大豆油中的至少一种。

在其中一个实施方式中，酵母为干酵母或酵母粉。

在其中一个实施方式中，维生素为维生素A、维生素D或维生素B1。

在其中一个实施方式中，无菌饲料的饲喂量为每kg无菌动物每次饲喂2g～5g 的无菌饲料，饲喂频率为1次/天～2次/天。

S120、分别饲喂第一组动物模型和第二组动物模型，给第一组动物模型饲喂无菌饲料，给第二组动物模型饲喂含有待测微生物的无菌饲料，含有待测微生物的无菌饲料中的待测微生物的添加量为10⁵cfu/g～10⁷cfu/g，收集饲喂后第一组动物模型的粪便得到第一粪便，收集饲喂后第二组动物模型的粪便得到第二粪便。

通过给两组动物模型饲喂分别饲喂无菌饲料和含有待测微生物的无菌饲料，使得第一粪便和第二粪便中的肠道菌群的分布更接近于生物体的肠道菌群的分布，能够更加真实地反应微生物对肠道菌群的影响。

在其中一个实施方式中，待测微生物为双歧杆菌、乳酸菌、嗜酸杆菌或丁酸梭菌。当然，需要说明的是，待测微生物不限于上述指出的微生物，也可以为双歧杆菌、乳杆菌、嗜酸杆菌及丁酸梭菌之间任意组合得到的微生物混合，还可以为其他微生物，例如枯草芽孢杆菌。

在其中一个实施方式中，无菌饲料包括小麦、奶粉、豆粕、植物油、维生素、酵母、食盐、磷酸氢钙及柠檬酸，小麦、奶粉、豆粕、植物油、维生素、酵母、食盐、磷酸氢钙及柠檬酸的质量比为51：19.5：11：9.75：0.001：3.5： 0.875：0.5：0.001～52：20.5：12：10.75：1：4.5：1.875：1.5：0.525。

在其中一个实施方式中，奶粉选自羊奶粉及牛奶粉中的至少一种。

在其中一个实施方式中，奶粉为脂肪质量百分含量为0％～20％的脱脂奶粉。

在其中一个实施方式中，植物油选自花生油、玉米油及大豆油中的至少一种。

在其中一个实施方式中，酵母为干酵母或酵母粉。当然，需要说明的是，酵母不限于上述指出的物质，也可以为湿酵母，只要保证湿酵母干制或干燥后与干酵母在无菌饲料中的占比相当即可。

在其中一个实施方式中，维生素为维生素A、维生素D及维生素B1中的至少一种。

在其中一个实施方式中，给第一组动物模型和第二组动物模型饲喂的无菌饲料与在动物模型构建过程中的无菌饲料相同。

在其中一个实施方式中，给第二组动物模型喂含有待测微生物的无菌饲料的操作中，每kg第二组动物模型每次饲喂2g～5g的含有待测微生物的无菌饲料，饲喂的频率为1次/天～2次/天，饲喂的时间至少为7天，且给第一组动物模型饲喂无菌饲料的量与给第二组动物模型饲喂含待测微生物的无菌饲料的量相等，第一组动物模型的培养条件与第二组动物模型的培养条件相同。

S130、通过实时荧光定量PCR分别检测所述第一粪便和所述第二粪便中肠道菌群的含量，肠道菌群包括双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌，若则待测微生物对肠道菌群具有促进作用，其中，a'表示第一粪便中双歧杆菌的含量，b'表示第一粪便中乳杆菌的含量，c'表示第一粪便中肠杆菌的含量，d'表示第一粪便中肠球菌的含量，a表示第二粪便中双歧杆菌的含量，b表示第二粪便中乳杆菌的含量，c表示第二粪便中肠杆菌的含量，d表示第二粪便中肠球菌的含量。

通过将第一粪便中双歧杆菌及乳杆菌的含量的对数之和与肠杆菌及肠球菌的含量的对数之和的比值与第二粪便中双歧杆菌及乳杆菌的含量的对数之和与肠杆菌及肠球菌的含量的对数之和的比值之间的差异作为待测微生物对肠道菌群的影响的评价指标，能够更加准确的反映肠道菌群的变化，进而更加准确地反映待测微生物对肠道菌群的影响。

