富含胶原蛋白三肽的胶原蛋白水分解物以及胶原蛋白水分解物的用途的制作方法

本申请要求于2016年2月5日提交的大韩民国专利申请第10-2016-0014896号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

本发明涉及一种富含胶原蛋白三肽的胶原蛋白水分解物以及胶原蛋白水分解物的用途，具体涉及一种利用特殊的生成丰富的胶原蛋白三肽的胶原蛋白水分解酶制造的胶原蛋白水分解物以及包括该有效成分的促进生发以及改善皮肤状态的组合物。

背景技术：

胶原蛋白是一种由脯氨酸，羟基脯氨酸，甘氨酸，谷氨酸等约18种氨基酸构成的动物的纤维性蛋白质，在构成人体的5000多种蛋白质中占有30％的特殊构造的蛋白质。特别是在皮肤，骨骼，肌腱中存在大量的胶原蛋白，特别是皮肤中的真皮层的70％是由胶原蛋白构成，是皮肤的构成主成分。胶原蛋白是由各种氨基酸以多肽形态结合的三根扭曲形成的形状，分子量约300000左右，形状非常庞大。

低分子胶原蛋白是被胶原蛋白酶等分解形成的分子量约5000左右的低分子化产物，即胶原蛋白肽。该低分子胶原蛋白进入到人体后被人体内的蛋白质分解酶再次分解后最终形成氨基酸形态被人体吸收。与大部分蛋白质的分子量12000～70000相比较，胶原蛋白的分子量约300000左右，体积非常庞大，难以吸收。为了更容易在体内消化并吸收，低分子胶原蛋白经过萃取，分离，提炼过程后再次分解，最终转化为分子量在5000以下的肽形态。

胶原蛋白三肽是由3个氨基酸(甘氨酸-x-y)相连接形成的小型胶原蛋白(分子量一般在200～500)，因分子量小容易渗透于皮肤。如果4个以上的氨基酸相连接，由于分子结构过大而无法渗透于皮肤。胶原蛋白三肽透过皮肤后可立即结合，大幅缩短修复已损伤的胶原蛋白组织的时间。且，人体摄取后的体内吸收率比低分子胶原蛋白高，可以最大化胶原蛋白的活体功效。

胶原蛋白一般以牛，猪，鱼，鱿鱼等作为原料，通过酶的水分解后获取胶原蛋白三肽组合物。但是通过使用的蛋白质分解酶获取的组合物的三肽含量非常低，很难获取富含三肽的组合物。因此需要更有效的提炼富含三肽的胶原蛋白水分解物的方法。

毛发有着不同的生长周期，经过生长期(anagen)，退行期(catagen)，休止期(telogen)成长并脱落。这些以3～6年为一个周期反复，日平均正常脱落50～100根毛发。一般脱发症是指这些周期中的成长期中的毛发较少，退行期或者休止期中的毛发较多，使毛发非正常脱落。

脱发的原因有很多种说法，如雄激素作用过剩，皮脂分泌过剩，血液循环不良，过氧化物以及细菌等造成的头皮功能低下，遗传基因，老化，压力等。在脱发原因中，作为雄激素的一种的睾丸素(testosteron)是由5α-还原酶酶活性化的二氢睾酮(dihydrotestosterone；dht)，该dht与特定水溶体结合并诱导引发脱发的蛋白质造成脱发。此外，由于这些因素引发皮脂过剩，导致粉刺，脂溢性皮炎等伴有头皮炎症的脱发。

脱发症一般被认为是由于疾病，营养不足，老化，荷尔蒙不均衡导致的。对此做过很多研究，至今还没有发现导致脱发症的根本原因。也为了治疗脱发症进行各种努力，但目前只有2种治疗脱发的药物(非那雄胺(finasteride)以及米诺地尔(minoxidil))获得了美国fda(foodanddrugadministration)的官方认可。5α-还原酶抑制剂的非那雄胺被作为针对雄激素性秃发(androgeneticalopecia)的生发促进剂广泛使用。降血压剂(anti-hypertensiveagent)米诺地尔根据atp-敏感性k-频道的开放，可促进生发。但药物的效果并非是可以完全预测的也有着很大的局限性并且是暂时的。因此需要新的更有效的防脱生发治疗药品。即便目前对防脱发并促进生发有着显著疗效的米诺地尔(minoxidil)或者粘多糖生长素(trichosaccharide)等的药剂，也有着失效以及对人体的不稳定性，引发让皮肤过敏等副作用问题，因此急需开发出确保安全性以及稳定功效的组合物。

技术实现要素：

【需要解决的技术问题】

本发明的相关人员为制造富含胶原蛋白三肽的胶原蛋白水分解物努力的过程中发现，使用枯草芽孢杆菌制造的新的胶原蛋白水分解酶水分解胶原蛋白，可制造富含胶原蛋白三肽的胶原蛋白水分解物，通过这一水分解获得的组合物的促进生发以及改善皮肤状态比原有的胶原蛋白水分解物相比较有着显著的效果。

因此，本发明的目的在于提供一种富含胶原蛋白三肽的胶原蛋白水分解物，包括，(a)对鱼鳞与水的混合物进行热处理的阶段；(b)通过离心分离枯草芽孢杆菌菌株培养液后，浓缩离心分离所得的过滤液并利用离子交换色谱法精制的方法制造胶原蛋白分解酶的阶段；(c)将所述胶原蛋白分解酶投入所述(a)阶段的混合物中后，在25～45℃的环境中水分解5～15个小时的阶段；其中，胶原蛋白三肽占整体水分解物的20～70wt％。

本发明的目的在于提供一种包括胶原蛋白水分解物有效成分的防脱发或促进生发用的食品组合物。

本发明的目的在于提供一种包括胶原蛋白水分解物有效成分的防脱发或促进生发用的药用组合物。

本发明的目的在于提供一种包括胶原蛋白水分解物有效成分的防脱发或促进生发用的美容用组合物。

本发明的目的在于提供一种包括胶原蛋白水分解物有效成分的抗皱，改善皮肤弹性，抗老化或者皮肤保湿用的美容用组合物。

本发明的目的在于提供一种包括胶原蛋白水分解物有效成分的抗皱，改善皮肤弹性，抗老化或者皮肤保湿用的食品组合物。

本发明的目的在于提供一种用于制造防脱发或促进生发用治疗剂的胶原蛋白水分解物的用途。

本发明的目的在于提供一种将胶原蛋白水分解物有效量投入到需要该成分的个体中的防脱发或促进生发的方法。

本发明的目的在于提供一种用于制造抗皱，改善皮肤弹性，抗老化或者皮肤保湿用剂的胶原蛋白水分解物的用途。

本发明的目的在于提供一种将胶原蛋白水分解物有效量投入到需要该成分的个体中的抗皱，改善皮肤弹性，抗老化或者皮肤保湿方法。

【解决方案】

为达到所述目的，本发明提供一种富含胶原蛋白三肽的胶原蛋白水分解物，包括，(a)对鱼鳞与水的混合物进行热处理的阶段；(b)通过离心分离枯草芽孢杆菌菌株培养液后，浓缩离心分离所得的过滤液并利用离子交换色谱法精制的方法制造胶原蛋白分解酶的阶段；(c)将所述胶原蛋白分解酶投入所述(a)阶段的混合物中后，在25～45℃的环境中水分解5～15个小时的阶段；其中，胶原蛋白三肽占整体水分解物的20～70wt％。

本发明还提供了一种包括胶原蛋白水分解物有效成分的防脱发或促进生发用的食品组合物。

本发明还提供了一种包括胶原蛋白水分解物有效成分的防脱发或促进生发用的药用组合物。

本发明还提供了一种包括胶原蛋白水分解物有效成分的防脱发或促进生发用的美容用组合物。

本发明还提供了一种包括胶原蛋白水分解物有效成分的抗皱，改善皮肤弹性，抗老化或者皮肤保湿用的美容用组合物。

本发明还提供了一种包括胶原蛋白水分解物有效成分的抗皱，改善皮肤弹性，抗老化或者皮肤保湿用的食品组合物。

本发明还提供了一种用于制造防脱发或促进生发用治疗剂的胶原蛋白水分解物的用途。

本发明还提供了一种将胶原蛋白水分解物有效量投入到需要该成分的个体中的防脱发或促进生发的方法。

本发明还提供了一种用于制造抗皱，改善皮肤弹性，抗老化或者皮肤保湿用剂的胶原蛋白水分解物的用途。

本发明还提供了一种将胶原蛋白水分解物有效量投入到需要该成分的个体中的抗皱，改善皮肤弹性，抗老化或者皮肤保湿方法。

以下详细说明本发明。

本发明提供了一种胶原蛋白水分解物，包括，

(a)对鱼鳞与水的混合物进行热处理的阶段；

(b)通过离心分离枯草芽孢杆菌菌株培养液后，浓缩离心分离所得的过滤液并利用离子交换色谱法精制的方法制造胶原蛋白分解酶的阶段；

(c)将所述胶原蛋白分解酶投入所述(a)阶段的混合物中后，在25～45℃的环境中水分解5～15个小时的阶段；其中，胶原蛋白三肽占整体水分解物的20～70wt％。

所述(a)阶段为，将需要提取胶原蛋白的鱼鳞与水混合后高温处理的工序，是一项将鱼鳞中包括的胶原蛋白提取到水中的阶段。所述(a)阶段添加的鱼鳞与水的比率没有特殊要求，优选的鱼鳞与水的重量比为2比8。

