一种水稻锌指蛋白及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体而言，涉及一种水稻锌指蛋白及其编码基因和应用。
背景技术：
：水稻是世界上最重要的粮食作物，为全球一半的人口提供粮食。水稻对温度敏感，低温严重影响其生长和产量。水稻整个生长季的每个阶段都有可能发生低温冷害。根据低温对水稻的影响机理，可将冷害分为延迟型冷害、障碍型冷害和混合型冷害3种类型：延迟型冷害是指水稻营养生长期内受到较长时间的持续性低温影响，导致幼苗生长发育迟缓、株高和分蘖数减少(iba等，2002；tian等，2011)。障碍型冷害是指水稻生殖生长期内的短期异常低温导致抽穗延迟、穗部不全、花粉不育、籽粒灌浆不良、结实率降低，最终导致减产(zhang等，2011；pan等，2015)。低温冷害经常发生在高纬度温带地区与热带和亚热带高海拔地区，在日本、中国、朝鲜等国家尤为突出。我国东北三省、韩国北部和日本北海道等地区平均3-4年就发生一次较大的冷害，小的冷害频繁发生(季芝娟，2009)。东北稻作区是我国最大的优质米生产地，然而冷害发生频率高，受害面积大，严重影响水稻生产。因此，培育耐冷性水稻品种，对高产、稳产以及优质米生产具有非常重要的意义。随着分子生物学和基因组学的发展，现代生物技术已经广泛应用于水稻等粮食作物的遗传改良。水稻耐冷性是复杂性状，通过生物技术手段可以揭示耐冷性相关基因及分子机理。转录因子在植物的胁迫应答中发挥至关重要的作用，在植物的基因工程改良中也得到了人们的重视。在我国水稻生产中最严重的低温灾害是在孕穗期遭遇到的障碍型冷害。耐冷性鉴定评价可在自然低温条件和人工控制水温的恒温冷水灌溉条件下进行。花粉育性和种子结实率是孕穗期耐冷性评价的重要指标(dai等，2002；zhang等，2017)。因此，缺少一种能够提高水稻耐冷性的生物技术手段。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种水稻锌指蛋白，其能够提高水稻生殖生长期的耐冷性，并参与水稻低温胁迫调控过程。本发明的另一目的在于提供一种水稻锌指蛋白基因osctzfp8，其能够编码上述水稻锌指蛋白的基因。本发明的另一目的在于提供含有上述水稻锌指蛋白基因osctzfp8的载体。本发明的另一目的在于提供含有上述载体的重组细胞。本发明的另一目的在于提供上述水稻锌指蛋白基因osctzfp8或载体或重组细胞在提高水稻耐冷性中的应用。本发明的另一目的在于提供一种用于检测上述水稻锌指蛋白基因osctzfp8的引物或探针。本发明是这样实现的：本发明提供的一种水稻锌指蛋白，其氨基酸序列如seqidno:1所示。本发明还涉及一种水稻锌指蛋白基因osctzfp8，其编码如权利要求1所述的水稻锌指蛋白。本发明还涉及一种用于检测上述水稻锌指蛋白基因osctzfp8的引物或探针。本发明还涉及含有上述水稻锌指蛋白基因osctzfp8的载体。本发明还涉及含有上述载体的重组细胞。本发明还涉及上述水稻锌指蛋白或水稻锌指蛋白基因osctzfp8或载体或重组细胞在提高水稻耐冷性中的应用。通过水稻锌脂蛋白基因osctzfp8可以编码形成水稻锌脂蛋白，其能够提高水稻的耐冷性，在实际应用中具有显著价值。并且通过该水稻锌脂蛋白基因osctzfp8的过量表达可进行作物遗传改良，培育出耐冷性转基因作物。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为水稻锌指蛋白基因osctzfp8的基因结构图；图2为水稻锌指蛋白基因osctzfp8编码的水稻锌指蛋白的蛋白同源序列比对分析图；图3为水稻锌指蛋白基因osctzfp8的系统发生树分析图；图4为水稻锌指蛋白基因osctzfp8的非生物诱导分析图；图5为水稻锌指蛋白基因osctzfp8构建pubi-osctzfp8载体的部分结构示意图；图6为农杆菌介导法将植物表达载体导入到水稻的组织培养过程图；图7为t0代转基因植株的bar基因的pcr检测的检测结果；图8为水稻锌指蛋白基因osctzfp8过量表达株系的southernblot分析图；图9为水稻锌指蛋白基因osctzfp8过量表达株系的mrna表达量检测结果；图10为basta抗性分离比鉴定的示意图；图11为冷胁迫下水稻锌指蛋白基因osctzfp8过量表达株系的花粉育性鉴定图；图12为水稻锌指蛋白基因osctzfp8过量表达株系的可育花粉率的检测结果图；图13为收获期正常条件和冷水条件下，过量表达株系和对照品种的种子结实情况对比图；图14为收获期正常条件和冷水条件下，过量表达株系和对照品种的种子结实率对比图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明方式的一种水稻锌指蛋白及其编码基因和应用进行具体说明。