具体地，S130包括如下步骤：

S131、分别提取第一粪便和第二粪便中肠道菌群的基因组DNA，将基因组 DNA分别与其中一种肠道菌群的正向引物、反向引物混合进行实时荧光定量 PCR扩增反应，其中，肠道菌群包括双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌。

具体地，实时荧光定量PCR扩增反应的反应体系为15mL的SYBR Green Realtime PCR Master Mix、1mL的其中一种肠道菌群的正向引物、1mL的相应肠道菌群的反向引物、2μL的基因组DNA，加蒸馏水至总体积20μL。

在其中一个实施方式中，双歧杆菌的正向引物针对双歧杆菌的V3区的5' 端设计，双歧杆菌的反向引物针对双歧杆菌的V3区的3'端设计。

在其中一个实施方式中，双歧杆菌的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1 所示，双歧杆菌的反向引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示。

在其中一个实施方式中，乳杆菌的正向引物针对乳杆菌的V3区的5'端设计，乳杆菌的反向引物针对乳杆菌的V3区的3'端设计。

在其中一个实施方式中，乳杆菌的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示，乳杆菌的反向引物的碱基序列如SEQ ID No.4所示。

在其中一个实施方式中，肠杆菌的正向引物针对肠杆菌的V3区的5'端设计，肠杆菌的反向引物针对肠杆菌的V3区的3'端设计。

在其中一个实施方式中，肠杆菌的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.5所示，肠杆菌的反向引物的碱基序列如SEQ ID No.6所示。

在其中一个实施方式中，肠球菌的正向引物针对肠球菌的V3区的5'端设计，肠球菌的反向引物针对肠球菌的V3区的3'端设计。

在其中一个实施方式中，肠球菌的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.7所示，肠球菌的反向引物的碱基序列如SEQ ID No.8所示。

S132、分别获取所述第一粪便和所述第二粪便中每一种肠道菌群实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，将CT值带入相应的细菌标准品建立的标准曲线中，得到第一粪便和第二粪便中的每一种肠道菌群的含量。通过实时荧光定量 PCR检测粪便中肠道菌群的含量，使得检测结果更加准确。

在其中一个实施方式中，相应的细菌标准品建立的标准曲线通过如下操作得到：

S1321、提取每种肠道菌群相应的细菌标准品的基因组DNA并进行梯度稀释，获得梯度DNA浓度的细菌标准品的基因组DNA。

具体地，进行梯度稀释所用的稀释液例如为无菌TE缓冲液。

S1322、将梯度DNA浓度的细菌标准品的基因组DNA与相应的肠道菌群的正向引物、反应引物进行实时荧光定量PCR扩增反应。

S1323、获取每个DNA浓度的细菌标准品的基因组DNA对应的实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，根据CT值与DNA浓度的对应关系建立标准曲线。

S133、通过比较第一粪便与第二粪便中的肠道菌群的含量，判断待测微生物对肠道菌群的影响。

具体地，若则待测微生物对肠道菌群具有促进作用，即待测微生物能够促进肠道菌群的稳定。

在其中一个实施方式中，则待测微生物对肠道菌群具有明显的促进作用。同时，说明待测微生物为益生菌，能够用于饲喂动物或给人食用，以促进动物或人的肠道菌群的稳定。

在其中一个实施方式中，则待测微生物不利于肠道菌群的稳定，导致肠杆菌或肠球菌等有害微生物的大量增殖。

在其中一个实施方式中，则待测微生物非常不利于肠道菌群的稳定。同时，表明待测微生物不能用于饲喂动物或给人食用。

上述评估方法通过给无菌动物饲喂粪便悬液，能够得到具有稳定的肠道菌群的动物模型，该动物模型中除了粪便悬液中的菌群，不含有其他任何外源的菌，能够保证评价微生物对肠道菌群的影响的准确性。由于通过给两组动物模型饲喂分别饲喂无菌饲料和含有待测微生物的无菌饲料，并收集饲喂后动物模型的粪便，得到第一粪便和第二粪便，使得第一粪便和第二粪便中的肠道菌群的分布更接近于生物体的肠道菌群的分布，能够更加真实地反应微生物对肠道菌群的影响。又由于通过实时荧光定量PCR检测粪便中肠道菌群的含量，使得检测结果更加准确。同时，通过将第一粪便中双歧杆菌及乳杆菌的含量的对数之和与肠杆菌及肠球菌的含量的对数之和的比值与第二粪便中双歧杆菌及乳杆菌的含量的对数之和与肠杆菌及肠球菌的含量的对数之和的比值之间的差异作为待测微生物对肠道菌群的影响的评价指标，能够更加准确的反映肠道菌群的变化，进而更加准确地反映待测微生物对肠道菌群的影响。