所述(a)阶段中从鱼鳞中提取胶原蛋白的温度条件为80～120℃，优选的为85～110℃，但不局限于此温度，最佳的温度条件根据胶原蛋白的提取时间以及鱼鳞与水的比率产生变化。所述(a)阶段中的热处理时间根据温度条件产生变化，为1～10小时，优选为2～9小时，3～8小时为最佳，但不限于此。

所述(b)阶段为制备水分解胶原蛋白所需的水分解酶的阶段，与现有技术中的水分解胶原蛋白时使用的酶相比较，可制造胶原蛋白三肽的含量尤其高的水分解物，其为酶的制备阶段。本发明人员将所述(b)阶段的胶原蛋白水分解酶的制造方法，向大韩民国特许厅提交过申请专利申请(申请编号：kr10-2015-0124453号)，其全部内容通过引用并入本文。

本发明中的所述枯草芽孢杆菌为保藏编号kctc12866bp的菌株，但不限于此。

根据本发明的实施例，本发明人员为分离枯草芽孢杆菌菌株培养液中包括的胶原蛋白分解酶，在不同的条件下进行离子交换色谱法。所述(b)阶段的离子交换色谱法可利用阳离子交换色谱法，此时的氯化钠的浓度为0.1～0.3m时，目标酶的回收率为最佳。因此，所述(b)阶段的离子交换色谱法为阳离子交换色谱法时，优选的使用浓度为0.1～0.3m的氯化钠。

根据本发明的实施例，所述(b)阶段的离子交换色谱法可利用阴离子交换色谱法，此时的氯化钠的浓度为0.09～0.155m时，目标酶的回收率为最佳。因此，所述(b)阶段的离子交换色谱法为阴离子交换色谱法时，优选的使用浓度为0.09～0.155m的氯化钠。

本发明中的(c)阶段为，混合(a)阶段准备的胶原蛋白提取物与(b)阶段制造的胶原蛋白分解酶，进行胶原蛋白水分解的阶段。

本发明的实施例中，在(b)阶段制造的胶原蛋白分解酶在25～45℃的温度环境下保持最长时间的酶活性。温度条件超过45℃时，初期的酶活性可以暂时性的增加，但随着时间推移，活性的损失越来越大，无法充分体现胶原蛋白水分解的效果，相反的，温度低于25℃时，酶活性过低，存在无法水分解胶原蛋白等问题。

因此，所述(c)阶段的水分解温度条件优选为25～45℃，更优选为27～42℃，或30～40℃为最佳。

本发明可包括，将所述(c)阶段以后获取的胶原蛋白水分解物通过离心分离，离子交换色谱法，过滤等方法去除异物后浓缩的阶段。去除异物并浓缩的阶段可利用本领域通常使用的方法，没有特殊限制。

通过本发明中的所述制造方法制造的胶原蛋白水分解物的技术特征为，与使用其他水分解酶制造的胶原蛋白水分解物相比较，胶原蛋白三肽含量明显增多。

胶原蛋白三肽是由3个氨基酸(甘氨酸-x-y)相连接的小型胶原蛋白(分子量一般在200～500)，因分子量小容易渗透于皮肤。如果4个以上的氨基酸相连接，由于分子结构过大而无法渗透于皮肤。胶原蛋白三肽透过皮肤后可立即结合，大幅缩短修复已损伤的胶原蛋白组织的时间。且，摄取后的体内吸收率比低分子胶原蛋白高，可最大化胶原蛋白的活体功效。因此，胶原蛋白水分解物内的胶原蛋白三肽的含量越高，活体利用率越高，可最大化胶原蛋白的生理学上的活性。

根据本发明的实施例可以确认，本发明的所述胶原蛋白水分解物的的胶原蛋白三肽的含量占总水分解物的约53wt％。并且，使用其他水分解酶制造的胶原蛋白水分解物中基本不包括胶原蛋白三肽(参照实施例4以及比较例)。胶原蛋白本身很难被人体吸收，因此水分解为小型三肽形态为最佳。本发明的水分解物中含有的易被人体吸收的胶原蛋白三肽的含量与以往报告的胶原蛋白水分解物相比较明显很高的优点。

具体的，本发明中的所述胶原蛋白水分解物与全部水分解物相对比胶原蛋白三肽的含量是20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70wt％。而且，与全部水分解物相对比胶原蛋白三肽的含量在20～70wt％范围内时，并不限于上述数值。优选的为30～70wt％，40～70wt％，50～70wt％，30～60wt％，40～60wt％。50～60wt％为最佳，但不限于此。

本发明提供一种包括胶原蛋白水分解物有效成分的防脱发或促进生发用的药用组合物。

本说明书中的【脱发】为，毛发从头皮脱落的现象或毛发稀疏变细的状态；【防脱发】为，预防并抑制所述脱发现象；【促进生发】为，促进毛发的新生并且保护原有的毛发健康。

一般情况下【生发】在成长期完成，且从休止期转换为生长期以及延缓从生长期到退行期。毛发的周期主要分为成长期，退行期，休止期3个阶段。在成长期随着细胞的快速增殖，毛囊向皮肤深层生长并形成毛发。在退行期中细胞分裂中断明显的过渡期，此期间毛囊渐渐退行并停止生发。最后是休止期，退行的毛囊具体包括稠密的真皮乳头(dermalpapilla)细胞的胚芽(germ)。在休止期的新一轮成长期现象的开始是以所述胚芽中的细胞的快速增殖，真皮乳头的膨胀以及基底膜要素的合成引导。

因此，需要通过促进或者延长成长期，防止毛发的损失，即，防止脱发或引导毛发的再生，即，促进生发。根据本发明制造的组合物包括固化已有毛发并防止脱发的效果，加粗已有毛发等改善效果，以及生发效果中的一个或以上。

包括与原有的水分解物相比较，明显含有很高含量的胶原蛋白三肽的胶原蛋白水分解物有效成分的本发明组合物，可有效提高胶原蛋白的人体体内吸收以及硬皮吸收率，且吸收速度快，对防脱发以及促进生发效果显著。

具体的根据本发明的实施例，对本发明中的胶原蛋白水分解物以及利用本领域水分解胶原蛋白时一般使用的水分解酶制造的胶原蛋白水分解物的体内吸收度进行评价的结果，本发明中的胶原蛋白水分解物的auclast,cmax明显很高，tmax比较短，显示体内吸收度非常优秀。根据上述内容可以判断本发明中的胶原蛋白水分解物的胶原蛋白三肽的含量非常高，因此体内吸收较快吸收率非常优秀。

根据本发明的另一个实施例，含有本发明中的胶原蛋白水分解物有效成分的组合物有效促进退行期的脱毛动物标本的毛囊细胞的增殖，抑制退行期的进展，并且有着维持生长期的效果，对毛发的成长有着显著效果。此外，根据本发明的组合物的促进毛发生长的效果与作为阳性对照群使用的米若地尔(minoxidil)同样很优秀。

本发明的胶原蛋白水分解物中的胶原蛋白三肽含量非常高，体内所吸收的胶原蛋白衍生三肽的量比较多，效果也比较好。

本发明提供一种包括胶原蛋白水分解物有效成分的防脱发或促进生发用的食品组合物。

这些食品组合物除了包括作为有效成分的胶原蛋白水分解物外，与一般的食品组合物相同的包括各种香味剂或者天然碳水化合物等其他附加成分。所述天然碳水化合物包括单糖类，例如葡萄糖，果糖等；二糖类，例如麦芽糖，蔗糖等；以及多糖类，例如糊精，环糊精等的常用糖类以及木糖醇，山梨醇，赤藓糖醇等糖醇类。所述香味剂可有效利用天然香味剂(祝马丁)，甜叶菊提取物(如莱鲍迪苷a，甘草甜素等)以及合成香味剂(糖精，阿斯巴甜等)。