本发明的一些实施方式提供了一种水稻锌指蛋白，其氨基酸序列如seqidno:1所示。锌脂蛋白是一类具有指状结构域的转录因子，主要通过dna、rna的结合域与其它蛋白质的相互作用调控目的基因的表达。水稻作为重要的粮食作物和模式植物，其锌指蛋白转录因子调控非生物胁迫的分子机理研究还处于起步阶段，本发明的实施方式中从水稻中分离了一种新型的锌指蛋白基因osctzfp8，并鉴定其生物学功能。该锌指蛋白基因osctzfp8过量表达转基因株系能够显著提高生殖生长期耐冷性，因此，通过该基因编码得到的水稻锌指蛋白能够参与水稻低温胁迫调控过程，提高水稻生殖生长期的耐冷性。本发明的一些实施方式还提供了一种水稻锌指蛋白基因osctzfp8，其编码上述的水稻锌指蛋白。本发明的一些实施方式中，水稻锌指蛋白基因osctzfp8的核苷酸序列如seqidno:2所示。该水稻锌脂蛋白基因osctzfp8能够通过编码在水稻内形成水稻锌指蛋白进行过表达来提高水稻的耐冷性，在实际应用中具有显著价值。因此，可以通过该基因的过量表达可进行作物遗传改良，培育出耐冷性转基因作物。本发明的一些实施方式中，水稻锌脂蛋白基因osctzfp8通过以下方式进行分离得到：利用水稻重组自交系在多个环境条件下鉴定孕穗期耐冷性，并在第8号染色体短臂上定位了一个主效qtl，通过精细定位把目标qtl定位在99.4kb的目标区段(未公开内容)，从目标区域候选基因中筛选出与耐冷性密切相关的、生物学功能未知的一个锌指蛋白基因，并命名为osctzfp8(oryzasativacoldtolerancezincfingerproteininchromosome8)。经生物信息学分析，由水稻锌脂蛋白基因osctzfp8编码得到的水稻锌脂蛋白由225个氨基酸组成，分子量为23.7kd、等电点为10.5。进一步分析水稻锌脂蛋白基因osctzfp8的基因结构发现，该基因含有两个外显子和一个内含子，第二个外显子区域含有一个c2h2型锌指结构域(http://www.prosite.expasy.org)，其结构如图1所示，图1表示的水稻锌脂蛋白基因osctzfp8的基因结构图中，白色方框表示外显子，黑色连接线表示内含子，黑色方框表示c2h2锌脂蛋白功能结构域。本发明的一些实施方式还提供了一种用于检测上述的水稻锌指蛋白基因osctzfp8的引物或探针。根据一些实施方式，引物包括核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示的引物对，探针包括核苷酸序列如seqidno:5和seqidno:6所示的探针。本发明的一些实施方式还提供了含有上述的水稻锌指蛋白基因osctzfp8的载体。本发明的一些实施方式还提供了上述载体的构建方法，其包括：利用superscriptiiireversetranscriptase(invitrogen，carlsbad，usa)，将1μg总rna反转录成cdna，获得水稻锌指蛋白基因osctzfp8的全长cdna，连接到p3300-ubi载体，构建pubi::osctzfp8植物表达载体。本发明的一些实施方式还提供了含有上述的载体的重组细胞。本发明的一些实施方式还涉及上述的水稻锌指蛋白或水稻锌指蛋白基因osctzfp8或含有水稻锌指蛋白基因osctzfp8的载体或含有上述载体的重组细胞在提高水稻耐冷性中的应用。根据一些实施方式，水稻耐冷性是水稻生殖生长期的耐冷性。一些实施方式中，耐冷性对应的温度为10～20℃，优选13～20℃，更优选16～20℃。根据一些实施方式，上述应用主要为通过农杆菌介导的遗传转化法，将含有水稻锌指蛋白基因osctzfp8的载体转化到水稻种子中，例如，可以将上述pubi::osctzfp8植物表达载体转化到粳稻品种kitaake中。根据一些实施方式，通过农杆菌介导的遗传转化法，将含有水稻锌指蛋白基因osctzfp8的载体转化到水稻种子中的具体的方法为：去掉颖壳的水稻种子经过消毒后诱导愈伤组织、继代培养，利用携带含有水稻锌指蛋白基因osctzfp8的载体的农杆菌菌株eha105箘液侵染愈伤组织，经过basta抗性筛选、分化、生根，最终移栽获得转基因独立转化植株。例如，含有水稻锌指蛋白基因osctzfp8的载体可以选用上述pubi::osctzfp8植物表达载体。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1水稻锌指蛋白基因osctzfp8的分离及序列分析1.1利用水稻重组自交系在多个环境条件下鉴定孕穗期耐冷性，并在第8号染色体短臂上定位了一个主效qtl，通过精细定位把目标qtl定位在99.4kb的目标区段，从目标区域候选基因中筛选出与耐冷性密切相关的、生物学功能未知的锌指蛋白基因osctzfp8，其碱基序列如seqidno.2所示。