本发明属于检测生物技术领域，具体涉及一种产黄曲霉毒素(AF)、赭曲霉毒素(OTA)和展青霉素(PAT)真菌的同步检测试剂盒。
背景技术：
AF、OTA及PAT会破坏机体正常机能甚至致癌，是当前国内外最受关注、危害最为严重的生物毒素。青霉属和曲霉属真菌是上述3类毒素的主要产生菌，其中多个种，如黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)、赭曲霉(A.ochraceus)、炭黑曲霉(A.carbonarius)、棒曲霉(A.clavatus)、展青霉(Penicillium expansum)和灰黄青霉(P.griseofulvum)等在次生代谢过程中产毒，随谷物、饲料、食品等进入人畜食物链，造成巨大经济损失、严重威胁健康。
对于AF、OTA和PAT本身，国内外已形成成熟的控制及检测规范，而对其源头-产毒真菌本身的检测关注有限，方法开发及应用远远落后于其代谢物。受毒素提取效率、检测方法灵敏度的限制，针对毒素本身的检测方法仅在毒素累积至一定浓度的情况下方可检出，其检测结果仅可作为事后处理提供技术支持，无法实质性挽回经济损失、降低其健康危害；而靶向于产毒病原的检测方法则可在毒素合成早期甚至未合成前评判样品受真菌毒素污染的风险，实现事前干预，最大程度减轻其可能造成的不良后果。因青霉菌和曲霉菌不同种间、菌株间产毒素种类及能力差异大，对产毒株的快速准确鉴定对预测其产毒潜力并有效预防毒素污染可能引发的经济损失及健康危害至关重要。
当前我国对产毒真菌鉴定仍主要依赖形态学分析(如GB 4789.16-2016食品安全国家标准食品微生物学检验常见产毒霉菌的形态学鉴定；SN/T 1035-2011进出口食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测方法)，操作冗繁、耗时费力、易因近缘种间的形态相似性而导致误判，且方法仅限于对可能产毒的真菌进行分类鉴定至种单元，而未实质性探究其是否产毒，靶向性不强。而特异性靶向毒素生物合成必须基因而建立的PCR鉴定法则可有效克服上述缺陷，同时其指数倍增能力更有力保障了方法的高灵敏度，为有效地提高真菌毒素危害预警能力、保证事前干预、降低危害提供良好的技术支撑。
到目前为止，国内外仅西班牙埃斯特雷马杜拉大学Córdoba带领的团队在2013年报道了一种同步检测食品中上述三类毒素产生菌的多重PCR体系(LUQUE MI，ANDRADE MJ，RODRIGUEZ A，et al.Development of a multiplex PCR method for the detection of Patulin-，Ochratoxin A-and Aflatoxin-producing moulds in foods[J].Food Analytical Methods，2013，6(4)：1113-1121.)，经反复验证发现存在如下缺陷：其体系中未设计内参基因，无法排除因样品DNA质量不佳或PCR体系不合适造成的可能假阴性结果；经比对NCBI中可获得的真菌idh基因序列，序列同源性有限，需设计兼并引物方可有效覆盖不同种属产毒菌；所用omt引物在其他非产毒菌DNA中易产生非特异性扩增片段。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种产黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和展青霉素真菌的同步检测试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种产黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和展青霉素真菌的同步检测试剂盒，基于多重PCR检测方法，包括能在同一反应管中进行PCR反应的第一引物对、第二引物对、第三引物对和内标引物对，其中，
第一引物对用以扩增黄曲霉毒素合成正向调节基因aflR，包括alfR-775-F和alfR-775-R，分别包括如SEQ ID NO 01和SEQ ID NO 02所示的序列；
第二引物对用以扩增赭曲霉毒素合成必需的核糖体肽合酶基因ps，包括ps-343-F和ps-343-R，分别包括如SEQ ID NO 03和SEQ ID NO 04所示的序列；
第三引物对用以扩增展青霉素合成必需的异环氧菌素脱氢酶基因idh，包括idh-649-F和idh-649-R，分别包括如SEQ ID NO 05和SEQ ID NO 06所示的序列
内标引物对用以扩增真菌通用分子识别序列，该真菌通用分子识别序列为内部转录间区序列ITS，包括ITS-600-F和ITS-600-R，分别包括如SEQ ID NO 07和SEQ ID NO 08所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述alfR-775-F和alfR-775-R分别如SEQ ID NO 01和SEQ ID NO 02所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述ps-343-F和ps-343-R分别如SEQ ID NO 03和SEQ ID NO 04所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述idh-649-F和idh-649-R分别如SEQ ID NO 05和SEQ ID NO 06所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述ITS-600-F和ITS-600-R分别如SEQ ID NO 07和SEQ ID NO 08所示。
进一步优选的，其DNA模板包括阳性对照、阴性对照和空白对照，其中阳性对照为黄曲霉CGMCC 3.4408、赭曲霉CGMCC 3.4411和棒曲霉CGMCC 3.6890的等量DNA混合物，阴性对照为禾谷镰刀菌ATCC 46779的DNA，空白对照为水。
进一步优选的，其扩增体系的总体积为20～30μL，包括DNA模板45～55ng、第一引物对各0.25～0.35μM、第二引物对各0.18～0.22μM、第三引物对各0.25～0.35μM、内标引物对各0.06～0.07μM、dNTPs 0.4～0.6mM、MgCl2 2.2～2.6mM、不含Mg2+的1×聚合酶缓冲液和1.2～1.3U Taq酶。
更进一步优选的，其扩增体系的总体积为25μL，包括DNA模板50ng、第一引物对各0.3μM、第二引物对各0.2μM、第三引物对各0.3μM、内标引物对各0.066μM、dNTPs 0.5mM、MgCl2 2.5mM、不含Mg2+的1×聚合酶缓冲液和1.25U Taq酶。
进一步优选的，其热循环条件如下：94℃预变性4.5～5.5min；94℃变性28～32s，60℃退火28～32s，72℃延伸48～52s，循环30～40次；最后72℃再延伸6.5～7.5min。
更进一步优选的，其热循环条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，循环35次；最后72℃再延伸7min。
本发明的有益效果是：
1、相对于针对毒素本身的检测方法，本发明靶向于毒素产生菌鉴定的方法可在毒素未形成或微量累积时，即可判定样品中产毒真菌存在与否，为谷物及其制品受毒素污染的风险提供早期预警，便于相关部门采取前置化干预，采取有效措施防控毒素危害的产生，切实减轻其危害。
2、与基于形态学鉴别的传统方法及单重PCR扩增检测法相比，本发明无需冗繁的培养基配置、载玻片小培养、形态观察等步骤，一步检测排查3类毒素，可节约3～4d的时间及大量人力成本。
3、本发明的检测体系直接靶向毒素合成必需基因，特异性强；同步扩增内参基因，同时设置阳性、阴性及空白对照，有效避免假阴性及假阳性；PCR指数倍增保障了方法灵敏度。
附图说明
图1为本发明实施例1中的黄曲霉毒素HPLC测定结果图，其中，(1)为黄曲霉毒素混标(B1、B2、G1、G2和M1各20μg/L)，(2)为稀释500倍的黄曲霉CGMCC 3.4408提取液。
图2为本发明实施例1中的赭曲霉毒素A(OTA)HPLC测定结果图，其中，(1)为OTA标液(10μg/L)，(2)为赭曲霉CGMCC 3.4411提取液。
图3为本发明实施例1中的展青霉素(PAT)的HPLC测定结果图，其中，(1)为PAT标液(20μg/L)，(2)为棒曲霉CGMCC 3.6890提取液。
图4为本发明实施例1的同步检测产黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和展青霉素的多重PCR电泳结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
1、真菌基因组的提取
以经HPLC证实产毒阳性菌(AF产生菌黄曲霉CGMCC 3.4408、OTA产生菌赭曲霉CGMCC 3.4411和PAT产生菌棒曲霉CGMCC 3.6890，如图1至图3所示)作为阳性对照；不产上述三类毒素的菌株(禾谷镰刀菌ATCC 46779)作为阴性对照。
将上述各菌株斜面工作菌(孢子或菌丝)接种于表面贴有玻璃纸的PDA平板上，25℃培养3-4d，待菌丝布满培养皿且未产孢时收获菌丝，参照如下方法提取DNA：称取0.2g菌丝置于预冷研钵中，液氮研磨至粉末。而后加入4mL DNA提取液[0.2M Tris·HCl(pH 7.5)，0.5M NaCl，10mM EDTA，1％SDS(w/v)]，继续研磨后转移至离心管，冰浴3～5min。加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液，剧烈震荡3min，4℃下1840g离心10min。吸取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)混合液，颠倒混匀后于4℃下1840g离心10min。吸取上清液，加入1/10体积3M NaAC缓冲液(pH5.3)和2.5倍体积乙醇，混匀后在20℃下沉淀1h。继之，4℃下9300g离心10min，弃上清后再用0.5mL 75％乙醇洗涤沉淀，再4℃下9300g离心5min。自然干燥3～5min后，加入0.6mL无菌水溶解，再加入2μL RNAase，在37℃下保温15min。重复一轮酚/氯仿抽提，最后用0.1mL无菌水溶解DNA。
2、多重PCR体系的建立
以上述DNA为模板、如下4对引物(第一引物对、第二引物对、第三引物对和内标引物对)为特异性引物进行检测。
第一引物对，即黄曲霉毒素合成正向调节基因aflR引物对序列为：
alfR-775-F：5′-GCAAAGCACCCTGTCTTCCCTAAC-3′(SEQ ID NO 01)
alfR-775-R：5′-GAGATTTGCTTCGAGGCCACTAAA-3′(SEQ ID NO 02)
第二引物对，即赭曲霉毒素合成必需的核糖体肽合酶基因ps引物对序列为：
ps-343-F：5′-CGGAGACTGGTCTTACTTTGA-3′(SEQ ID NO 03)
ps-343-R：5′-CAACAGGGCTGTTTGGAATCT-3′(SEQ ID NO 04)
第三引物对，即青霉素合成必需的异环氧菌素脱氢酶基因idh引物对序列为：
idh-649-F：5′-GGYATGGGWGARGCRATGGT-3′(SEQ ID NO 05)
idh-649-R：5′-TCGCTGYTCCTCYACCCA-3′(SEQ ID NO 06)
内标引物对，即真菌通用分子识别序列一内部转录间区序列ITS引物对序列为：
ITS-600-F：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′(SEQ ID NO 07)
ITS-600-R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(SEQ ID NO 08)
扩增体系总体积为25μL，具体包括：DNA模板50ng(阳性对照为黄曲霉CGMCC 3.4408、赭曲霉CGMCC 3.4411和棒曲霉CGMCC 3.6890的等量DNA混合液，阴性对照为禾谷镰刀菌ATCC 46779，空白对照为水)、0.3μM alfR-775-F&R、0.3μM idh-649-F&R、0.2μM ps-343-F&R、0.066μM ITS-600-F&R、0.5mM dNTP、2.5mM MgCl2、1×taq聚合酶缓冲液(不含Mg2+)和1.25U taq聚合酶。
热循环条件为：94℃预变性5min，此后进入35个循环(94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s)，最后72℃再延伸7min。
PCR结束后，取5μL样液、上样缓冲液和SYBR Green I染液混匀后，以2％琼脂糖凝胶进行电泳(90V，1.5h)，于凝胶成像仪拍照。结果如图4所示，其中M表示100bp ladder Marker，各条带大小依次为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp及100bp；1～4-黄曲霉、赭曲霉、棒曲霉及其混合DNA为模板分别以引物对aflR-775-F&R、ps-343-F&R、idh-649-F&R和ITS-600-F&R各自单重扩增；5-三种菌DNA混合物为模板、4对引物同步多重扩增；6～7-非产毒株禾谷镰刀菌DNA和无菌水为模板、4对引物同步多重扩增。
可见，本发明所采用的3类毒素代表性产毒株所提取DNA以特异性引物扩增，不论在单重或是多重扩增体系中均能产生预期大小目的片段(毒素基因和ITS基因)。而以非产毒株禾谷镰刀菌DNA为模板时则不显现任何毒素基因的扩增，仅可获得ITS片段；以无菌水替代上述模板时则未获得任何扩增产物，表明本发明所建立的多重PCR扩增体系可用于产黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和展青霉素真菌的同步检测。
3、多重PCR检测体系在模拟染菌样品检测中的应用
以产毒阳性菌分别污染玉米粉(5份)、花生碎(5份)和面粉(6份)样品，制备人工染菌样品，经DNA提取后，以上述优化的多重PCR检测体系及热循环条件进行扩增，在16份受检样品中，本发明所提供的多重PCR法检出7份、5份和8份黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和展青霉素产生菌阳性样品，与预期结果完全吻合。
上述结果表明，本发明所提供的用于同步检测黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和展青霉素产生菌的4重PCR检测用试剂盒及检测方法具有良好的特异性和实用性，操作便捷、耗时短，具有广泛的市场推广应用前景。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门市产品质量监督检验院（国家半导体发光器件应用产品质量监督检验中心、国家场（厂）内机动车辆质量监督检验中心）
<120> 一种产黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和展青霉素真菌的同步检测试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gcaaagcacc ctgtcttccc taac 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gagatttgct tcgaggccac taaa 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
cggagactgg tcttactttg a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
caacagggct gtttggaatc t 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
ggyatgggwg argcratggt 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
tcgctgytcc tcyaccca 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
tcctccgctt attgatatgc 20