以下为具体实施例部分。

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

未特别说明，以下实施例中所使用的粪便基因组DNA提取试剂为QIAarnp DNAStool Mini Kit试剂盒(购自QIAGEN，Germany)。细菌标准品的基因组 DNA提取试剂为细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302，购自TIANGEN)。双歧杆菌标准品(CGMCCl.2186，购自SIGMA-ALDRICH)。乳杆菌标准品(ATCCll741，购自SIGMA-ALDRICH)。肠杆菌标准品(CGMCCl.90，购自 SIGMA-ALDRICH)。肠球菌标准品(CGMCCl.125，购自SIGMA-ALDRICH)。实时荧光定量PCR扩增反应的试剂为SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒(购自SIGMA-ALDRICH)，Taq DNA聚合酶(S4438，购自 SIGMA-ALDRICH)。相应微生物的正向引物及反向引物均通过基因合成的方式获得。双歧杆菌的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示，双歧杆菌的反向引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示。乳杆菌的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示，乳杆菌的反向引物的碱基序列如SEQ ID No.4所示。肠杆菌的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.5所示，肠杆菌的反向引物的碱基序列如SEQ ID No.6所示。肠球菌的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.7所示，肠球菌的反向引物的碱基序列如SEQ ID No.8所示。

未特别说明，以下实施例中，实验地点为第三军医大学基础部实验动物学教研室。放入到无菌隔离器中的物品均需事先经过高温高压、Co⁶⁰或50kGy射线辐照灭菌。粪便悬液均为猪粪便悬液，猪粪便的来源为武汉天种猪场的健康保育猪。粪便悬液的制备过程为准确称取10g猪粪便样品加入0.85％的无菌生理盐水稀释至所需浓度，充分匀浆后过滤，即得到相应的粪便悬液。维生素均为质量比为12：3：40的维生素A、维生素D及维生素B1。脱脂奶粉中的脂肪含量为10％。

实施例1

本实施例的动物模型的构建过程如下：

将10只4周龄的C57BL/6J无菌小鼠饲养在20℃、湿度为70％、光照12 小时且黑暗12小时的无菌隔离器中，并灌胃浓度为0.2g/mL的粪便悬液，且每 kg无菌小鼠每次灌胃0.5mL的粪便悬液，每天灌胃1次，共灌胃14天；同时，每天给无菌小鼠饲喂无菌饲料，且每kg无菌小鼠每次饲喂2g无菌饲料，每天饲喂2次，共饲喂14天，其中，无菌饲料为小麦、羊奶粉、豆粕、花生油、维生素、干酵母、食盐、磷酸氢钙及柠檬酸，且小麦、羊奶粉、豆粕、花生油、维生素、干酵母、食盐、磷酸氢钙及柠檬酸的质量比为51：19.5：11：9.75：0.001： 3.5：0.875：0.5：0.001。分别在灌胃的第7天、灌胃的第14天、停止灌胃后的第7天、停止灌胃后的第14天、停止灌胃后的第21天收集无菌小鼠的粪便，采用实时荧光定量PCR扩增反应测定粪便中的双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌的含量。

实施例2

本实施例的动物模型的构建过程如下：

将10只4周龄的C57BL/6J无菌小鼠饲养在24℃、湿度为40％、光照12 小时且黑暗12小时的无菌隔离器中，并灌胃浓度为0.5g/mL的粪便悬液，且每 kg无菌小鼠每次灌胃0.3mL的粪便悬液，每天灌胃1次，共灌胃14天；同时，每天给无菌小鼠饲喂无菌饲料，且每kg无菌小鼠每次饲喂5g无菌饲料，每天饲喂1次，共饲喂14天，其中，无菌饲料为小麦、牛奶粉、豆粕、玉米油、维生素、酵母粉、食盐、磷酸氢钙及柠檬酸，且小麦、牛奶粉、豆粕、玉米油、维生素、酵母粉、食盐、磷酸氢钙及柠檬酸的质量比为52：20.5：12：10.75：1： 4.5：1.875：1.5：0.525。分别在灌胃的第7天、灌胃的第14天、停止灌胃后的第7天、停止灌胃后的第14天、停止灌胃后的第21天收集无菌小鼠的粪便，采用实时荧光定量PCR扩增反应测定粪便中的双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌的含量。