1.2利用ncbi多重序列比对工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi)，以水稻锌指蛋白基因osctzfp8编码的水稻锌指蛋白(其氨基酸序列如seqidno.1所示)的全长氨基酸序列作为query进行blastp，检索植物中的同源蛋白，进行多重序列比对。比对结果如图2所示，黑色部分为保守的氨基酸残基、灰色部分为保守性次之、方框表示c2h2锌脂蛋白结构域。从图2中可以看出，该锌指蛋白基因osctzfp8的c2h2型锌指结构域对应编码的蛋白相对其它植物例如水稻、玉米、高粱、拟南芥等高度保守。1.3利用多重序列比对结果，采用邻接法构建14个植物c2h2型锌脂蛋白基因的系统发生树。例如，利用megaversion4.1软件，用13个水稻锌指蛋白osctzfp8的同源蛋白，neighbor-joining方法构建系统发生树，bootstrap检验值为1000。其结果如图3所示，从图3中可以看出，水稻锌指蛋白基因osctzfp8编码的水稻锌指蛋白与功能未知的籼稻锌脂蛋白同源性最高，与单子叶植物中的锌指蛋白处于相同大分枝。用于构建系统发生树的14个植物锌指蛋白如下：水稻osctzfp8，水稻osl_28710(oryzasatival.,gi|34015350)，玉米zmzfp1(zeamays,gi|242032883)，拟南芥atzfp1(arabidopsisthaliana,gi|15240742)，大豆gszat10(glycinesoja,gi|734330588)，油菜zfp1(brassicanupus,gi|685279228)，水稻os07g0209600(oryzasativajaponica,gi|937925668)，水稻oszf1(oryzasativajaponica,gi|34393438)，水稻c2h2transcriptionfactor(oryzasativajaponica,gi|323388891),水稻osj_12692(oryzasativaindica,gi|125588016),玉米putativezincfingerprotein1(zeamays,gi|195640880)，高粱sbzfp1(sorghumbicolor,gi|670405684)，拟南芥c2h2andc2hczincfingerssuperfamilyprotein(arabidopsisthalianac2h2andc2hczincfingerssuperfamilyprotein,gi|15229643)，油菜brazf1(brassicarapa,gi|923538325)。1.4采用place(http://www.dna.affrc.go.jp.com/place/signalscan.html)进行启动子分析。通过分析结果发现，水稻锌指蛋白基因osctzfp8的起始密码子上游2000bp序列富含低温反应顺式作用元件(ltr)和脱落酸反应元件(abre)。中国国家水稻数据中心(http://www.ricedata.cn.org)和ricegenomeannotationprojectfundedbythensf(http://rice.plantbiology.msu.edu)的基因功能预测表明，该基因参与非生物胁迫应答调控。因此，可以看出，水稻锌指蛋白基因osctzfp8是一种参与水稻非生物胁迫应答调控的锌脂蛋白基因。实施例2非生物胁迫诱导下的水稻锌指蛋白基因osctzfp8的qrt-pcr分析2.1对培养两周的水稻幼苗进行低温(4℃)、nacl(200mm)和aba(5μm)的逆境胁迫处理，处理时间为分别为0、1、2、5、12、24h，取样后液氮速冻，采用minibestuniversalrna提取试剂盒(takara,japan)提取totalrna。2.2利用qrt-pcr，以elongationfactor-1α(eef1-α)作为内参，检测水稻锌指蛋白基因osctzfp8在不同非生物胁迫处理后的转录水平变化。例如，具体方法如下：取800ng的总rna，利用primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(takara，japan)反转录获得cdna。抽取1μlcdna，利用faststartuniversalsybrgreenmaster试剂盒(rox)(roche，germany)，在abi7500htinstrument(abi，usa)上进行qrt-pcr扩增，采用2–δδct相对定量方法进行表达量计算(livakandschmittgen，2001)。