本发明的食品组合物的制造方式与所述药用组合物相同，可作为保健食品使用或者添加到各种食品中。可以添加本发明的组合物的食品例如饮料类，肉类，巧克力，食品类，饼干类，披萨，泡面，其他面类，口香糖类，糖类，冰淇淋类，酒精饮料类，混合维他命剂以及保健食品等。

且，所述食品组合物除了作为有效成分的胶原蛋白水分解物外，可以包括各种营养剂，维他命，矿物质(电解质)合成香味剂以及天然香味剂，着色剂以及增添剂(奶酪，巧克力等)，果胶酸，果胶酸盐，褐藻酸，褐藻酸盐有机酸，保护性固体增添剂，ph调节剂，稳定化剂，防腐剂，甘油，酒精，碳酸饮料用碳酸化剂等。此外，本发明中的组合物可以包括制造天然果汁以及果汁饮料以及蔬菜饮料的果肉等。

作为本发明的有效成分的胶原蛋白水分解物是一种天然物质，无毒性无副作用，可以以防脱发，或者促进生发为目的的长期服用。

本发明的所述食品组合物可以是包括胶原蛋白水分解物有效成分的防脱发或者促进生发的保健食品。

本发明中的保健食品以防脱发或者促进生发为目的，可以制造以及加工为锭剂，胶囊，粉末，颗粒，液体，药丸等形态。

本发明中的【保健食品】是根据保健食品相关法律条例第6727号，是使用对人体有益的功能性原料或成分进行制造或加工的食品，目的为调节人体的构造以及机能或生理学作用等作为保健用途获得有益效果的而摄取的。

本发明的保健食品可以包括常用的食品添加剂，在没有规定明确指定食品添加剂的适合与否的情况下，根据食品医药品安全厅认证的食品添加剂公开发布的总则以及一般实验法等该当成分相关的规格以及基准作为判断依据。

所述【食品添加剂公开发布】载入的成分例如，酮类，甘氨酸，柠檬酸钙，烟酸，肉桂酸等化学合成物；柿子橙色素，甘草提取物，纤维素结晶，高粱色素，胍尔豆胶等天然添加剂，l-谷氨酸盐制剂，面条碱剂，防腐剂，焦油色素制剂等混合制剂类。例如锭状的保健食品将本发明的有效成分胶原蛋白水分解物中混合赋形剂，结合剂，分裂剂以及其他添加物，并通过常用方法颗粒化后添加润滑剂压缩成型或直接压缩成型所述混合物。且根据需求在所述锭状的保健食品中添加香味剂。

胶囊状的保健食品中的硬质胶囊剂使用常用的硬质胶囊，并将本发明的有效成分胶原蛋白水分解物中混合赋形剂等添加剂的混合物填充制造。软质胶囊将胶原蛋白水分解物中混合赋形剂等添加剂的混合物用填充到凝胶等胶囊制剂中进行制造。根据需求所述软质胶囊可以包括甘油或者山梨醇等色素剂，着色剂，防腐剂等添加物。

丸状的保健食品通过已公开的制造方法，将本发明的有效成分胶原蛋白水分解物中混合赋形剂，结合剂，分裂剂以及其他添加物的混合物调制成形，并根据需求使用白糖或其他糖衣剂制造糖衣，或者使用淀粉，滑石等物质覆盖表面。

颗粒状的保健食品通过已公开的制造方法，将本发明的有效成分胶原蛋白水分解物中混合赋形剂，结合剂，分裂剂以及其他添加物的混合物调制成粒状，并根据需求，可以包括香味剂，调味剂等添加物。

所述保健食品可以是饮料类，肉类，巧克力，食品类，饼干类，披萨，泡面，其他面类，口香糖类，糖类，冰淇淋类，酒精饮料类，混合维他命剂以及保健食品等。

本发明提供一种包括胶原蛋白水分解物有效成分的防脱发或促进生发用的药用组合物。

根据本发明的药用组合物，可单独包括本发明中的胶原蛋白水分解物或者可以额外包括一个以上的药用载体，赋形剂或者稀释剂。

药用载体可另外包括口服载体或者非口服载体。口服载体可以包括乳糖，淀粉，纤维素导体，硬脂酸镁，硬脂酸等。且，非口服载体可以包括水，适当的油，生理食盐水，水溶性葡萄糖以及甘醇等，并且可以额外包括稳定剂以及防腐剂。适宜的稳定剂有亚硫酸氢钠，硫酸钠或者抗坏血酸等抗氧化剂。适宜的防腐剂有氯化苯扎氯铵，甲基或者对羟基苯甲酸丙酯以及氯丁醇等。此外可作为药用使用的载体参考以下文献记载内容(remington'spharmaceuticalsciences,19thed.,mackpublishingcompany,easton,pa,1995)。

本发明的药用组合物可使用任意投入方法投入给包括人类的哺乳动物。例如口服或者非口服投入。非口服投入方式有静脉内，肌肉内，动脉内，骨髓内，胸膜内，心脏内硬皮，皮下，腹腔内，鼻腔内，肠管，局部，舌下或者直肠内投入，但不限于此。优选的口服投入本发明的药用组合物。例如，将本发明的药用组合物调制为注射型制剂，并使用30量规的注射针轻轻穿刺皮肤的方法或者直接涂抹于皮肤表面的方法进行投入。

本发明的药用组合物如所述内容，可以根据投入途径，分口服用或者非口服用制剂进行成型。

用于口服用制剂的本发明的组合物可以是粉末，颗粒，锭剂，丸剂，糖衣锭剂，胶囊剂，液体剂，凝胶剂，糖浆剂，浆剂，悬浮液等，通过本领域公开的制造方法调制成型。例如，口服用剂将活性成分与固体赋形剂调配后粉碎，再添加适当的辅助剂后加工为颗粒混合物，获取锭剂或糖衣锭剂。适宜的赋形剂有包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇等的糖类；包括玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，土豆淀粉等的淀粉类；包括纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素等的纤维素类；包括凝胶，聚乙烯吡咯烷酮等的填充剂。进一步的本发明的药用组合物追加包括抗凝剂，润滑剂，香料，乳化剂以及防腐剂等。

用于口服用制剂的，以注射剂，乳霜剂，乳液剂，外用软膏剂，精油剂，保湿剂，凝胶剂，喷雾剂以及鼻腔吸入剂等形态，通过本领域公开的制造方法调制成型。这些形态全部记载于制药化学公开的处方文献(remington'spharmaceuticalscience,15thedition,1975.mackpublishingcompany,easton,pennsylvania18042,chapter87:blaug,seymour)中。

本发明的药用组合物作为皮肤外用药用组合物使用时，作为防脱发，促进生发以及改善头皮状态的皮肤外用剂，以乳霜，凝胶，补片，喷雾剂，软膏剂，硬膏剂，乳液剂，涂抹剂，糊剂或者泥敷剂的皮肤外用剂形态的药用组合物调制成型，但并不限于此。

本发明的药用组合物的总有效量作为单次投入量(singledose)投入患者，也可以作为多重投入量(multipledose)长期投入患者的分级治疗方案(fractionatedtreatmentprotocol)。本发明的药用组合物可以根据病情的轻重，调节有效成分的含量。优选的，根据本发明的糖蛋白划分，每日患者的体重每1kg别每日的整体用量为，约0.01ug～1,000mg，或者0.1μg～100mg为最佳。但是所述本发明的治疗剂候选物质的用量，需要考虑药用组合物的投入途径以及治疗次数，而且还要考虑患者的年龄，体重，健康状态，性别，症状的轻重，饮食习惯以及排泄状态等多种因素决定给患者的有效投入量。对于本领域技术人员而言，将所述本发明的药用组合物作为防脱发以及促进生发的药用制剂的特定用途，对有效投入量做出适当的调整。对于本发明的药用组合物的形状，投入途径以及投入方法可以灵活的做出调整。

本发明提供一种包括胶原蛋白水分解物有效成分的防脱发或促进生发用的美容用组合物。

根据本发明的美容用组合物，除了包括本发明中的胶原蛋白水分解物的有效成分外，还包括常用于美容用组合物的成分。例如包括抗氧化剂，稳定剂，增溶剂，维他命，颜料以及染料等的常用辅助剂以及载体。

而且，本发明的组合物中除了所述胶原蛋白水分解物以外，在不损坏胶原蛋白水分解物的防脱发以及促进生发的作用的情况下，可以与现有的防脱发剂以及生发剂混合使用。

而且，本发明的美容用组合物可以调制成该当行业通用的任意形状。例如，生发油，护发素，护发精华液，护发乳，护法营养乳，洗发水，护发冲洗剂，焗油膏，护发精油，护发霜，护发营养霜，护法补水乳，头皮按摩霜，发蜡，头发喷雾，发膜，营养发膜，洗发皂，洗发乳，洗发泡沫，发油，头发干燥剂，头发处理剂，染发剂，烫发剂，脱色剂，定型发胶，头发精华乳，美发剂，护发喷雾，头发保湿霜，发膏，发胶等都氧化的形态，但不限于此。

根据本发明的实施例，本发明的胶原蛋白水分解物对皮肤的抗皱，保湿等改善皮肤状态方面有着显著的效果。通过本发明的胶原蛋白水分解酶制造的胶原蛋白水分解物的皮肤状态改善效果明显比现行的胶原蛋白水分解酶制造的胶原蛋白水分解物的效果优秀。以此判断本发明中的胶原蛋白水分解物富含胶原蛋白三肽，对人体利用率较高，并且胶原蛋白的生理活性发挥的更好。

可以通过过具体实施例，明确的确认本发明中的胶原蛋白水分解物对皮肤状态的改善效果。

本发明提供一种包括所述胶原蛋白水分解物有效成分的抗皱，改善皮肤弹性，抗老化或者皮肤保湿用的美容用组合物。

此外本发明提供一种包括所述胶原蛋白水分解物有效成分的抗皱，改善皮肤弹性，抗老化或者皮肤保湿用的食品组合物。

前述的内容可全部适用于所述美容用组合物以及食品组合物。

本发明提供一种用于调制防脱发或促进生发用治疗剂的所述胶原蛋白水分解物的用途。

本发明提供一种将胶原蛋白水分解物有效量投入到需要该成分的个体中的防脱发或促进生发的方法。

本发明提供一种用于调制抗皱，改善皮肤弹性，抗老化或者皮肤保湿用剂的所述胶原蛋白水分解物的用途。

本发明提供一种将胶原蛋白水分解物有效量投入到需要该成分的个体中的抗皱，改善皮肤弹性，抗老化或者皮肤保湿方法。

本发明中的所述【有效量】为，投入到个体中时，促进生发以及改善，治疗，预防脱发等效果的量，且改善，治疗，预防皮肤皱纹，皮肤弹性，皮肤老化以及皮肤保湿效果的量；所述【个体】为动物，优选为哺乳动物，特别是包括人类的动物，也可以是从动物提取的细胞，组织，器官等。所述个体也可以是需要所述效果的患者。

【发明的技术效果】

本发明涉及一种富含胶原蛋白三肽的胶原蛋白水分解物以及胶原蛋白水分解物的用途，本发明的胶原蛋白水分解物与现有的胶原蛋白水分解物相比较，胶原蛋白三肽的含量明显增多，人体对其吸收率较好，可有效防止脱发症，促进生发，改善皱纹以及皮肤保湿等。

附图说明

图1为，利用通过本发明的实施例制造的胶原蛋白分解酶的阳离子离子树脂的分离提炼结果的图。a为，提炼的胶原蛋白分解酶的sds-page分析结果(m:蛋白质的大小标记,conc:浓缩样品,wash:洗净,e1～e5:洗脱样品1～5)。b为，根据aktaprimer中的缓冲浓度别变化的胶原蛋白分解酶提炼过程标识为最大值(箭头分别为洗脱样品的标识)。

图2为，利用通过本发明的实施例制造的胶原蛋白分解酶的阴离子离子树脂的分离提炼结果的图。a为，提炼的胶原蛋白分解酶的sds-page分析结果(m:蛋白质的大小标记,p1:表示peak1)。b为，根据aktaprimer中缓冲浓度别变化的胶原蛋白分解酶提炼过程标识为最大值(箭头分别为洗脱样品的标识)。

图3为，通过本发明的实施例制造的胶原蛋白分解酶的温度与酶活性结果示意图表。

图4为，通过本发明的实施例制造的胶原蛋白分解酶的根据时间与温度推移的酶活性变化结果示意图表。

图5为，通过本发明的实施例制造的胶原蛋白分解酶的ph与酶活性结果示意图表。

图6为，通过本发明的实施例制造的胶原蛋白分解酶与一般蛋白质分解酶的胶原蛋白三肽生产性对比的hplc数据(a:ctp标准物质,b:胶原蛋白分解酶bp,c:碱性蛋白酶alcalase2.4lfg,d:风味蛋白酶flavourzyme1000l,e:木瓜蛋白酶collupulinmg)。

图7为，利用通过本发明的实施例制造的胶原蛋白分解酶，生产富含胶原蛋白三肽的胶原蛋白水分解物的制造工序示意图。

图8为，利用通过本发明的实施例制造的胶原蛋白分解酶生产的水分解物中的胶原蛋白三肽(ctp)含量分析的hplc数据(a:ctp标准物质,b:胶原蛋白分解酶bp,c:碱性蛋白酶alcalase2.4lfg)。

图9为，向使用地塞米松(dexamethasone)诱发退行期脱毛的动物试验体投入试验物质时，影响毛囊的生长期以及退行期比率的效果评价结果图标((a)除毛第9日，(b)除毛第11日，(c)除毛第14日，(d)除毛第17日，anagen：成长期，catagen：退行期，nor：未使用，地塞米松处理，只除毛的正常群，control：使用地塞米松处理并除毛后投入溶剂的溶剂对照群，bp-ch：使用地塞米松处理并除毛后投入本发明的胶原蛋白水分解物的群，minox：使用地塞米松处理并除毛后投入米诺地尔的阳性对照群)。

图10为，使用地塞米松诱发退行期脱毛的动物试验体投入试验物质后，对试验动物的体毛生长带来的影响结果示意图。

图11为，通过组织染色体观察，使用地塞米松诱发退行期脱毛的动物试验体的皮肤组织毛囊生长的结果示意图(dex：地塞米松)。

图12为，通过uv照射诱发皱纹并投入各个物质后，使用硅胶以及环氧树脂的林模板观察的结果图(n：正常，c：对照，p：阳性对照，col17，col34：通过一般的胶原蛋白分解酶生产的胶原蛋白水分解物17mg/kg或者34mg/kg的投入群，ctp17，ctp34：本发明的胶原蛋白水分解物17mg/kg或者34mg/kg的投入群)。

图13为，试验就结束后，采集skh-1无毛老鼠的皮肤，进行马松三色染色法的结果示意图(n：正常，c：对照，p：阳性对照，col17，col34：通过一般的胶原蛋白分解酶生产的胶原蛋白水分解物17mg/kg或者34mg/kg的投入群，ctp17，ctp34：本发明的胶原蛋白水分解物17mg/kg或者34mg/kg的投入群)。

图14为，试验就结束后，采集skh-1无毛老鼠的皮肤，通过免疫印迹检测法确认组织内胶原蛋白1a(a)以及mmp-1(b)的蛋白质发现量的量化结果示意图(n：正常，c：对照，p：阳性对照，col17，col34：通过一般的胶原蛋白分解酶生产的胶原蛋白水分解物17mg/kg或者34mg/kg的投入群，ctp17，ctp34：本发明的胶原蛋白水分解物17mg/kg或者34mg/kg的投入群)。

图15为，试验的中间阶段第5周以及第10周时，确认老鼠皮肤的油脂(a)，水分(b)状态的结果示意图(n：正常，c：对照，p：阳性对照，l，col17，col34：通过一般的胶原蛋白分解酶生产的胶原蛋白水分解物17mg/kg或者34mg/kg的投入群，ctp17，ctp34：本发明的胶原蛋白水分解物17mg/kg或者34mg/kg的投入群)。

图16为，向诱发皮肤干燥的balb-c老鼠投入各个物质后，评价皮肤水分含量的结果图(n：正常，c：对照，p：阳性对照，col17：本发明的胶原蛋白水分解物17mg/kg，col34：通过一般的胶原蛋白分解酶生产的胶原蛋白水分解物34mg/kg的投入群)。

图17为，向诱发皮肤干燥的balb-c老鼠投入各个物质后，因皮肤瘙痒而挠痒的次数测量结果示意图(n：正常，c：对照，p：阳性对照，col17：本发明的胶原蛋白水分解物17mg/kg，col34：通过一般的胶原蛋白分解酶生产的胶原蛋白水分解物34mg/kg的投入群)。

图18为，向诱发皮肤干燥的balb-c老鼠投入各个物质，并在试验结束后采集各老鼠皮肤组织，通过免疫印迹检测法确认皮肤保湿因子蛋白质发现量的量化结果示意图(a：collagen1a，b：aqp3，c：has2，n：正常，c：对照，p：阳性对照，control)，col17：本发明的胶原蛋白水分解物17mg/kg，col34：通过一般的胶原蛋白分解酶生产的胶原蛋白水分解物34mg/kg的投入群)。

具体实施方式

以下详细说明本发明的实施例。

以下实施例仅为本发明的示例，本发明的内容并不局限于以下实施例。

<实施例1>

胶原蛋白水分解酶的制造

本发明中的胶原蛋白水分解物的制造方法以及通过所述方法制造的胶原蛋白水分解物相关内容参照韩国专利申请第10-2014-0158019号。

即，100ml的mtbmedium(yeastextract2.4％，tryptone1.2％，glycerol1％kh2po42.31％，h2hpo412.54％)中培养枯草芽孢杆菌菌株(保藏编号kctc12866bp)后6500rpm中离心分离15分钟。将过滤液转移到新的软管后使用30kdafilter浓缩至5倍。使用aktaprime设备，通过离子交换色谱法，提炼浓缩后的过滤液。

此时的提炼条件为，将a缓冲(50mmtris-hcl(ph7.5))作为binding缓冲使用，并利用b缓冲(50mmtris-hcl(ph7.5)，0.5mnacl)倾斜，且流速为5ml/min。提炼使用阳离子交换色谱法以及阴离子交换色谱法，离子树脂分别使用阳离子树脂spsepharoseresin(gehealthcare，new-jersey，usa)以及阴离子树脂qsepharosseresin(gehealthcar，new-jersey，usa)。

首先在阳离子交换色谱法中设0.5mnacl倾斜，并按照各个划分提炼蛋白质。如图1b所示，在sds-page确认，提炼图表中显示蛋白质最大值划分(e1～e5)的蛋白质提炼度，发现e1，e2中含有预测目标酶的蛋白质，特别是在e1中可以确认到含有大量的胶原蛋白分解酶(图1a的箭头表示)。

e1～e5的nacl浓度为e1：0.1～0.2m，e2：0.2～0.3m，e3：0.3～0.4m，e4：0.4～0.5m，e5：0.5m。由此可以得知，通过阳离子交换色谱法分离目标酶的nacl浓度为0.1～0.3m。优选的，在e1部分nacl浓度0.1～0.2m的情况下目标酶的回收率最佳。然后，通过阴离子交换色谱法提炼e1。

此时使用的缓冲为0.25m的nacl，并且与阳离子交换色谱法设相同的倾斜度。如图2b所示，提炼图表中的阴离子交换树脂为0.09～0.115m的nacl时，出现蛋白质的最大值(图2b的箭头表示)。

从sds-page上确认该当划分的提炼图，可以确认到大部分目标酶已提炼干净(图2a的p1)。由此可以得知，通过阴离子交换色谱法时nacl浓度为0.09～0.155m的情况下目标酶的回收率最佳。以下将提炼出的新胶原蛋白分解酶命名为bp。

<实施例2>

bp的酶反应条件试验

作为最佳温度试验，在20～70℃的温度进行酶反应，并测量效价。如图3所示，温度为0～55℃时，产生酶活性，特别是在50℃的环境下显示最高值的比活性(specificactivity)以及相对活性(relativeactivity)，从60℃温度开始活性急剧下降。

为适用于大量生产，对温度的稳定化进行了试验。温度调整为30℃，35℃，40℃以及50℃，并将各个温度别的样品从0～12小时的时间别抽样确认各自的残存活性。

如图4所示，温度越低酶呈现出更加持续稳定的状态，在35℃～40℃之间经过12小时后残留约59.3％的活性。由此可见，将胶原蛋白三肽的生产工序温度调整为35℃为最佳。

接下来确认最佳的ph值。将猪皮，凝胶，基质根据ph值别分别放入缓冲(50mmcitrate-na2hpo4(ph5.0～6.0)，50mmtris-hcl(ph6.0～9.0)，50mmna2co3-na2hco3(ph9.0～10.0))中融化后测定酶的活性并确认最佳的ph。bp在ph7.4的环境下呈现最高的活性，ph6～10的中性区环境下呈现较高的活性。但是，如图5所示，可以确认到偏酸性或偏碱性的情况下酶的活性减弱。

以下对使用所述胶原蛋白分解酶(bp)制造胶原蛋白三肽的过程进行说明。

<实施例3>

确认bp的胶原蛋白三肽生产效能

将预处理的鱼鳞放入搅拌机内设置的反应器中。按照20：80的重量比均匀地混合鱼鳞与水，并在的约90℃的温度热处理5小时后，准备4个样品。4个样品分别使用胶原蛋白分解酶(bp)(制造商：amicogen)，碱性蛋白酶2.4lfg(alcalase2.4lfg)(制造商：novozyme，经销商：viosys)，风味蛋白酶1(flavourzyme1)，000l(制造商：novozyme，经销商：viosys)，木瓜蛋白酶mg(collupulin)(制造商：novozyme，经销商：大钟商事)的酶，比较胶原蛋白三肽的生产效能。

各个酶的反应条件如下(温度，ph，酶使用量，反应时间)。

-bp：35℃，ph7.4，30unit/g(鱼鳞)，12小时

-alcalase2.4lfg：60℃，ph7.0，30unit/g(鱼鳞)，12小时

-flavourzyme1，000l：55℃，ph6.0，30unit/g(鱼鳞)，12小时

-collupulinmg：60℃，ph7.0，30unit/g(鱼鳞)，12小时

酶处理后，在80℃的温度环境下进行30分钟的热处理去活化，并且，对4种酶进行比较分析，确认bp的胶原蛋白三肽的生产效应。

使用hplc(gilson，吉尔森公司)分析以制造的胶原蛋白水分解物。在superdextmpeptide10/300gl柱，移动相(10mmtris-cl(ph7.4)，0.15mnacl，5mmcacl2)，流速：0.5ml/min的条件在分析胶原蛋白三肽(collagentripeptide，ctp)。ctp的标准物质采用由3种氨基酸构成的甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸(glycine-proline-hydroxyproline，gph)。

如图6所示，分析结果所示ctp标准物质在约55分钟左右形成最大值。比较4种酶的分解活性可以得知，使用bp进行水分解的胶原蛋白水分解物的最大值形成的比较晚，胶原蛋白已被低分子化。并且标准物质在同一时间段显现较大的最大值，可以得知ctp的含量很高。使用alcalase2.4lfg水分解的胶原蛋白水分解物与其他使用flavourzyme1000l或者collupuinmg水分解的胶原蛋白水分解物相比较低分子含量非常高，但ctp含量几乎没有。由此可以得知bp对胶原蛋白三肽的生产功效显著。

<实施例4>

使用bp的胶原蛋白水分解物的制造

为了制造含有胶原蛋白三肽的胶原蛋白水分解物，确立使用bp的制造方法。

将预处理的鱼鳞放入搅拌机内设置的反应器中。按照20：80的重量比均匀地混合鱼鳞与水，并在约90℃的温度热处理5小时。

在35℃的温度环境下，将热处理后的所述液体投入到10％naoh中，调整溶液的ph维持在7.4。调整后的所述液体中投入约30unit/g(鱼鳞)左右的bp，并在35℃的温度环境下反应12小时。酶处理后，在80℃的温度环境下进行30分钟的热处理去活化。使用超高速离心分离器去除酶处理后的胶原蛋白三肽液内的异物后，通过离子柱去除金属离子等异物。

使用真空降压浓缩机，将所述液体浓缩至brix35％后，通过活性炭净化，进行褪色去异味。将活性炭净化液精密过滤(膜过滤，membranefiltration)，对其进行除菌后，使用喷雾干燥器粉末化，并进行品质检测，经过包装阶段，制造出富含三肽的胶原蛋白水分解物(图7)

<比较例1>

使用一般水分解酶的胶原蛋白水分解物的制造

为了与使用新bp的制造工序相比较，利用一般的低分子胶原蛋白分解工序上使用的alcalase2.4lfg(制造商：novozyme，经销商：viosys)比较胶原蛋白三肽的生产效应。

将预处理的鱼鳞放入搅拌机内设置的反应器中。按照20：80的重量比均匀地混合鱼鳞与水，并在的约90℃的温度热处理5小时。

在35℃的温度环境下，将热处理后的所述液体投入到10％naoh中，调整溶液的ph维持在7.5。调整后的所述液体中投入约30unit/g(鱼鳞)左右的alcalase酶，并在35℃的温度环境下反应12小时。酶处理后，在80℃的温度环境下进行30分钟的热处理去活化。

使用超高速离心分离器去除酶处理后的胶原蛋白三肽液内的异物后，通过离子柱去除金属离子等异物。使用真空降压浓缩机，将所述液体浓缩至brix35％后，通过活性炭净化，进行褪色去异味。将活性炭净化液通过压滤机过滤或精密过滤(膜过滤，membranefiltration)，对其进行除菌后，使用喷雾干燥器粉末化，并进行品质检测后，对其进行胶原蛋白三肽(ctp)含量分析。

ctp含量分析与所述实施例2相同的方法进行。使用bp以及alcalase制造的最终调配前一阶段的胶原蛋白水分解物进行分析。

如图8所示，关于ctp含量可以得知，使用bp制造的胶原蛋白水分解物与ctp标准物质的最大值显现位置相同，但使用alcalase制造的胶原蛋白水分解物在同一位置上不显现最大值。

将使用bp与alcalase制造的胶原蛋白水分解物的ctp含量定量比较的结果，bp为53.1％，但alcalase为0％。由此可以得知，使用bp可以制造富含胶原蛋白三肽的胶原蛋白水分解物。

<实施例5>

使用bp的胶原蛋白水分解物与使用alcalase的胶原蛋白水分解物的吸收度比较

<5-1>动物试验方法

用醚麻醉雄性鼠，在其右侧颈动脉处用聚乙烯管插入后，利用输液背带将套管从后经处抽出，并调节其位置，使大鼠可以自由活动后缝合术口。对插管的鼠禁食12小时以上，仅供给饮用水。各群中分别选择6只，根据所述实施例4以及比较例1的胶原蛋白水分解物制造方法制造的使用bp的胶原蛋白水分解物(bp-ch)以及使用alcalase的胶原蛋白水分解物(alcalase-ch)分别以500mg/kg(5ml/kg)容量溶在蒸馏水中投入。投入后按时间段(15，30，45，60，90，120，180，240以及360分)从颈动脉采血后使用离心分离技术分离出血浆。分离出的血浆在-20℃的温度环境下冷冻保存，同时用lc-ms/ms分析血浆中的羟脯氨酸(hydroxyproline，hyp)的浓度并定量。

<5-2>lc-ms/ms分析法

样品预处理：50μl的血浆中添加内部标准液(gabapentin0.1μg/ml)混合后，再添加5％浓度的三氯乙酸50μl混合后，在13000rpm离心分离10分钟后获得过滤液。将过滤液稀释2倍后，取出2μl注入lc-ms/ms中进行分析

分析装置：agilent1260hplcsystem以及agilent6460triple-quadrupolemassspectrometer

柱：zorbaxsb-aq，particlesize1.8μ，2.0mm，i.d.×100mm，l.

柱温度：30℃

流动相：0.1％甲酸(a)乙腈(b)梯度洗脱

流速：0.25ml/min

注入量：2μl

<5-3>吸收度评价方法

制定针对各群的各个目标成分的血浆浓度-时间曲线后，求血浆浓度-时间曲线的总面积(auc；areaundertheplasmaconcentration-timecurve)，以此比较吸收度。auc通过线性梯形法(lineartrapezoidalmethod)求面积值。终端相中外插比较困难，因此不需要无限的求总auc，求最终采血点的6小时为止的auclast。最高血浆浓度(cmax)与最高血浆浓度到达时间(tmax)可直接在图表中读取。通过one-wayanova分析各群之间的auc，cmax，tmax数值，并通过duncan事后验证法研究统计上的显著性。

<5-4>胶原蛋白水分解物的吸收度试验结果

血中游离羟脯氨酸的acu值与cmax值，在bp-ch与alcalase-ch群之间的显著性差异。这是说明血液中的羟脯氨酸吸收率比较高。而且，投入bp-cp的群的tmax值与alcalase-ch群相比较快。由此可以得知，在摄取bp-ch后羟脯氨酸迅速被吸收，并且在血液中逗留的时间比较短，可以推断从从血液到组织的吸收时间加快(表1)。

通过本试验可以得知，胶原蛋白的特殊氨基酸羟脯氨酸的血中变化推移中可以确认，使用bp的胶原蛋白水分解物的吸收效应明显比使用alcalase的胶原蛋白水分解物高。

【表1】

使用bp的胶原蛋白水分解物以及使用alcalase的胶原蛋白水分解物的羟脯氨酸吸收度结果比较

缩写：

auclast，从时间为零到最后测量时间的血浆浓度时间曲线的总面积，6小时；cmax，血浆浓度峰值；tmax，达到cmax的时间；

^asd：标准偏差；

^b：ctp组与alcalase-cp组显着差异(p<0.05)。

^c：tmax的中值(范围)

<实施例6>

使用bp的胶原蛋白水分解物的防脱发以及促进生发效果

<6-1>试验动物食物制造

与实施例4的胶原蛋白水分解制造方法相同的方法制造胶原蛋白水分解物，bp酶的处理量以17unit/g处理，制造出ctp含量在28％左右的胶原蛋白水分解物，用于食用用途。

<6-2>试验动物以及退行期脱毛动物样本的确立

试验动物为c57bl/6鼠。由于该物种的毛囊中存在黑色素，并且根据黑色素的量皮肤色会产生变化，因此可以根据肤色判断毛发周期(生长期：黑色，退行期以及休止期：粉红色)。生后6～7周开始进入休止期。因这种特性，选择该动物为试验体，从dbl(忠北)引进35只生后6周的c57bl/6雌性鼠(17g-20g)。

试验群分别设定为使用地塞米松诱发退行期的地塞米松处理群，地塞米松处理以及使用bp制造的校验蛋白水分解物(bp-ch)投入群，溶剂对照群(control)以及阳性对照群(3％米诺地尔)处理群等。每个群有8只鼠构成。投入溶剂对照群以及胶原蛋白水分解物时测量体重，并以每日1次2，000mg/10ml/kg投入量连续口服投入，阳性对照群也每日涂抹米诺地尔。

使用动物用推毛器或者除毛剂，将生后7周的试验动物的背部毛发去除后迅速用水清洗。除毛第7日起每日投入一次测试样品以及米诺地尔连续投入10天。除毛第9日起连续5天每天在试验动物的背部涂抹1ml的0.1％地塞米松。实验动物在最后样品测试以及米诺地尔投入后的第2天用醚麻醉死亡。

<6-3>抑制脱毛退行期以及维持生长期效果确认

每日确认一次试验动物的临床症状以及死亡与否。为了肉眼确认生长期的引导效果，每周拍一次照片，为了观察抑制退行期的效果，每3日拍一次照片。拍摄后的照片利用imagej测定试验动物的整体除毛部位中的颜色由灰到黑色的变化比率，求生长期以及退行期的比率

以上试验的结果在以下表2，图9以及图10中示意。

【表2】

抑制退行期测试体的除毛部位中的退行期比率(％)

上述数值为平均值±se。

dunnet's测试的对照组的显著差异：**p＜0.01。

所述表的数值为除毛诱发退行期的部位的退行期进展比率。即，比率越高退行期进展率高，比率越低，就代表成功抑制退行期。所述表中标记的bp-ch为，摄取本发明的胶原蛋白水分解物的动物群。

所述表2，图10以及图11所示，除毛第9日的生长期以及退行期的比率显示，正常对照群以及试验物质投入群没有太大的区别，但米诺地尔涂抹群与只做地塞米松处理的溶剂对照群相比较，统计上显示成长期比率较高，退行期比率减少。±

除毛第11日，14日，17日开始溶剂对照群的背部呈粉红色，直到试验结束为止一直保持退行期。除毛第11日起试验物质投入群以及米诺地尔涂抹群的成长期比率在统计上有着明显的增加。

<6-3>组织检测

根据所述实施例<5-1>进行试验后，采集试验动物的除毛部位，观察毛囊状态。

即，将试验动物过度麻醉致死后，采集皮肤组织保管在10％浓度的中性福尔马林溶液中，用石蜡包埋后，以5μm厚度切片做成组织切片，并使用苏木精-伊红染色。

该当结果如图11所示。

如图11所示，进行地塞米松处理诱发退行期的溶剂对照群的表皮层变薄，未形成毛囊。地塞米松处理后摄取胶原蛋白水分解物的群(bp-ch)的表皮变厚，毛囊发达并成型。米诺地尔涂抹群也是可以确认表皮层变厚毛囊发达。

即，本发明的胶原蛋白水分解物在退行期脱毛状态下促进毛囊细胞的增殖并提高毛发的生长效果显著。

<实施例7>

使用bp的胶原蛋白水分解物的改善皱纹效果

本试验使用的skh-1无毛小鼠系的生后6周样品(雌性)是从samtakobiokorea(京畿道乌山市，韩国)领养后,在东南医化学研究院动物舍(动物设施登记证：第412号)进行为期一周的检疫以及驯化饲养的健康的动物，设定温度(22±3)℃，相对湿度(50±10)％，照明时间12小时(07：00～19：00)的饲养环境执行。

如表3所示，各个群别分10只，总共分7个群进行试验。除正常群外，其他皱纹诱发群均分段照射uvb10周。照射群分对照群以及阳性对照群(视黄酸2mg/kg，i.p.)，用量别分别投入使用一般胶原蛋白分解酶(alcalase)的胶原蛋白水分解物(col)以及本发明的胶原蛋白水分解物(ctp)17mg/kg，34mg/kg，口服投入14周。饲料为试验动物用固态饲料(samtakobiokorea，韩国)，饮用水没有限制。

【表3】

试验动物的构成

阳性对照群参考belindam方法(thejournalofinvestigativedermatology，112(3)；271-278，1999.)，以腹腔投入方式投入0.05％的维生素a酸。

紫外线照射装置采用笼内uvb发光太阳灯进行照射，光源为302nm，uvb强度为0.3mw/cm²的高度进行照射。

使用uv-radiometer测定紫外线照射量。将小鼠关入照射用笼子内后，以日间隔每周照射3次，共照射10周[0周：60mj/m²(1m.e.d)，1周：120mj/m²(2m.e.d)，2～3周：180mj/m²(3m.e.d)，4～5周：240mj/m²(4m.e.d)5～10周：240mj/m²(4m.e.d)]

<7-1>观察皮肤皱纹的形态

皮肤皱纹状态观察是在试验动物的5～14周时，进行轻微麻醉后，使用数码相机拍摄后背表面的照片后，用silflo(flexicodevelopmentsltd.tokyo，japan)硅橡胶印模材料制作背部皮肤皱纹副本，并使用显微镜拍摄后试验群别比较观察皱纹的状态。

肉眼观察皮肤皱纹的形态如图12所示。观察使用silflo制作的skh-1无毛小鼠的皮肤临摹板的结果，照射uvb的对照群(c群)的皱纹厚度比较厚，间隔比较宽，皱纹比较深，投入维生素a酸的p群与col17，34mg/kg投入群，与c群相比较皱纹较少或者皱纹厚度薄，线比较细(图12)。

由此可见，即便照射10周的uvb，本发明的胶原蛋白水分解物对skh-1无毛小鼠的表皮角质形成细胞起到有效的作用，被认为可以有效改善皮肤皱纹的形成以及预防。

<7-2>观察皮肤组织

将切取的皮肤组织放在室温的10％中性福尔马林溶液中固定24小时后，采用常规的方法进行水洗，脱水，透明化，渗透等过程后，使用石蜡包埋并以4μm厚度制作切片，并浸泡在bouin溶液一个晚上，并使用苏木精-伊红染色后，用光学显微镜观察真皮层内的胶原纤维(collagenfiber)。

而且，将切取的皮肤组织放在10％中性福尔马林溶液中固定后，水洗，并以60％～100％的酒精依次进行脱水处理，并使用石蜡包埋后制作成块。使用旋转式切片机将其以5μm厚度切片，并使用苏木精-伊红染色后，用光学显微镜(nikonco.，tokyo，japan)观察。

过量照射uvb时，表皮变得粗糙，正常的胶原质构造被破坏，导致胶原质的排列不规律，弹力纤维减少。

观察皮肤真皮层内的弹力纤维的变化以及损失量与形态的结果，可在对照群(c群)中确认到明显变形的弹力纤维，但是阳性对照群以及cop群，ctp群的弹力纤维经过14周的样本处理后与c群相比较明显变得稠密(图13)。

而且，观察真皮内的胶原蛋白量的结果，只照射uvb的c群的胶原纤维被破坏，排列不规律，胶原蛋白量也与正常群(n群)相比，处于减少倾向。但是，进行维生素a酸处理的p群，col群以及ctp群与c群相比较均呈现相对稠密且规律。特别是与col群相比较ctp群的胶原蛋白量与稠密程度更加良好(图13)。

<7-3>确认皮肤组织的胶原蛋白，胶原蛋白分解酶的蛋白质生成(collagen1a，mmp-1)

皮肤过量的暴露于紫外线环境下，会导致mmp-1过量生成，且活性氧过量产生，抗氧化作用受到破坏。而且角质形成细胞的作用下炎症性细胞因子的分泌增加，阻碍真皮内纤维亚细胞中的胶原蛋白合成，并促进分解酶的活性，形成过量的皱纹。为此本发明相关人员给照射uvb的skh-1无毛小鼠投入一般胶原蛋白分解酶(col群)与本发明的胶原蛋白水分解物(ctp群)后，通过免疫印迹确认到胶原蛋白合成因子collagen1a以及胶原蛋白分解酶mmp-1的蛋白质的生成。

为了分析蛋白质，在试验结束后，将采集的小鼠皮肤组织放入细胞裂解缓冲液每20mg别200μl后，使用高速搅拌机粉碎组织，并在800rpm，进行10秒的离心分离，只使用过滤液。经过24消失的冰孵化后，以14000rpm，4℃环境下进行20分钟的离心分离。利用bradfordassay2)定量蛋白质后，再利用蛋白质的sds-page(聚丙烯酰胺凝胶电泳)按照尺寸分类。利用半干式传送系统(bio-rad，usa)移动至pvdf(聚偏二氯乙烯polyvinylidenefluoride)膜后，使用含有5％脱脂牛奶的封闭液(5％脱脂牛奶，1×tbstbuffer)处理个小时。使用1×tbstbuffer10分钟后清洗3次，处理原发性抗体的collagen1a，mmp-1，mmp-13后，在4℃环境下反应一个晚上，并在此使用1×tbstbuffer10分钟后清洗3次。使用蛋白印迹检测试剂盒(abfrontier，westsavegold)与膜产生反应后，使用chemi-doc(bioradxrssystem)装备观察生成程度，并用gapdh调整后进行比较。

图14为其结果示意图。

照射uvb的c群的胶原蛋白合成因子collagen1a的生成量明显(p<0.05)减少，但投入样本的群中的collagen1a生成量均有所提升。特别是投入维生素a酸的p群以及col34，ctp34群众的p<0.05显著的增加(图14a)。

确认胶原蛋白分解酶mmp-1的蛋白质生成，发现照射uvb的c群中的mmp-1生成量增加。相反的，在ctp17，34群中的mmp-1生成量(p<0.05)明显减少，以此可以得知ctp17，34群比阳性对照群与col群显著地优秀(图14b)。

综合以上结果，过量的紫外线照射导致胶原蛋白分解酶增加，胶原蛋白合成酶的生成减少，采用本发明的胶原蛋白水分解物处理14周后，比一般胶原蛋白水分解物相比较，增加collagen1a的生成量，减少mmp-1的生成，有着显著地抗皱效果。

<7-4>确认皮肤组织的保湿

因紫外线照射导致皮肤组织损伤时，皮肤的油脂以及水分的含量随之减少。本实施例主要目的为，确认照射10周的紫外线的小鼠的皮肤组织内的油脂以及水分含量是否减少，且，本发明的胶原蛋白水分解物是否可以修复这些油脂以及水分的减少。

投入一般的胶原蛋白水分解物(col群)与本发明的胶原蛋白水分解物(ctp群)5周，10周后，使用皮肤的油脂以及水分含量测量装置corneometercm820(courage-hazake，koln，germany)进行油脂以及水分含量的测量。在恒温恒湿21.5±2℃，相对湿度40±5％的环境下，稳定30分钟后标识一定范围测量水分含量。

图15为其结果示意图。

如图15所示，因10周间的紫外线照射，可以确认对照(c)群的油脂以及水分含量与未照射紫外线的正常对照群(n)相比较明显的减少。此外，进行本发明胶原蛋白水分解物处理的动物群与正常对照群相比较，照射5周以及10周的均呈现较高的油脂以及水分含量，并且，此类效果随着胶原蛋白水分解物的含量增多，油脂以及水分含量也一同增加。特别是本发明的胶原蛋白水分解物(ctp群)中投入的皮肤保湿效果比一般胶原蛋白水分解物(col群)更加优秀(图15a，b)。

<实施例8>

利用bp的胶原蛋白水分解物的改善皮肤保湿效果

参考食药厅指导指南(保健食品试验法指导指南，美容相关功能性试验，2004.)，如表4内容，各个群别选择10只，总共分5个群进行试验。正常群(n群)使用balb-c小鼠，皮肤干燥样本挑选保湿试验中常用的增加表皮水分排放的nc/ngatnd小鼠。为诱发皮肤干燥状态，参考okawaetal.方法(dermatolsci.66(2)：136-43，2012.)，解剖前1周开始，将化妆棉(2×2cm)浸泡于以1：1比例混合的丙酮与乙醚溶液后放在背部15秒后，再用蒸馏水擦拭同一个部位30秒，为皮肤干燥提前做准备。

针对不诱发皮肤干燥的正常对照群(normal群，n群)以及，诱发皮肤干燥并且只投入溶剂的阴性对照群(control群，c群)，将0.9％的盐水口服4周，阳性对照群(p群)使用了得到食品医药安全处认证的，改善皮肤干燥以及改善皮肤水分含量的nag(n-乙酰氨基葡萄糖，n-acetylglucosamine)。摄取用量是n-acetylglucosamine17mg/kg口服投入。

此外，所述事实例7-4中的ctp17虽低，但比col34保湿效果更加良好。因此，根据实施例4制造的本发明的胶原蛋白水分解物17mg/kg(clt17群)，与根据所述实施例1制造的胶原蛋白水分解物34mg/kg(col34群)分别口服投入4周。饲料为试验动物用固态饲料(samtakobiokorea，韩国)，饮用水没有限制。

【表4】

试验动物群

<8-1>测量皮肤水分含量

健康的表皮的角质层含有15～20％的水分，表皮的水分含量低于10％时皮肤呈现干燥，没有光泽以及弹性，导致皱纹增加。皮肤的柔和水润的触感都要靠表皮角质层中的水分维持。

角质层的水分含量是由皮上生成的脂质，作为吸附剂的皮脂膜以及角质层内存在的水溶性成分的自然保湿因子(nmf：naturalmoisturefactor)决定，表皮的水分蒸发与神经酰胺以及自然保湿因子的含量变化有密切关系。

为确认将本发明的胶原蛋白水分解物17mg/kg(ctp17)或者已经公开的胶原蛋白分解酶进行制造的胶原蛋白水分解物34mg/kg(col34)投入4周后，对皮肤保湿带来的影响以及特性，在试验届时一周前，使用皮肤水分含量的测定仪corneometercm820(courage-hazake，koln，germany)对诱发皮肤干燥的部位进行测量。在恒温恒湿21.5±2℃，相对湿度40±5％的环境下，稳定30分钟后标识一定范围测量水分含量。

图16为其结果示意图。

虽维持了正常群(n群)的balb-c小鼠的表皮层的水分含量，但是诱发皮肤干燥的对照群(c群)与正常对照群相比较水分含量明显减少。此外，阳性对照群，ctp17，col34群均有增加皮肤水分含量的功效，其中ctp17的效果最佳。

ctp投入17mg/kg的情况下比col34mg/kg有着更优秀的皮肤保湿效果，由此可见，胶原蛋白三肽含量较高的本发明的胶原蛋白水分解物的保湿效果要比已经公开的胶原蛋白水分解物效果显著。

<8-2>皮肤干燥引发的瘙痒症的效果

皮肤是承载各种各样的免疫物质的载体，并且对外部物质最先反映的部分。皮肤壁受伤，导致硬表皮的水分流失加大的同时减少水分结合力，最终导致皮肤干燥，发生皮肤瘙痒。为此，给动物样本投入各种物质后，对缓和皮肤瘙痒的效果进行评价。

抓痒行为(scratchingbehavior)观察试验动物在10分钟内抓痒的状态。相同群的试验体放在同一个笼子内，确认抓痒次数。持续2秒以上的连续动作持续n秒时的次数计数为n次，2秒以内的短暂的动作计数为1次。

图17为其结果示意图。

诱发皮肤干燥后，确认10分钟以内抓痒次数的结果显示，引发干燥症的对照l群(c群)中的p<0.05注意级别的抓痒次数增加的同时，分别投入样本的群中的抓痒次数明显减少(p<0.05)。

一方面，皮肤干燥导致的瘙痒症的缓和效果在ctp17中最优秀，除col34外，比阳性对照群更为优秀。

<8-3>皮肤保湿因子的蛋白质恢复效果(collagen1a，aqp3，has2)

为分析蛋白质，皮肤组织中添加细胞裂解液后，使用高速搅拌机破坏组织，并使用离心机过滤后提取过滤液。通过bradfordassay对蛋白质定量后，执行聚丙烯酰胺凝胶电泳sds-page(polyacrylamidegelelectrophoresis)。利用半干式传送系统(bio-rad，usa)移动至pvdf(polyvinylidenefluoride)membrane后，使用chemi-doc(bioradxrssystem)装备观察生成程度，并用gapdh调整后进行比较。

(i)胶原蛋白是参与细胞的形状，分化移动以及蛋白质的合成等功能调节，以及伤口恢复中至关重要的构成成分。引发皮肤干燥症，导致皮肤内的胶原蛋白含量减少，最终导致皱纹的形成等对皮肤产生不好的影响。

(ii)水通道蛋白-3(aqp3)对皮肤的水化(hydration)起到很重要的作用。皮肤干燥，aqp3的生成就会减少，影响到表皮水分流失(tewl)。细胞膜中存在的水通道蛋白(aqp3)增加，就会保存皮肤中的水分，最终成为抗老化因子(j.lipidres.46：2706，2005.)。因此确认细胞膜中存在的水通道蛋白-3(aqp3)，是确认皮肤的水分程度的重要因素之一(biologyofthecell.97(7)：479-4862005.)。

(iii)葡聚糖(hyaluronicacid，ha)是细胞外的连接组织中存在的高分子糖胺聚糖，起到阻挡水分蒸发的保护墙作用。随着年龄的增长，作水分保护壁作用的葡聚糖含量急剧下降。外部环境要素中紫外线对皮肤维持葡聚糖起反效果。因这种内在或外在原因的葡聚糖含量的减少会导致皮肤减少檀香，皮肤粗糙，皱纹等的原因。因此维持葡聚糖含量是保持皮肤水分以及维持童颜皮肤的秘诀。葡聚糖是持续通过透明质酸合成酶(has)合成。因此has的遗传因子增加，皮肤内的葡聚糖的含量也会上升，对皮肤的保湿，皮肤弹性，皱纹等问题有着积极地效应。

为此，本发明的相关人员通过蛋白免疫印迹法，对本发明的胶原蛋白水分解物因皮肤干燥而导致皮肤保湿因子减少的影响进行评价。

图18为其结果示意图。

如图18所示，随着诱发皮肤干燥，可以确认collagen1a，aqp3以及has的含量比正常对照群明显减少。另一方面，阳性对照群，ctp17以及col34群与对照群(c群)相比较，各个蛋白质量的大部分已恢复。其中ctp17有着显著的皮肤保湿因子恢复效果，投入量仅为col34的一半，但比col34的效果更加优秀。

即，富含胶原蛋白的本发明的胶原蛋白水分解物的体内吸收率非常良好，即便投入量少，也能达到显著效果。

由此可见本发明的胶原蛋白水分解物有着优秀的抗皱效果以及皮肤保湿效果，可达到有效抗皮肤老化以及改善皮肤弹性的效果。

【产业上的利用可能性】

本发明涉及一种富含胶原蛋白三肽的胶原蛋白水分解物以及胶原蛋白水分解物的用途，本发明的胶原蛋白水分解物与现有的胶原蛋白水分解物相比较，胶原蛋白三肽的含量明显增多，人体对其吸收率较好，可有效防止脱发症，促进生发，改善皱纹以及皮肤保湿等，有着较高的产业利用可能性。