实施例3

本实施例的动物模型的构建过程如下：

将10只4周龄的C57BL/6J无菌小鼠饲养在22℃、湿度为55％、光照12 小时且黑暗12小时的无菌隔离器中，并灌胃浓度为0.5g/mL的粪便悬液，且每 kg无菌小鼠每次灌胃0.5mL的粪便悬液，每天灌胃2次，共灌胃14天；同时，每天给无菌小鼠饲喂无菌饲料，且每kg无菌小鼠每次饲喂2g无菌饲料，每天饲喂2次，共饲喂14天，其中，无菌饲料为小麦、脱脂奶粉、豆粕、大豆油、维生素、酵母粉、食盐、磷酸氢钙及柠檬酸，且小麦、脱脂奶粉、豆粕、大豆油、维生素、酵母粉、食盐、磷酸氢钙及柠檬酸的质量比为51.5：20.0：11.5： 10.25：0.5：4.0：1.375：1.0：0.125。分别在灌胃的第7天、灌胃的第14天、停止灌胃后的第7天、停止灌胃后的第14天、停止灌胃后的第21天收集无菌小鼠的粪便，采用实时荧光定量PCR扩增反应测定粪便中的双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌的含量。

实施例4

本实施例的微生物对肠道菌群的影响的评估过程：

将60只实施例3的动物模型分为六组，编号分别为1号、2号、3号、4号、 5号及6号，每组10只动物模型，给编号为1号、2号、3号、4号、5号及6 号的六组动物模型分别饲喂无菌饲料、含10⁵cfu/g双歧杆菌的无菌饲料、含 10⁵cfu/g乳酸菌的无菌饲料、含10⁵cfu/g嗜酸杆菌的无菌饲料、含10⁵cfu/g丁酸梭菌的无菌饲料及含10⁵cfu/g产气荚膜梭菌的无菌饲料，每kg动物模型每次饲喂2g相应的饲料，每天饲喂2次，共饲喂14天，其中，仅饲喂无菌饲料的动物模型作为对照组，无菌饲料为小麦、脱脂奶粉、豆粕、花生植物油、维生素、干酵母、食盐、磷酸氢钙及柠檬酸，且小麦、脱脂奶粉、豆粕、花生植物油、维生素、干酵母、食盐、磷酸氢钙及柠檬酸的质量比为51.5：20.0：11.5：10.25： 0.5：4.0：1.375：1.0：0.125，其他培养方式与实施例3相同。分别在饲喂的第 7天和饲喂的第14天收集动物模型的粪便，采用实时荧光定量PCR扩增反应测定粪便中的双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌的含量。

实施例5

本实施例的微生物对肠道菌群的影响的评估过程：

将40只实施例3的动物模型分为四组，编号分别为1#、2#、3#及4#，每组10只动物模型，给编号为1#、2#、3#及4#的四组动物模型分别饲喂含10⁷cfu/g 双歧杆菌的第二无菌饲料、第二无菌饲料、含10⁷cfu/g双歧杆菌的第一无菌饲料及第一无菌饲料，每kg动物模型每次饲喂2g相应的饲料，每天饲喂2次，共饲喂14天。其中，第一无菌饲料为小麦、脱脂奶粉、豆粕、玉米植物油、维生素、酵母粉、食盐、磷酸氢钙及柠檬酸，且小麦、脱脂奶粉、豆粕、玉米植物油、维生素、酵母粉、食盐、磷酸氢钙及柠檬酸的质量比为51.5：20.0：11.5： 10.25：0.5：4.0：1.375：1.0：0.125；第二无菌饲料为小麦、豆粕及大豆油，且小麦、豆粕及大豆油的质量比为51.5：11.5：10.25，其他培养方式与实施例3 相同。分别在饲喂的第7天和饲喂的第14天收集动物模型的粪便，采用实时荧光定量PCR扩增反应测定粪便中的双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌的含量。

实施例6

本实施例的微生物对肠道菌群的影响的评估过程：

(1)向恒化器中分别加入500mL无菌肠道菌群培养基，于37℃、溶氧量为20％下以35mL/h的流速向恒化器中连续地流进新鲜的无菌肠道菌群培养基并连续地流出恒化器中的培养液，进而运行恒化器。