根据一些实施方式，引物序列见表1。表1实时定量引物序列引物名称引物序列序列标识符ctzfp8-qfacgagccaccggttcaagseqidno.3ctzfp8-qrattacgcggtgagaaggcgaseqidno.4eef1α-ftttcactcttggtgtgaagcagateef1α-rgacttccttcacgatttcatcgtaa实施例3水稻锌指蛋白基因osctzfp8逆境诱导表达分析通过qrt-pcr方法检测该基因在低温、aba和高盐胁迫下的表达水平变化。例如，将水稻幼苗进行低温(a)、aba(b)和高盐(c)处理后进行qrt-pcr检测。以elongationfactor1α(eef1α)作为内参基因，采用2–δδct方法计算相对表达量。其表达结果如图4所示，从图4中可以看出，在三种胁迫下水稻锌指蛋白基因osctzfp8在幼苗和根中的表达水平呈现不同程度的变化趋势。在低温和nacl处理下，幼苗中的水稻锌指蛋白基因osctzfp8转录水平明显上升，特别是在低温处理5h后转录水平提高6倍以上，然而在aba处理下转录水平略有提高。在根中，水稻锌指蛋白基因osctzfp8的表达量在胁迫处理和未处理间没有显著差异。以上结果表明，水稻锌指蛋白基因osctzfp8编码的水稻锌指蛋白在水稻对低温和高盐逆境的应答反应中发挥作用。实施例4水稻锌指蛋白基因osctzfp8的植物表达载体构建及过量表达转基因水稻4.1从水稻中分离克隆水稻锌指蛋白基因osctzfp8的全长cdna，即利用superscriptiiireversetranscriptase(invitrogen，carlsbad，usa)，将1μg总rna反转录成cdna，获得水稻锌指蛋白基因osctzfp8的全长cdna，再将其连接到含有ubi启动子和bar标记基因的p3300-ubi载体中构建pubi::osctzfp8载体，其过程如图5所示。4.2利用农杆菌介导法将植物表达载体导入到水稻中，通过愈伤组织诱导、继代、农杆菌侵染、basta抗性筛选、分化、根诱导和炼苗，最终获得46个独立转化事件。上述过程如图6所示，图6中，水稻遗传转化流程可分为愈伤组织的诱导(a)、继代培养(b)、农杆菌侵染后basta抗性筛选(c)、分化(d)、生根(e)、炼苗(f)等过程。4.3提取t0代转基因水稻基因组dna，pcr扩增除草剂抗性基因bar片段，并对t0代转基因植株的bar基因进行pcr检测，检测结果如图7所示，从图7中可以证明t0代转基因水稻携带bar抗性片段，阳性率为89％。需要说明的是图7中m为marker100bpladder；pc为pubi::osctzfp8载体dna；1为非转基因对照品种；2-21为t0代独立转化植株。实施例5水稻锌指蛋白基因osctzfp8的过量表达单拷贝插入纯合系筛选5.1利用southern杂交方法分析水稻锌指蛋白基因osctzfp8在水稻基因组中的整合性和拷贝数。具体方法如下：利用ctab法提取植物基因组dna(doyle和doyle，1987年)，取40μgdna用hindiii制性内切酶(takara,japan)进行酶切，酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶上分离后转移到hybondn+尼龙膜(amersham，uk)，用地高辛标记的(roche，usa)探针杂交，用x-光胶片化学发光自显影。探针序列包含ubi启动子的3’部分序列和水稻锌指蛋白基因osctzfp8的5’部分序列。探针序列为：ubi-sf，tttagccctgccttcatacg(seqidno.5)；zfp8-sr，attacgcggtgagaaggcga(seqidno.6)。southernblot分析结果如图8所示，图8中，m为dna分子量标准；nt为非转基因对照品种；oe#1～oe#8为过量表达株系；pc为pubi::osctzfp8载体dna。5.2采用rt-pcr方法，测定了水稻锌指蛋白基因osctzfp8在单拷贝插入株系的转录水平。结果如图9所示，6个单拷贝插入株系的水稻锌指蛋白基因osctzfp8转录水平明显高于非转基因对照品种，表明水稻锌指蛋白基因osctzfp8在转录水平上获得了过量表达、未发生基因沉默，转基因单拷贝插入纯合系可稳定保持遗传和表型性状的一致性，可加速世代过程、减少工作量。需要说明的是，图9中，nt为非转基因对照品种；oe#1～oe#6为单拷贝过量表达株系。5.3通过种子发芽试验(jin等，2015年)筛选单拷贝插入纯合系。