本发明属于生物质能领域，特别涉及一种利用酵母菌发酵玉米芯生产生物柴油的方法及其制成的生物柴油。
背景技术：
当前，全球面临着石油能源短缺这个巨大的挑战。许多国家都在积极找寻一种有效的、可再生的能源来满足人类对能源日益增长的需求。生物柴油作为可再生的、清洁的、替代性生物质液体燃料之一，它的开发及应用对实现循环经济和绿色GDP，实现社会经济可持续性发展将会产生巨大的影响。但目前生产生物柴油的方法主要是利用动植物油脂转化。动植物因受多种因素的影响，油脂产量不稳定，且生长周期漫长，需要大量的劳动力，经济成本较高。而采用油脚、餐饮业废油脂等来生产生物柴油，对于整个社会的需求量来说可谓杯水车薪，不能从根本上解决问题。要大力发展生物柴油，就必须寻找一条有效的新途径。
微生物油脂又称为单细胞油脂，是指由微生物在一定条件下合成并储存在菌体内的甘油脂，其脂肪酸组成与一般的植物油脂相似，主要是C16、C18系脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚麻酸等通过微生物油脂这一新的油脂资源的开发和研究，是最有希望的途径之一。而产油微生物，因其具有油脂含量高、脂肪酸组成与植物油相似，且不受季节、气候及场地影响，可连续生产等优势，逐渐取代植物油脂成为生物柴油的新来源。产油微生物中酵母菌油脂脂肪酸组成与植物相似，且含量高，被看做未来生物柴油的重要来源。
玉米芯、玉米秸秆约占农作物秸秆的40％，产量大、来源广、价格低廉，而且含有大量的木质纤维素，具有很大的开发利用潜力。但目前玉米秸秆的利用率还很低，主要用途是秸秆还田和作粗饲料，但用作秸秆还田和牲畜粗饲料的总和还不足秸秆总量的，其余被焚烧掉了，造成了极大的资源浪费和环境污染。如果能利用微生物发酵玉米秸秆生产微生物油脂而获得生物柴油，不但可以避免大量的玉米秸秆直接遭到焚烧而造成环境污染，同时又可以开辟一条清洁能源再生途径解决当今面临的能源危机。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种利用酵母菌发酵玉米芯生产生物柴油的方法；该方法通过利用高产油脂的酵母菌发酵玉米芯生产微生物油以获得生物柴油，不仅达到了废物利用，保护环境的目的，且可降低生产成本，为实现大规模生产生物柴油奠定基础。
本发明的另一目的在于提供一种上述方法制成的生物柴油。
本发明的目的通过下述技术方案来实现：
一种利用酵母菌发酵玉米芯生产生物柴油的方法，该方法包括以下具体步骤：
S1.将玉米芯切割粉碎至30-40目，称取100g玉米芯粉末，再加入1ml质量浓度为0.5％～1.5％的稀盐酸进行预处理，加入蒸馏水来调整混合物的pH值至5.0～5.5；
S2.向步骤S1所得混合液中加入MgCl2、吐温、纤维素酶和木聚糖酶液，得到玉米芯混合液；
S3.对玉米芯混合液进行糖化，糖化后，用普通滤纸过滤糖化液，取滤液灭菌后得到玉米芯糖化液，备用；
S4.将低温保存的产油油脂酵母菌种接于固体斜面培养基上，于32℃培养72h，得活化菌种；
S5.将上述活化菌种接入液体种子培养基中，于25℃～35℃、140r/min摇床培养18～24h，得酵母菌液体种子；
S6.将上述所得酵母菌液体种子转接到玉米芯糖化液中进行产脂发酵培养，接种量为玉米芯糖化液质量的5％～15％；
S7.采用酸热有机溶剂法提取上述酵母菌液体种子经发酵培养所得的发酵液中的胞内油脂；
S8.将上述萃取所得的微生物油脂作为原料，进一步采用酯交换法制备生物柴油。
步骤S1中所述预处理是在121℃条件下预处理60min；所述蒸馏水和经过预处理的玉米芯粉末的液固质量比为10:1。
步骤S2中所述MgCl2在玉米芯混合液中的浓度为2.5nmol/L，所述吐温80的加入量是按照每升玉米芯混合液加1.5ml吐温80；所述纤维素酶的加入量是按照每100g玉米芯混合液加2.5g纤维素酶；所述木聚糖酶液的加入量是按照每100g玉米芯混合液加2ml木聚糖酶液；所述纤维素酶酶活为1.76×106u/ml；所述木聚糖酶液酶活为2.07×106u/ml。
步骤S3中所述玉米芯混合液是在温度为50～55℃的条件下糖化48h；所述滤液是在121℃温度条件下灭菌20min后备用。
步骤S4中所述酵母菌种为茁芽丝孢酵母、产油油脂酵母、皮状丝孢酵母、发酵性丝孢酵母或胶粘红酵母。
步骤S6中所述的产脂发酵培养的条件为控制转速为130～150r/min，培养温度为25℃～35℃，培养时间为3～5d。
步骤S7中所述提取具体按照以下步骤：将发酵液离心，水洗离心沉淀物三次，每克湿菌体加入10mL浓度为4mol/L的盐酸，振荡摇匀，室温放置半小时后，沸水浴10min，-20℃速冷30min；再加入体积比为1：1的甲醇与氯仿的混合液20mL振荡摇匀，4000r/min离心10min，萃取氯仿层，再重复操作两次，合并三次萃取所得的氯仿层；于105℃，真空干燥除去氯仿，烘干至恒重即得胞内油脂。
一种根据上述的方法制备得到的生物柴油；该生物柴油通过气相色谱及气一质联用技术的分析，其主要成分为十四酸甲酯、十六酸甲酯、十八碳烯酸甲酯和十八酸甲酯。
本发明所得生物柴油是酵母菌利用玉米芯糖化液为碳源、氮源发酵生产的生物柴油。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)所采用的高产油脂酵母菌生长适应性强，生长繁殖迅速，生长周期短，代谢活力强，易于培养，可方便基因工程改良；不受场地限制，不受气候、季节限制，能连续大规模生产，比农业生产油脂所需劳动力低；生长所需原材料丰富，价格便宜，如淀粉、糖类，并且微生物可利用农副产品、食品行业和造纸行业中废弃物，如乳清、糖蜜、废糖液、淀粉生产中产生的废弃物，如乳清、糖蜜、废糖液、淀粉生产中产生的废料废液、亚硫酸、纸浆、木材糖化液等；一方面可加强废物利用，另一方面又有利于环境保护。
(2)农业中的废弃物中以玉米芯为代表的含碳废弃物，含有大量的木质纤维素用利用酵母菌发酵含碳废弃物生产微生物油脂而获得生物柴油，不但可以避免大量的玉米秸秆直接遭到焚烧而造成环境污染，同时又可以开辟一条清洁能源再生途径解决当今面临的能源危机。
(3)利用微生物生产生物柴油可望大大降低其生产成本，加快生物柴油的生产，促进其广泛的应用和大规模工业化生产。关于微生物产油脂的研究对于解决我国社会经济可持续发展的能源短缺、环境恶化等问题有重要的意义。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合的方式进一步对本发明进行阐述，但不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述发明的内容作出一些非本质的改变和调整，均属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)将玉米芯切割粉碎至30目，称取100g玉米芯粉末，在加入1ml质量浓度为0.5％的稀盐酸，121℃条件下预处理60min后，加入蒸馏水并调整到pH值为5.0，蒸馏水和经过预处理的玉米芯粉末的液固质量比为10:1。向玉米芯混合物液中加入加入MgCl2、吐温、纤维素酶和木聚糖酶液，得到玉米芯混合液(MgCl2浓度为2.5nmol/L，吐温80浓度为1.5ml/L，加入纤维素酶液2.5g/100g和木聚糖酶液2ml/100g)，在50℃的条件下糖化48h，经普通滤纸过滤，取滤液灭菌后得到玉米芯糖化液，备用。
(2)将低温保存的产油油脂酵母菌种接于固体斜面培养基上，于32℃培养72h，得活化菌种；将活化菌种接入液体种子培养基中，于25℃、140r/min摇床培养18h，得酵母菌液体种子。
(3)然后将上述所得酵母菌液体种子转接到玉米芯糖化液中进行产脂发酵培养，接种量为玉米芯糖化液质量的5％。控制转速为130r/min，培养温度为25℃，培养时间为3d后，得到发酵液。
(4)采用酸热有机溶剂法提取上述酵母菌种子经发酵培养所得的发酵液中的胞内油脂：将发酵液离心，水洗离心沉淀物三次，每克湿菌体加入10mL 4mol/L的盐酸，振荡摇匀，室温放置半小时后，沸水浴10min，-20℃速冷30min。加入甲醇与氯仿的混合液20mL(体积比为1：1)振荡摇匀，4000r/min离心10min，萃取氯仿层。再加入甲醇与氯仿的混合液，重复上述步骤两次，合并三次萃取所得的氯仿层；于105℃，真空干燥除去氯仿，烘干至恒重即得微生物油脂。
(5)将上述萃取所得的微生物油脂作为原料，进一步采用酯交换法制备生物柴油。
实施例2
(1)将玉米芯切割粉碎至35目，称取100g玉米芯粉末，在加入1ml质量浓度为0.75％的稀盐酸，121℃条件下预处理60min后，加入蒸馏水并调整到pH5.4，蒸馏水和经过预处理的玉米芯粉末的液固质量比为10:1。向玉米芯混合物液中加入加入MgCl2、吐温、纤维素酶和木聚糖酶液，得到玉米芯混合液(MgCl2浓度为2.5nmol/L，吐温80浓度为1.5ml/L，加入纤维素酶液2.5g/100g和木聚糖酶液2ml/100g)，在53℃的条件下糖化48h，经普通滤纸过滤，取滤液灭菌后得到玉米芯糖化液，备用。
(2)将低温保存的产油油脂酵母菌种接于固体斜面培养基上，于32℃培养72h，得活化菌种；将活化菌种接入液体种子培养基中，于32℃、140r/min摇床培养22h，得酵母菌液体种子。
(3)然后将上述所得酵母菌液体种子转接到玉米芯糖化液中进行产脂发酵培养，接种量为玉米芯糖化液质量的10％。控制转速为140r/min，培养温度为25℃～35℃，培养时间为4d后，得到发酵液。
(4)采用酸热有机溶剂法提取上述酵母菌种子经发酵培养所得的发酵液中的胞内油脂：将发酵液离心，水洗离心沉淀物三次，每克湿菌体加入10mL 4mol/L的盐酸，振荡摇匀，室温放置半小时后，沸水浴10min，-20℃速冷30min。加入甲醇与氯仿的混合液20mL(体积比为1：1)振荡摇匀，4000r/min离心10min，萃取氯仿层。再加入甲醇与氯仿的混合液，重复上述步骤两次，合并三次萃取所得的氯仿层。于105℃，真空干燥除去氯仿，烘干至恒重即得微生物油脂。
(5)将上述萃取所得的微生物油脂作为原料，进一步采用酯交换法制备生物柴油。
实施例3
(1)将玉米芯切割粉碎至40目，称取100g玉米芯粉末，在加入1ml质量浓度为1％的稀盐酸，121℃条件下预处理60min后，加入蒸馏水并调整到pH5.5，蒸馏水和经过预处理的玉米芯粉末的液固质量比为10:1。向玉米芯混合物液中加入加入MgCl2、吐温、纤维素酶和木聚糖酶液，得到玉米芯混合液(MgCl2浓度为2.5nmol/L，吐温80浓度为1.5ml/L，加入纤维素酶液2.5g/100g和木聚糖酶液2ml/100g)，在55℃的条件下糖化48h，经普通滤纸过滤，取滤液灭菌后得到玉米芯糖化液，备用。
(2)将低温保存的产油油脂酵母菌种接于固体斜面培养基上，于32℃培养72h，得活化菌种；将活化菌种接入液体种子培养基中，于35℃、140r/min摇床培养24h，得酵母菌液体种子。
(3)然后将上述所得酵母菌液体种子转接到玉米芯糖化液中进行产脂发酵培养，接种量为玉米芯糖化液质量的15％。控制转速为150r/min，培养温度为35℃，培养时间为5d后，得到发酵液。
(4)采用酸热有机溶剂法提取上述酵母菌种子经发酵培养所得的发酵液中的胞内油脂：将发酵液离心，水洗离心沉淀物三次，每克湿菌体加入10mL 4mol/L的盐酸，振荡摇匀，室温放置半小时后，沸水浴10min，-20℃速冷30min。加入甲醇与氯仿的混合液20mL(体积比为1：1)振荡摇匀，4000r/min离心10min，萃取氯仿层。再加入甲醇与氯仿的混合液，重复上述步骤两次，合并三次萃取所得的氯仿层。于105℃，真空干燥除去氯仿，烘干至恒重即得微生物油脂。
(5)将上述萃取所得的微生物油脂作为原料，进一步采用酯交换法制备生物柴油。
实施例1-3中发酵玉米芯粉末生产的小分子糖转化率可高达到85％；酵母菌利用玉米芯糖化液进行深层发酵，生成的油脂含量可高达45％，油脂产量高达13g/L，产油转化率可达10.9％。通过本发明中制备的生物油脂的气相色谱及气一质联用技术的分析，证明其主要成分为十四酸(肉豆蔻酸)甲酯、十六酸(棕搁酸)甲酯、十八碳烯酸(油酸)甲酯和十八酸(硬脂酸)甲酯，而这些都生物柴油的主要成分。
生物柴油的主要问题是成本高，生物柴油制取实验中成本的是原料油成本。采用廉价原料及提高转化率是生物柴油能否实用化的关键。本发明中以来源丰富的农业废弃玉米芯秸秆为原料生产生物柴油，相比利用动植物油脂转化来生产生物柴油的方式，本发明能够大大地降低了原料的成本；原料来源广泛，能节约大量的劳动力，不需要占用耕地，经济成本低；避免大量的玉米芯秸秆直接遭到焚烧而造成环境污染，同时又可以开辟一条清洁能源再生途径解决当今面临的能源危机。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。