(2)在恒化器运行24h时，向恒化器中接种20mL、浓度为0.2g/mL的粪便悬液，恒化培养2天，粪便悬液中的肠道菌群在恒化器中达到稳态，以接种量为10⁷cfu/mL向恒化器中接种双歧杆菌，其中，无菌肠道菌群培养基包括5g/L 的淀粉、3.0g/L的牛乳酪蛋白、3.0g/L的蛋白胨、6.0g/L的果胶、0.6g/L的木聚糖、0.6g/L的阿拉伯半乳糖、0.6g/L的支链淀粉、0.4g/L的L-半肤氨酸、0.01g/L 的氯化血红素、0.25g/L的胆固醇(0.25)、0.25g/L的鹅去氧胆酸、0.25g/L的胆酸 2.0g/L的KH2PO4、10.0g/L的NaHCO3、4.5g/L的NaCl、0.5g/L的MgSO4·7H2O 及0.45g/L的CaC12·2H2O。分别在接种双歧杆菌后第7天、接种双歧杆菌后第 14天取流出的培养基，通过实时荧光定量PCR扩增反应测定流出的培养基中的双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌的含量。

测试

1、由细菌标准品建立的标准曲线

按照操作手册用细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302，TIANGEN)提取每种细菌标准品的新鲜菌体中的基因组DNA，得到相应的基因组DNA提取液，取10μL的基因组DNA液(基因组DNA的浓度为500ug/mL)加入90μL的1×TE 缓冲液中，进行连续9个10倍的梯度稀释，形成9个基因组DNA浓度梯度。

以稀释后的细菌标准品为模板，使用实时荧光定量PCR SYBR Green Realtime PCR Master Mix(SIGMA-ALDRICH)对梯度稀释后的细菌标准品进行定量分析。实时荧光定量PCR反应体系如表1所示。

表1：实时荧光定量PCR的反应体系

其中，双歧杆菌的正向引物的碱基序列为5’-GGGTGGTAATGCCGGATG-3’ (SEQ ID No.1所示)，双歧杆菌的反向引物的碱基序列为 5’-TAAGCGATGGACTTTCACACC-3’(SEQ ID No.2所示)。

乳杆菌的正向引物的碱基序列为5’-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3’(SEQ ID No.3所示)，乳杆菌的反向引物的碱基序列为5’-CACCGCTACACATGGAG-3’ (SEQ ID No.4所示)。

肠杆菌的正向引物的碱基序列为5’-GTTAATACCTTTGCTCATTGA-3’(SEQ ID No.5所示)，肠杆菌的反向引物的碱基序列为 5’-ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’(如SEQ ID No.6所示)。

肠球菌的正向引物的碱基序列为5’-CCCTTATTGTTAGTTGCCATCATT-3’ (SEQ ID No.7所示)，肠球菌的反向引物的碱基序列为 5’-ACTCGTTGTACTTCCCATTGT-3’(SEQ ID No.8所示)。

实时荧光定量PCR反应条件如表2所示。

表2：实时荧光定量PCR反应条件

按照表1的实时荧光定量PCR的反应体系配制反应体系，并根据表2的反应条件对每个DNA浓度的细菌标准品的基因组DNA进行实时荧光定量PCR反应，并实时检测荧光亮度，获得对应的扩增溶解曲线，如图1～4所示。且分别获得每个DNA浓度的细菌标准品的基因组DNA的实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，以每种细菌标准品的基因组DNA的浓度的对数为横坐标，以相应的实时荧光定量PCR扩增反应的CT值为纵坐标，作图得到相应的标准曲线(图 5～8所示)，并得到标准曲线方程。其中，双歧杆菌的标准曲线方程为 Y＝-3.3124x+37.032，R²＝0.9954。乳杆菌的标准曲线方程为Y＝-3.4617x+33.899， R²＝0.9982。肠杆菌的标准曲线方程为Y＝-3.3229x+38.478，R²＝0.9967。肠球菌的标准曲线方程为Y＝-3.4414x+35.612，R²＝0.9978。