具体方法如下：将消毒后的水稻种子播种在含有basta除草剂的1/2ms(30mg/lbasta)培养基上，在长日照、28℃条件下进行培养。发芽后第5天调查发芽率，以芽长1.5cm为正常发芽鉴定指标，basta抗性分离比符合孟德尔遗传规律的株系可被筛选为单拷贝插入纯合系。其结果如图10所示，通过basta抗性分离比鉴定，筛选出分离比符合孟德尔遗传规律的两个单拷贝插入纯合系即oe#1和oe#3，图10中，t1，t2为转基因不同世代；nt为非转基因对照品种；oe#1，oe#3为过量表达株系。实施例6水稻锌指蛋白基因osctzfp8过量表达转基因株系的耐冷性鉴定6.1利用水稻锌指蛋白基因osctzfp8过量表达株系和非转基因对照品种，在人工控制水温的耐冷性鉴定圃中进行了低温胁迫处理。水稻耐冷性鉴定在吉林省农业科学院耐冷鉴定圃进行。2017年4月25日播种，6月2日插秧，插秧规格为27×12.5cm。施肥水平为n-p-k:140-80-80kg/ha，按常规栽培技术进行全生育期管理。低温胁迫采用恒温深冷水灌溉法进行，冷水灌溉时期为从幼穗分化到孕穗期，水温为18.5℃恒温冷水、水深为15cm。耐冷性鉴定指标为花粉育性和种子结实率。6.2冷水灌溉处理结束后，采用碘-碘化钾花粉染色法检测花粉育性。利用1％的i2-ki溶液在花期测定花粉育性，方法参考shinjyo(1969)。从水稻颖花中挑取花药置于载玻片上轻轻捣碎，加一滴i2-ki溶液使花粉充分散开，盖上盖玻片，5min后在显微镜下进行观察。可育花粉被染色成蓝色、粒圆而饱满，不育花粉呈黄褐色、粒瘪缩。每片观察5个视野，并统计可育花粉的百分率。计算公式为：可育花粉的百分率＝(染色的有效花粉数/所有花粉数)×100％。在正常灌溉圃中，如图11所示，过量表达株系(oe#1-6，oe#3-2)和对照品种的花粉均染色成深蓝色。如图12所示，正常灌溉圃中，其花粉可育率达98％以上，而在冷水灌溉圃中，花粉可育率明显下降，然而过量表达株系的花粉可育花粉率显著高于对照品种，即oe#1-6和oe#3-2的花粉可育花粉率为76-81％，而对照品种的仅为41％。以上结果表明，冷水灌溉对花粉育性的影响比较大，然而水稻锌指蛋白基因osctzfp8的过量表达可提高冷胁迫下的花粉育性。6.3收获后考察种子结实率。每个株系取5株，每株取较大的5穗，脱粒后，调查每穗实粒数和瘪粒数，并计算结实率。计算公式为：种子结实率＝[实粒数/(实粒数+瘪粒数)]×100％。种子结实率是生殖期耐冷性评价的重要指标。在收获期，对低温胁迫处理或未经处理的水稻进行了种子结实率比较分析，即在收获期进行表型观察并拍照。结果如图13所示，在正常灌溉圃中，过量表达株系和对照品种的种子结实率(>92％)没有差异。然而，在冷水灌溉圃中，过量表达株系oe#1-6和oe#3-2的种子结实率显著高于对照品种(p<0.05)，即oe#1-6和oe#3-2的种子结实率分别为73.3％和72.5％，而对照品种的种子结实率仅为52.9％。以上结果表明，冷水灌溉对种子结实率的影响较大，然而水稻锌指蛋白基因osctzfp8的过量表达可提高冷胁迫下的种子结实率。综合上述结果，水稻锌指蛋白基因osctzfp8编码的水稻锌指蛋白可提高水稻生殖生长期的耐冷性，因此，可知该基因编码的水稻锌指蛋白参与水稻的耐冷性调控过程。实施例7取5株具有代表性的植株，测定单株分蘖数、穗长、千粒重、单株产量等农艺性状。其结果如表2所示。表2.水稻锌指蛋白基因osctzfp8过量表达株系的农艺性状**表示在冷水处理条件下，非转基因对照品种(wt)和过量表达株系(oe)之间在p<0.01上存在极显著差异。从表2的结果中可以看出，低温胁迫处理下水稻锌指蛋白基因osctzfp8过量表达株系的种子结实率、单株产量显著高于对照(p<0.01)，分蘖数、穗长等其它性状没有显著差异，表明水稻锌指蛋白基因osctzfp8过量表达株系在低温胁迫下可提高水稻产量。需要说明的是，在上述实施例中的受体品种为日本水稻品种kitaake，由吉林省农科院水稻所提供。该品种为日本培育的极早熟粳稻品种，在长春的生育期为110天，具有抗稻瘟病弱、耐冷性弱、粒型偏大、产量低等特点。综上所述，通过分离出的一种新型的锌指蛋白基因osctzfp8，并鉴定了该基因的生物学功能。通过分子鉴定和表型鉴定，发现锌指蛋白基因osctzfp8的过量表达可提高水稻的花粉育性和种子结实率，表明该基因在水稻的生殖生长期具有耐冷性。因此，可以可知锌指蛋白基因osctzfp8编码的水稻锌指蛋白参与水稻的耐冷性调控过程。在今后的研究中，可通过转录组测序和差异基因表达分析等方法，进一步阐明锌指蛋白基因osctzfp8编码的水稻锌指蛋白在抵御各种非生物胁迫过程中的分子机理，为水稻耐冷机理研究提供理论基础。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>吉林省农业科学院<120>水稻锌指蛋白及其编码基因和应用<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>224<212>prt<213>oryzasativa<400>1metalametalapheleuglyglnserargleutyraspglyileser151015trpasnserhisleusermetalapheleuvalproprovalserval202530alathrseralaproserleuserleuproproproleuproserser354045serleuserleuserleupheseralaserargprovalalaglyala505560lysalaalaargvalargargargargglnvalalaasnglygluthr65707580glualaleuhisalaalavalleulysgluglugluglnglnhisglu859095valgluglualaalavalvalthrserserseralathrserglyglu100105110gluglyglyhisleuproglnglytrpalalysarglysargserarg115120125argglnargsergluglugluasnleualaleucysleuleumetleu130135140alaleuglyglyhishisargvalglnalaproproproleuserala145150155160provalglyalagluphelyscysservalcysglyargserpheser165170175sertyrglnalaleuglyglyhislysthrserhisargphelysleu180185190prothrproproalaserprovalleualaproalasersergluval195200205glnserproleualapheserproargasnseralaalaalaargile210215220<210>2<211>675<212>dna<213>oryzasativa<400>2atggcgatggcatttttgggacaaagtcgtttgtacgatggcatttcttggaactcacac60ttgtcgatggcatttctggtcccacctgtcagcgtggccacgtcagcaccctctctctct120cttccccctcctctcccttcctcatctctctctctctcactcttctcggcaagccggccg180gtggctggggcgaaggccgccagggtgaggcggcggcggcaggtcgcgaatggcgagacg240gaagcgctccacgccgcggtgctcaaggaggaggagcagcagcacgaggtggaggaggcg300gcggtcgtgacgagcagcagcgccacaagcggggaggagggcgggcacctaccgcagggg360tgggcgaagcggaagaggtcgcgccgccagcgatcggaggaggagaacctcgcgctctgc420cttctcatgctcgccctcggcggccaccaccgcgtccaggcgccgcctcctctctcggcg480ccggtaggtgcggagttcaagtgctccgtctgcggcaggtccttcagctcctaccaggcg540ctcggcggccacaagacgagccaccggttcaagctgcctactccgcccgcatctcccgtc600ttggctcctgcctcctccgaggtccagagccccctcgccttctcaccgcgtaattcagca660gctgcacggatctga675<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3acgagccaccggttcaag18<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4attacgcggtgagaaggcga20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5tttagccctgccttcatacg20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6attacgcggtgagaaggcga20当前第1页12