一种利拉鲁肽的合成方法与流程

本发明涉及一种多肽药物合成领域，特别涉及glp-1受体激动素一种利拉鲁肽的合成方法。

背景技术：

利拉鲁肽，英文名：liraglutide。

肽序列为：

h-his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(pal-γ-glu)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh

利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司开发的第一个长效glp-1类似物，与人胰高糖素样肽-1（glp-1）同源性达97%。利拉鲁肽具有降低血糖，促进胰岛细胞再生，轻微延长胃排空等多种作用，应用前景广泛。

cn103304660的专利文献公开了一种利拉鲁肽的合成方法，固相合成n端保护的利拉鲁肽直链肽，然后合成十六烷基衍生物，脱保护除去末端保护，得到目标多肽。该方法采用氨基酸逐个偶联的方式，随着直链肽的延长，大量的疏水性保护基团加剧了分子间的缔合作用，部分活性基团被包裹其中，工艺中产生不易除去的缺陷肽，增加投料和延长时间无法根本上解决问题。

cn102875665的专利文献公开了一种合成利拉鲁肽的方法，将利拉鲁肽分成5个片段，先合成第1至第4氨基酸、第5至第10氨基酸、第11至第16氨基酸、第17至第24氨基酸以及第25至第31氨基酸，然后5个多肽片段对接合成利拉鲁肽，缩短合成周期。虽然该方法可以同时偶联5个片段，但是5个片段均需要大量的树脂，大大提高了生产成本，并且多次的裂解在产业化增加大量的操作步骤，同时也产生过多的废液。

因此，本领域迫切需要提供一种利拉鲁肽的合成方法，以解决现有利拉鲁肽合成过程中存在的杂质多，纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，废液过量的问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有合成过程中所存在的杂质多，纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，废液过量，不利于工业化生产的问题，提供一种新的、利拉鲁肽的合成方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种利拉鲁肽的合成方法，其特点是，其步骤如下：

(1)固相合成利拉鲁肽序列的第1-4位氨基酸作为第一片段，

(2)固相合成利拉鲁肽序列的第5-31位氨基酸，脱除20位lys的侧链保护基团并偶联pal-γ-glu-otbu，作为第二片段；

(3)第一片段与第二片段液相偶联，合成全保护利拉鲁肽，经裂解沉淀，得到利拉鲁肽。

步骤(1)中，第一片段与第二片段所用的树脂优选为2-ctc树脂。

步骤(2)中，第二片段中20位lys的侧链保护基团优选为催化氢化脱除的alloc。

步骤(1)(2)中，合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂优选为dic/hobt，hbtu/hobt/diea，pybop/hobt/diea其中的一种或多种；所用的反应溶剂优选为dcm、dmf、nmp、dmso中的一种或多种组合；所使用的fmoc脱除试剂优选为v/v20%哌啶/dmf溶液。

步骤(1)(2)中，第一片段与第二片段全保护裂解试剂优选为v/v15%～25%（最优选20%）tfe/dcm或v/v0.05%～0.15%（最优选0.1%）tfa/dcm。最优选为v/v15%～25%（最优选20%）tfe/dcm。

步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂优选为dcc/hosu组合或edc·hcl/hosu组合。最优选为dcc/hosu组合

步骤(3)采用的裂解试剂优选为tfa:thioanisole:anisole:edt=90:4～6:2～4:1～3，最优选为tfa:thioanisole:anisole:edt＝90:5:3:2。

本发明所述的一种利拉鲁肽的合成方法，其进一步优选的技术方案步骤如下（下述技术方案中，各原料的量可以按照需要适当取用）：

（1）fmoc-gly-2-ctc树脂的制备：

2-ctc树脂加入到固相反应器中，加入适量dcm溶胀树脂；抽干溶剂，加入fmoc-gly-oh，diea，dmf溶液，搅拌反应；抽干溶剂，加入甲醇/dcm溶液，封闭；dcm与甲醇交替洗涤若干次；真空干燥后，得到fmoc-gly-2-ctc树脂；

（2）多肽片段1的制备：

取fmoc-gly-2-ctc树脂，加入到固相反应器中，加入dcm溶胀树脂；抽干溶剂，加入哌啶/dmf溶液，反应；抽干溶剂，加入dmf洗涤；茚检结果呈阳性；

取fmoc-glu(otbu)-oh，hobt，dic，加入dmf溶解，冰浴活化，将活化后的溶液加入到反应器中，反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入dmf洗涤；

重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入fmoc-ala-oh、boc-his(trt)-oh进行偶联反应；偶联结束后，dcm与甲醇交替洗涤，真空干燥，得到肽树脂boc-his(trt)-ala-glu(otbu)-gly-2-ctc；

将肽树脂boc-his(trt)-ala-glu(otbu)-gly-2-ctc加入到tfe/dcm中，反应；收集滤液，滤液进行真空旋干；得到boc-his(trt)-ala-glu(otbu)-gly-oh即为多肽片段1；

（3）多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的制备：

boc-his(trt)-ala-glu(otbu)-gly-oh加入到dcm溶解，加入dcc，hosu，冰浴条件下反应，tlc监测原料多肽片段1反应完全消失；反应液用纯水、饱和氯化钠溶液洗涤，过滤除去不溶物，滤液加入无水硫酸钠干燥；所得滤液即为多肽片段1-琥珀酰亚胺酯；

（4）多肽片段2的制备：

取fmoc-gly-2-ctc树脂，加入到固相反应器中，加入dcm溶胀树脂，抽干溶剂，加入哌啶/dmf溶液，反应；抽干溶剂，加入dmf洗涤；茚检结果呈阳性；

称取fmoc-arg(pbf)-oh，hobt，dic，加入dmf溶解，冰浴活化；将活化后的溶液加入到反应器中，反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入dmf洗涤；

重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(alloc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh进行偶联反应；

取四三苯基膦钯，吗啡啉，thf加入到固相反应器中，反应，dmf洗涤，茚检结果呈阳性；

取ppal-γ-glu-otbu，hobt，dic加入dmf溶解，冰浴活化5min；将活化后的溶液加入到反应器中，反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入dmf洗涤；抽干溶剂，加入哌啶/dmf溶液，反应，抽干溶剂，加入dmf洗涤；茚检结果呈阳性，dcm与甲醇交替洗涤，真空干燥，所得树脂即为肽树脂2；

将肽树脂2加入到tfe/dcm中，反应，收集滤液，滤液进行真空旋干旋干后固体即为多肽片段2；

（5）全保护肽的制备：

将多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的dcm溶液加入到多肽片段2的dcm溶液中，冰浴条件下反应，反应结束后将反应液旋干，所得产品即为利拉鲁肽的全保护肽；

（6）裂解：

配制裂解试剂为tfa:thioanisole:anisole:edt=90:5:3:2，冰浴条件下加入到全保护肽中，恢复至室温继续反应，反应结束后，加入无水乙醚沉淀，离心沉淀；干燥后所得产品即为利拉鲁肽粗肽。

与现有技术相比，本发明方法的优点是：本发明合成过程中所存在的杂质少，纯度和收率高，操作步骤简单，废液少，有利于工业化大生产，且成本低。

附图说明

图1为本发明方法的一种合成路线图；

图2为实施例10合成得到的粗肽色谱图。

具体实施方式

以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种利拉鲁肽的合成方法，其步骤如下：

(1)固相合成利拉鲁肽序列的第1-4位氨基酸作为第一片段，

(2)固相合成利拉鲁肽序列的第5-31位氨基酸，脱除20位lys的侧链保护基团并偶联pal-γ-glu-otbu，作为第二片段；

(3)第一片段与第二片段液相偶联，合成全保护利拉鲁肽，经裂解沉淀，得到利拉鲁肽。

实施例2，实施例1所述的利拉鲁肽的合成方法中：步骤(1)中，第一片段与第二片段所用的树脂为2-ctc树脂。步骤(2)中，第二片段中20位lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的alloc。步骤(1)与/或(2)中，合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为dic/hobt，hbtu/hobt/diea，pybop/hobt/diea其中的一种或多种；所用的反应溶剂为dcm、dmf、nmp、dmso中的一种或多种组合；所使用的fmoc脱除试剂为v/v15%哌啶/dmf溶液。步骤(1)与/或(2)中，第一片段、第二片段全保护裂解试剂为v/v15%%tfe/dcm或v/v0.05%tfa/dcm。步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为dcc/hosu组合或edc·hcl/hosu组合。步骤(3)采用的裂解试剂为tfa:thioanisole:anisole:edt=90:4:2:1。

实施例3，实施例1所述的利拉鲁肽的合成方法中：步骤(1)中，第一片段与第二片段所用的树脂为2-ctc树脂。步骤(2)中，第二片段中20位lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的alloc。步骤(1)与/或(2)中，合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为dic/hobt，hbtu/hobt/diea，pybop/hobt/diea其中的一种或多种；所用的反应溶剂为dcm、dmf、nmp、dmso中的一种或多种组合；所使用的fmoc脱除试剂为v/v25%哌啶/dmf溶液。步骤(1)与/或(2)中，第一片段、第二片段全保护裂解试剂为v/v25%tfe/dcm或v/v0.15%tfa/dcm。步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为dcc/hosu组合或edc·hcl/hosu组合。步骤(3)采用的裂解试剂为tfa:thioanisole:anisole:edt=90:6:4:3。

实施例4，实施例1所述的利拉鲁肽的合成方法中：步骤(1)中，第一片段与第二片段所用的树脂为2-ctc树脂。步骤(2)中，第二片段中20位lys的侧链保护基团选为催化氢化脱除的alloc。步骤(1)与(2)中，合成第一片段与第二片段的所用的缩合剂为dic/hobt，hbtu/hobt/diea，pybop/hobt/diea其中的一种或多种；所用的反应溶剂为dcm、dmf、nmp、dmso中的一种或多种组合；所使用的fmoc脱除试剂为v/v20%哌啶/dmf溶液。

步骤(1)与(2)中，第一片段、第二片段全保护裂解试剂为v/v20%tfe/dcm或v/v0.1%tfa/dcm。

步骤(3)中第一片段与第二片段液相偶联采用的缩合剂为dcc/hosu组合或edc·hcl/hosu组合。步骤(3)采用的裂解试剂为tfa:thioanisole:anisole:edt=90:5:3:2。

实施例5：fmoc-gly-2-ctc树脂的制备

称取2-ctc树脂30.4g(sub=0.66mmol/g)加入到固相反应器中，加入300mldcm溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，加入fmoc-gly-oh17.84g，diea21.0ml，160mldmf溶液，搅拌反应1.5h。抽干溶剂，加入10%甲醇/dcm溶液160ml，封闭0.5h。dcm与甲醇交替洗涤3次，每次160ml。真空干燥后，得到经紫外分光光度法测定fmoc-gly-2-ctc树脂的sub=0.56mmol/g。

实施例6：多肽片段1的制备

称取fmoc-gly-2-ctc树脂17.8g，加入到固相反应器中，加入80mldcm

溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，分别加入2次80mlv/v20%哌啶/dmf溶液，反应5min和15min。抽干溶剂，加入dmf80ml洗涤4次。茚检结果呈阳性。

称取fmoc-glu(otbu)-oh12.8g，hobt4.86g，dic5.6ml，加入dmf80ml溶解，冰浴活化5min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应1h，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂。加入dmf洗涤3次，每次80ml。

重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入fmoc-ala-oh、boc-his(trt)-oh进行偶联反应。偶联结束后，dcm与甲醇交替洗涤3次，每次180ml，真空干燥，得到肽树脂boc-his(trt)-ala-glu(otbu)-gly-2-ctc。

将肽树脂boc-his(trt)-ala-glu(otbu)-gly-2-ctc加入到250mlv/v20%tfe/dcm中，反应1h。收集滤液，滤液进行真空旋干。dcm旋蒸3次，每次加入200ml。boc-his(trt)-ala-glu(otbu)-gly-oh即为多肽片段1。

实施例7：多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的制备

boc-his(trt)-ala-glu(otbu)-gly-oh加入到200mldcm溶解，加入dcc23.0g，hosu12.0g，冰浴条件下反应3h，tlc监测原料多肽片段1反应完全消失。反应液用纯水，饱和氯化钠溶液，等体积各洗涤3次，过滤除去不溶物，滤液加入无水硫酸钠干燥。所得滤液即为多肽片段1-琥珀酰亚胺酯。

实施例8：多肽片段2的制备

称取fmoc-gly-2-ctc树脂17.8g，加入到固相反应器中，加入80mldcm

溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，分别加入2次80mlv/v20%哌啶/dmf溶液，反应5min和15min。抽干溶剂，加入dmf80ml洗涤4次。茚检结果呈阳性。

称取fmoc-arg(pbf)-oh19.5g，hobt4.86g，dic5.6ml，加入dmf80ml溶解，冰浴活化5min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应1h，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂。加入dmf洗涤3次，每次80ml。

重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(alloc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh进行偶联反应。

称取四三苯基膦钯11.6g，吗啡啉1ml，100mlthf加入到固相反应器中，反应3h，dmf洗涤3次，每次加入100ml，茚检结果呈阳性。

称取ppal-γ-glu-otbu13.3g，hobt4.86g，dic5.6ml加入dmf80ml溶解，冰浴活化5min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应3h，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂。加入dmf洗涤3次，每次80ml。

抽干溶剂，分别加入2次80mlv/v20%哌啶/dmf溶液，反应5min和15min。抽干溶剂，加入dmf80ml洗涤4次。茚检结果呈阳性。dcm与甲醇交替洗涤3次，每次80ml，真空干燥，所得树脂即为肽树脂2。

将肽树脂2加入到500mlv/v20%tfe/dcm中，反应1h。收集滤液，滤液进行真空旋干。dcm旋蒸3次，每次加入400ml。旋干后固体即为多肽片段2。

实施例9：全保护肽的制备

将100ml的多肽片段1-琥珀酰亚胺酯的dcm溶液加入到150ml多肽片段2的150mldcm溶液中，冰浴条件下反应3h。反应结束后将反应液旋干，所得产品即为利拉鲁肽的全保护肽。

实施例10：裂解

配制500ml裂解试剂为tfa:thioanisole:anisole:edt=90:5:3:2，冰浴条件下加入到全保护肽中，0.5h后恢复至室温继续反应2.5h，反应结束后，加入无水乙醚沉淀。离心沉淀3次，每次加入乙醚3l。干燥后所得产品即为利拉鲁肽粗肽，粗肽得到41g，粗肽经对照品定量为33.8g，总收率90%，纯度92.0%。

上述的合成路线参照图1，合成得到的粗肽色谱图参照图2。