2、用实时荧光定量PCR测定实施例1～6的粪便中的微生物的含量

按照操作手册用QIAarnp DNAStool Mini Kit(QIAGEN，德国)提取实施例1～6的粪便中的细菌基因组DNA。按照表1的实时荧光定量PCR的反应体系配制反应体系，并根据表2的反应条件进行实时荧光定量PCR反应，获得每种粪便中每种肠道菌群的PCR扩增反应对应的CT值，将每种肠道菌群的CT值带入相应的标准曲线方程中，计算得到该种肠道菌群的含量的对数(CFU/g湿粪便)，并按照公式(1)计算实施例1～6的粪便的F值，公式(1)如下：

其中，a表示粪便中双歧杆菌的含量，b表示粪便中乳杆菌的含量，c表示粪便中肠杆菌的含量，d表示粪便中肠球菌的含量。实施例1～3的检测结果详见表3。实施例4的检测结果详见表4，实施例5～6的检测结果详见表5。其中，表1～5中的数据均为每组的动物模型的相应的测试结果的平均数，表示为平均值±方差。使用SPSS 13.0数据分析软件作统计分析，p>0.05表示差异不显著； p<0.05表示差异显著；p<0.01表示差异极显著。

表3：实施例1～3的动物模型的粪便中肠道菌群的含量的对数(CFU/g湿粪便)及F值

由表3可以看出，实施例1～3的动物模型的粪便中均含有四种肠道菌群，且实施例1～3的无菌动物在灌胃后的第7～21天中各肠道菌群的含量及F均无明显变化，说明实施例1～3的方法均成功构建具有稳定的肠道菌群的动物模型，同时，实施例1～3的动物模型的粪便内各肠道菌群的含量且F均相当，无明显差异，说明实施例1～3的动物模型之间无明显差异，进而说明本实施方式的具有稳定的肠道菌群的动物模型的构建方法能够成功构建动物模型。

表4：实施例4的动物模型的粪便中肠道菌群的含量的对数(CFU/g湿粪便) 及F值

表4中，a表示的是2～6号与1号相比p<0.05，b表示的是2～6号与1号相比p<0.01

由表4可以看出，与仅给动物模型饲喂无菌饲料相比，给动物模型饲喂双歧杆菌、乳酸菌、嗜酸乳杆菌及丁酸梭菌的第7天和第14天，动物模型体内的双歧杆菌及乳杆菌的含量均有明显的增加(p<0.05)，而肠杆菌和肠球菌的含量均有明显的降低(p>0.05)；同时，与仅给动物模型饲喂无菌饲料相比，给动物模型饲喂双歧杆菌、乳酸菌、嗜酸乳杆菌及丁酸梭菌的F值与仅给动物模型饲喂无菌饲料的F值的差值均大于0，说明双歧杆菌、乳酸菌、嗜酸乳杆菌及丁酸梭菌均能够促进肠道中双歧杆菌和乳杆菌的增殖，且抑制肠道中肠杆菌和肠球菌的增殖，促进肠道菌群的稳定。

与仅给动物模型饲喂无菌饲料相比，给动物模型饲喂产气荚膜梭菌的第7 天和第14天，动物模型体内的双歧杆菌及乳杆菌的含量均有明显的降低 (p>0.05)，而肠杆菌和肠球菌的含量均有明显的增加(p>0.05)；同时，与仅给动物模型饲喂无菌饲料相比，给动物模型饲喂产气荚膜梭菌菌的F值与仅给动物模型饲喂无菌饲料的F值的差值均大于0，说明产气荚膜梭菌抑制肠道中的双歧杆菌和乳杆菌的增殖，且使肠道中肠杆菌和肠球菌大量增殖，不利于肠道菌群的稳定。

表5：实施例5的动物模型的粪便及实施例6的恒化培养的流出培养液中肠道菌群的含量的对数(CFU/g湿粪便)及F值

由表5可以看出，在第7天和第14天，2#和4#的动物模型的四种肠道菌群的含量和F均相当，说明第一饲料和第二饲料对动物模型的肠道菌群无影响。

在第7天和第14天，3#的动物模型的F优于和1#的动物模型的F，同时，在第7天和第14天，1#的动物模型的肠道菌群的F与2#的动物模型的肠道菌群的F之差约为0.19，3#的动物模型的肠道菌群的F与4#的动物模型的肠道菌群的F之差约为0.28，说明第一饲料更有利于双歧杆菌发挥促进肠道菌群稳定的作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳市百澳飞生物技术有限公司

<120> 微生物对肠道菌群的影响的评估方法及具有稳定的肠道菌群的动物模型的构建方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA